Atividade da membrana celular bacteriana do PHMB
Se a atividade antibacteriana do PHMB (Fig. 1a) for devida à ruptura da membrana, como amplamente relatado6,7,8,9,10, seria de esperar que permeabilizasse as barreiras bacterianas celulares em concentrações inibitórias de crescimento e subcrescimento. Para testar este modelo, primeiro estabelecemos as concentrações inibitórias mínimas (MIC) e as propriedades de matar o tempo para PHMB contra Escherichia coli (cepas K-12 e MG1655) e Salmonella enterica serovar Typhimurium (cepa LT2). Como relatado anteriormente2,4, PHMB mostrou propriedades potentes inibitórias de crescimento e propriedades cideais (Tabela Suplementar 2 e Fig. 1 Suplementar). Além disso, após o tratamento, examinamos as células usando microscopia leve. Inesperadamente, as concentrações inibitórias de crescimento de PHMB não lisava as células, conforme monitorado por microscopia de campo brilhante. Para avaliar os danos da barreira celular que poderiam ser invisíveis à microscopia, as culturas de E. coli K-12 foram cultivadas até a fase de meio-log, tratadas com PHMB na presença da sonda de integridade da membrana fluorescente SYTOX®Green e depois monitoradas usando fluorimetria. Esta sonda é útil como indicador de danos na membrana; porque normalmente é excluída de bactérias intactas e sua produção quântica de fluorescência aumenta com a ligação do DNA. Portanto, espera-se que as bactérias intactas exibam baixa fluorescência e que a fluorescência aumente após o dano da barreira celular16. Como previsto, as culturas de E. coli recém-criadas exibem grandes aumentos na fluorescência após tratamento com o conhecido polimixina B ou tratamento térmico (Fig. 1b). Inesperadamente, o tratamento com PHMB resultou em níveis comparativamente mais baixos de fluorescência. Mais notoriamente, concentrações mais altas de PHMB resultaram em fluorescência em níveis de fundo. Estas observações não são compatíveis com a ruptura da membrana como o principal mecanismo antibacteriano e por isso levantaram mais dúvidas sobre o modelo estabelecido.
PHMB efeitos sobre a permeabilidade da membrana celular e entrada em bactérias.
(a) Estrutura do poli-hexametilenoglicol biguanida (PHMB; CAS# 27083-27-8); nomes químicos alternativos: poli-hexanida; nomes comerciais de exemplo: Vantocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. Consulte a Tabela Complementar 1 para mais detalhes. O PHMB é composto por unidades de biguanidina básica de repetição ligadas por cadeias de hidrocarbonetos hexametileno, fornecendo uma estrutura catiónica e anfíptica com elevada capacidade de ligação ao hidrogénio, interacções electrostáticas e hidrofóbicas. As preparações de PHMB normalmente compreendem polímeros de comprimento misto com grupos terminais amina, guanidina e cianoguanidina (por exemplo, média n = 13,8, 3.035 g/mol44) (b) Efeitos do PHMB, calor, polimixina B (controle positivo) e triclosan (controle negativo) na permeabilidade celular ao SYTOX®Green. Os valores MIC para os antibacterianos testados são indicados com setas verticais codificadas por cores, no topo. (c) Microscopia de fluorescência da entrada de PHMB-FITC em diversas bactérias. PHMB-FITC (2 μg/mL) foi adicionado às culturas bacterianas e as células foram contra-manchadas com DAPI. (d) Imagem confocal mostrando a localização de PHMB-FITC (verde) em B. megaterium; as bactérias foram contra-manchadas com a sonda localizadora de membrana aglutinina de gérmen de trigo (WGA) conjugada ao Alexa Fluor-555 (vermelho) e visualizada como células vivas (topo) e fixas (fundo); Bar = 5 μm. (e) Análise do perfil de intensidade de fluorescência da localização celular da fluorescência PHMB-FITC e WGA (a linha branca indicava a secção transversal utilizada para a análise). A linha verde indica os níveis de FITC e posição (principalmente dentro da célula). A linha vermelha indica os níveis de WGA e posição (principalmente dentro da membrana).
PHMB entra nas bactérias
Se o alvo primário do PHMB não é uma barreira bacteriana celular, ou não é exclusivamente celular, então provavelmente age internamente e isto exigiria a entrada de células. Para testar a entrada bacteriana, sintetizamos um conjugado de PHMB-FITC (Suplemento Fig. 2a,b) e avaliamos a absorção em bactérias Gram-positivas (Staphylococcus aureus), Gram-negativas (Escherichia coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium) e ácidas (Mycobacterium smegmatis) usando microscopia e citometria de fluxo (Fig. 1c, Suplemento Fig. 3). Foi observada uma forte fluorescência verde associada às células em todas as espécies testadas (Fig. 1c). Para examinar a localização celular mais detalhadamente, a bactéria de grande tamanho Bacillus megaterium foi tratada com PHMB-FITC, contra-manchada com membrana localizadora de aglutinina de gérmen de trigo (WGA-red) e examinada por microscopia de fluorescência (Fig. 1d). A entrada celular foi observada em células vivas e fixas e uma análise do perfil de intensidade de fluorescência mostra que PHMB-FITC localizado dentro do citoplasma, sem acúmulo na barreira celular (Fig. 1e).
A observação de que o PHMB entra nas células a baixas concentrações de microgramas/mL sugere que ele pode entrar nas células vivas. Para investigar se a absorção de PHMB pelas bactérias requer metabolismo energético, as culturas de E. coli de fase média do log foram incubadas a 37 °C, ou a 4 °C durante 2 horas para reduzir os níveis celulares de ATP. Subsequentemente, as células foram tratadas com PHMB-FITC (0-6 μg/ml) e posteriormente incubadas em gelo durante 2 horas. A fluorescência de PHMB-FITC associada às células foi quantificada por fluorimetria (Suplemento Fig. 3b). As células mantidas a 4 °C apresentaram uma absorção reduzida de PHMB-FITC em relação às células incubadas a 37 °C, consistente com um processo de absorção de células dependentes de energia. Também foram observadas bactérias verdes fluorescentes e móveis em vários pontos de tempo durante o tratamento com PHMB (Suplemento Fig. 3). Como a motilidade bacteriana é dependente da energia17 , as evidências indicam que o PHMB-FITC entra nas células metabolicamente ativas. Portanto, PHMB entra em diversas bactérias e a entrada foi observada em células móveis.
PHMB prende a divisão celular e condensa cromossomos bacterianos
Ao examinar E. coli por microscopia, observamos que as células tratadas com PHMB frequentemente apresentavam uma morfologia alongada, que pode ser característica da inibição da divisão celular (Fig. 2a). Para medir os efeitos do PHMB no alongamento celular, titulamos PHMB em culturas em crescimento de E. coli cepa SS996 (vide infra) e medimos o comprimento celular. Em concentrações inibitórias de crescimento, mais de 80% das células alongadas (Fig. 2b; Tabela Complementar 2). Também observamos que a E. coli tratada com concentrações inibitórias de PHMB ou PHMB-FITC seguidas pela coloração DAPI mostrou focos fluorescentes azuis próximos ao centro da célula (Fig. 2c). Estas estruturas assemelhavam-se a nucleóides18. Para facilitar a visualização dos focos de DNA, geramos populações filamentosas/multinucleadas de E. coli inibindo a divisão celular através do silenciamento do RNA do gene de divisão celular essencial ftsZ19. O silenciamento do RNA foi selecionado para esta experiência porque permite a repressão específica e controlável da tradução de transcrições de genes essenciais20. Genes que são essenciais para o crescimento não podem ser eliminados por métodos de ruptura do genoma, pois isso resultaria em linhagens não viáveis. Na ausência de PHMB, as células filamentosas apresentaram coloração uniforme de DAPI, enquanto as células tratadas com PHMB apresentaram “cordões de contas” azuis (Fig. 2d). Da mesma forma, na bactéria Gram-positiva de grande tamanho B. megaterium observamos focos manchados com DAPI após o tratamento com PHMB (Fig. 2e). Estes resultados, tanto nas espécies Gram-negativas quanto nas Gram-positivas, mostram que a exposição a PHMB leva a cromossomos condensados dentro da bactéria.
Elongamento celular mediado por PHMB e condensação cromossômica em bactérias.
(a) E. coli foi tratada com PHMB por 90 minutos e examinada por microscopia de campo brilhante. (b) Comprimento médio das células em função da concentração de PHMB. MIC (seta) é indicada. (c) Padrão de distribuição cromossômica nas células após tratamento com PHMB-FITC. Culturas de E. coli, estirpe K-12 foram tratadas com PHMB-FITC, contra-mancha com DAPI e examinadas usando microscopia de fluorescência. Os cromossomos aparecem como focos condensados manchados com DAPI; mais aparentes na imagem ampliada. (d) Padrão de distribuição cromossômica em E. coli filamentosa/multinucleada após exposição com PHMB. O silenciamento do RNA da expressão ftsZ foi usado para parar a divisão celular e as células foram então não tratadas ou tratadas com PHMB, coradas com DAPI e examinadas por microscopia de fluorescência. (e) Padrão de distribuição cromossômica em células de B. megatério que não foram tratadas ou tratadas com PHMB, coradas com DAPI e WGA-red e examinadas por microscopia de fluorescência.
Os efeitos antibacterianos mediados por PHMB são independentes das vias de resposta ao estresse
Elongamento de células e condensação cromossômica são morfologias características que são frequentemente associadas com a resposta bacteriana SOS21,22. Portanto, consideramos que estes efeitos podem envolver esta resposta. Entretanto, no caso de efeitos mediados por PHMB, uma resposta de SOS pareceu improvável. Primeiro, a resposta SOS é tipicamente associada a danos no DNA e não há evidências de efeitos genotóxicos ou epigenéticos mediados por PHMB23. Segundo, a condensação observada após o silenciamento de ftsZ e tratamento com PHMB ocorreu em uma cepa recA- (TOP10), que é uma resposta SOS mutante. No entanto, mecanismos antimicrobianos são notoriamente difíceis de decifrar e podem envolver múltiplos mecanismos. Portanto, nós decidimos avaliar o possível envolvimento de uma resposta SOS e outras vias de resposta ao estresse usando uma estirpe SOS e um painel de mutantes da via de resposta ao estresse E. coli.
Para testar se os efeitos mediados por PHMB no alongamento celular e condensação cromossômica são alterados por mutações na via de resposta SOS, nós avaliamos respostas morfológicas em três estirpes mutantes de E. coli. A estirpe SS996 é capaz de iniciar uma resposta SOS, mas devido a uma mutação sulB a resposta não leva à inibição da divisão celular. Isto porque o SS996 tem um alelo mutante de ftsZ (sulB103), cujo produto é insensível à ação do inibidor de divisão celular SulA24 induzido por SOS. O Strain JW2669 não produz RecA funcional e, portanto, é deficiente em SOS. A deformação AB2474 tem uma mutação no repressor LexA que a torna inutilizável pelo RecA e, portanto, não é capaz de induzir uma resposta SOS (detalhes adicionais da deformação são fornecidos na Fig. 3 e na Tabela de Informações Suplementares 3). Culturas em fase de registo médio foram tratadas com PHMB, coloração DAPI e observadas sob um microscópio de fluorescência. Como observado com E. coli K-12, as cepas mutantes apresentaram morfologias alongadas e cromossomos condensados após o tratamento com PHMB (Fig. 3a). Portanto, a divisão celular mediada por PHMB e os efeitos da estrutura cromossômica ocorrem independentemente de uma resposta programada de SOS.
Efeitos do PHMB nas respostas bacterianas de SOS.
(a) Condensação cromossómica nas estirpes E. coli SS996 (sulB103; FtsZ mutante insensível a SulA), JW2669 (recA-; knock-out do recA) e AB2474 (lexA1, mutação que impede a indução da resposta SOS) após tratamento com PHMB durante 2 horas. As células foram coradas com DAPI para revelar o DNA. (b) Expressão do relator de resposta SOS, quantificada por fluorimetria. A estirpe E. coli SS996 da SOS, portadora de uma fusão cromossómica sulfAp-gfp, não foi tratada ou tratada com PHMB, mitomicina C, um indutor de SOS conhecido, ou triclosan, que não induz uma resposta de SOS. Os valores de MIC contra SS996 foram PHMB, 0,75 μg/mL; triclosan, 2 μg/mL; mitomicina C, 0,06 μg/mL e estes valores foram usados para calcular a %MIC.
Para medir mais diretamente se o PHMB induz uma resposta SOS, usamos a estirpe E. coli SS996, que é uma estirpe repórter que contém um sistema de resposta/reportagem de SOS cromossômico sulAp-gfp24,25. Se uma resposta SOS é causada por PHMB, então a exposição a PHMB deve induzir a expressão de GFP nesta estirpe. As culturas de SS996 foram tratadas com PHMB durante 18 horas e depois foi medida a fluorescência verde. A mitomicina C, que danifica o DNA, foi incluída como controle positivo e o triclosan, que inibe a biossíntese de ácidos graxos, foi incluído como controle negativo. Como esperado, a mitomicina C induziu um grande aumento na expressão de GFP e o triclosan não induziu a expressão de GFP. Ao contrário da mitomicina C, PHMB não induziu a expressão de GFP, indicando que PHMB não induz uma resposta de SOS (Fig. 3b).
A seguir testamos se as cepas com respostas de SOS defeituosas ou desreguladas diferem em suscetibilidade a PHMB. Para testar os efeitos mediados por recA na susceptibilidade, usamos uma estirpe de E. coli que não tem recA (JW2669) e uma estirpe que exagera a recA após a adição do indutor IPTG (ASKA JW2669) e determinamos os valores MIC. Nem a eliminação nem a sobreexpressão induzida de recA alterou a susceptibilidade ao PHMB (Tabela de Informações Suplementares 3, linhas sombreadas em cinza escuro). Em contraste, a tensão recA- era 2 vezes mais suscetível à resposta SOS induzindo a droga ácido nalidíxico e a superexpressão recA reduziu a suscetibilidade ao ácido nalidíxico em 8 vezes. Para testar os efeitos mediados por lexA na susceptibilidade do PHMB, usamos a cepa lexA1(Ind-) AB2474, que é incapaz de induzir uma resposta SOS. Em relação ao pai, o AB2474 era 1 vez mais susceptível ao PHMB e 1 vez menos susceptível ao ácido nalidíxico (Tabela suplementar 3, linhas sombreadas em cinza claro). Portanto, nenhum dos mutantes de resposta SOS testados mostrou alterações na suscetibilidade ao PHMB que indicam envolvimento de uma resposta SOS.
Finalmente, consideramos se outras vias de resposta de estresse (não SOS) afetam a suscetibilidade ao PHMB. Testamos uma série de mutantes conhecidos de E. coli de resposta ao estresse em paralelo com seus pais quanto à suscetibilidade a PHMB. Nenhum dos mutantes apresentou alterações nos valores de MIC que sugerem um envolvimento funcional de qualquer uma das vias de resposta ao estresse (Tabela Suplementar 3). Portanto, os efeitos antibacterianos do PHMB ocorrem independentemente do painel de mecanismos de resposta ao estresse testados.
PHMB condensa cromossomos bacterianos in vitro
Se o PHMB condensa cromossomos bacterianos dentro das células, isso pode ocorrer através de efeitos diretos ou indiretos no DNA. Suspeitámos de efeitos directos, porque se demonstrou que o PHMB se liga a fragmentos de ADN in vitro15. Decidimos examinar as propriedades de ligação ao ADN do PHMB usando ADN isolado de E. coli cromossómico. As interações PHMB-DNA foram primeiramente examinadas usando um ensaio de mobilidade eletroforética (EMSA) e um ensaio de exclusão de corante. O PHMB foi misturado com DNA cromossômico isolado de E. coli K-12 e as misturas foram fracionadas em gel de agarose/TBE, seguido de coloração de DNA com brometo de etídeo. PHMB:misturas de ADN com proporções wt:wt de ≥0.5 apresentava mobilidade eletroforética claramente retardada, como indicado pela retenção de DNA no poço (Fig. 4a). Resultados semelhantes foram obtidos para o PHMB-FITC. A mobilidade e retenção retardada nos poços é consistente com as interações estáveis entre PHMB e DNA. Além disso, os ensaios EMSA indicaram fluorescência reduzida de brometo de etídio na presença de PHMB ou PHMB-FITC, sugerindo que o brometo de etídio foi impedido de se ligar ao DNA devido à formação de complexos de PHMB:DNA. Esta observação foi investigada mais detalhadamente usando o corante de ligação de DNA SYTOX®Green em um ensaio de exclusão do corante. Na ausência do PHMB, SYTOX®Green ligou E. coli DNA isolado, como indicado por um grande aumento na fluorescência, em relação à adição do corante sozinho. No entanto, a adição prévia de PHMB reduziu a fluorescência >80% (Fig. 4b). Portanto, o PHMB forma complexos com DNA bacteriano de uma forma que retarda a mobilidade eletroforética e mascara o acesso do DNA aos ligandos de DNA. Os resultados de cada uma destas experiências indicam que o PHMB se liga directamente ao ADN.
PHMB liga-se ao ADN cromossómico bacteriano in vitro.
(a) PHMB ou PHMB-FITC foi misturado com ADN cromossómico isolado da estirpe K-12 de E. coli e as amostras foram analisadas pela EMSA. Os padrões de mobilidade in-gel retardada indicam a ligação do ADN por PHMB. (b) A exclusão mediada por PHMB da ligação SYTOX®Green ao ADN cromossómico isolado de E. coli, onde a redução da fluorescência indica a ligação do ADN por PHMB. (c) Espectroscopia de dicrómio circular de misturas de PHMB e DNA cromossômico de E. coli isolado. (d) Lote de elipticidade em função da relação PHMB:DNA.
Para aprender mais sobre como a ligação de PHMB ao DNA tem impacto na estrutura do DNA cromossômico, usamos métodos biofísicos e microscopia. Combinações de PHMB e DNA cromossômico isolado de E. coli foram examinadas por espectroscopia circular de dicrómio (CD). O PHMB sozinho não mostrou um espectro CD característico, enquanto o DNA cromossômico isolado mostrou um espectro típico de DNA com uma elipticidade máxima positiva em torno de 260 nm, uma cruz negativa em torno de 252 nm e um canal negativo em torno de 245 nm. Isto nos permitiu avaliar as mudanças no espectro CD do DNA após a adição do PHMB. Misturas de PHMB e DNA mostraram elipticidade reduzida a 260 nm, indicativo de mudanças estruturais no DNA após a ligação do PHMB (Fig. 4c,d). Além disso, a dispersão dinâmica da luz (DLS) revelou que a ligação do PHMB ao ADN resulta na formação de nanopartículas de aproximadamente 50-60 nm, com um baixo índice de polidispersidade (Fig. 4a Suplementar). Finalmente, a microscopia electrónica de transmissão (TEM) e a microscopia de fluorescência também indicaram que a ligação do PHMB ao ADN resulta na formação de nanopartículas (Suplemento Fig. 4b,c). Portanto, estes resultados confirmam relatórios anteriores que o PHMB liga ADN26 e revela que o PHMB liga ADN cromossómico bacteriano isolado e pode condensar cromossomas numa população de nanopartículas com baixa polidispersão.
Os efeitos antibacterianos do PHMB são suprimidos por um dsDNA ligand
Os nossos resultados para os efeitos do PHMB sobre as bactérias não podem ser reconciliados com o modelo de ruptura de membrana para o mecanismo de acção antibacteriana primária do PHMB. Ao invés disso propomos um novo modelo, onde o PHMB entra nas bactérias e depois condensa os cromossomos, como ilustrado na Fig. 5a. Se correto, o novo modelo também prevê interações funcionais entre PHMB e outros ligandos de DNA e esta idéia nos forneceu uma maneira de testar o modelo. Em resumo, se este modelo estivesse correto, seria esperado que pequenos ligandos de DNA de peso molecular suprimissem a potência antibacteriana do PHMB ao competir por locais de ligação de DNA dentro dos cromossomos. Para testar esta possibilidade, combinações de PHMB e Hoechst 33258 foram usadas em ensaios de susceptibilidade de crescimento. O Hoechst 33258 é um ligante de DNA que se liga preferencialmente ao sulco menor de sequências ricas em AT27 e é permeável às células, tornando-o uma escolha adequada para esta experiência de competição.
Modelo para o mecanismo de ação antibacteriana do PHMB e supressão da inibição do crescimento.
(a) Mecanismo de ação antibacteriana proposto para o PHMB. (b) Interações de inibição de crescimento em pares entre PHMB e Hoechst 33258 e ligantes não ligantes de controle negativo (triclosan e trimetoprim) em diversas espécies bacterianas. (c) Relação entre o genoma bacteriano AT-conteúdo e as interacções antibacterianas com PHMB. Plot de interações de inibição de crescimento e conteúdo de DNA AT em diversas espécies. Os valores de interação são índices de concentração inibitória fracional (FICI) entre PHMB e Hoechst 33258 ou ligantes não ligantes de controle negativo (trimetoprim e triclosan). (d) Bacillus megaterium growth inhibition by PHMB e suppression by combination with the DNA ligand Hoechst 33258 (blue lines). Ver Tabela Suplementar 4 para lista de espécies e valores de inibição.
Interacções com o Drug foram calculadas como valores do índice de concentração inibitória fracional (FICI) usando um painel de espécies bacterianas divergentes. Os valores FICI para PHMB:Hoechst foram significativamente maiores do que para PHMB combinados com qualquer um de dois antibacterianos não-DNA ligante (Fig. 5b). Os valores FICI para PHMB:Hoechst também mostram uma correlação positiva com o conteúdo do cromossoma AT (Fig. 5c). Em outras palavras, os efeitos antimicrobianos de PHMB dependem do acesso ao DNA dentro das células. Em B. megaterium, os efeitos das combinações de PHMB:Hoechst foram impressionantes, onde a inibição de crescimento por PHMB foi suprimida usando concentrações sub-inibitórias de Hoeschst 33258 (Fig. 5d). Portanto, a pequena molécula de DNA ligando Hoechst 33258 resgatou bactérias de concentrações inibitórias de PHMB.
Estas interações medicamentosas em pares revelam que os efeitos antibacterianos de PHMB ocorrem principalmente através da mira de DNA em bactérias. Consistente com o perfil de mudança de permeabilidade celular observado para PHMB (Fig. 1b); os resultados também indicam competição entre PHMB e um ligante de DNA para locais de ligação de DNA dentro das células. Portanto, os resultados de experimentos separados envolvendo dois ligandos de DNA conhecidos são consistentes com nosso novo modelo para a atividade do PHMB.
PHMB entra nas células de mamíferos mas é excluído dos núcleos
O modelo predominante para a atividade do PHMB sustenta que o PHMB mata bactérias através de danos na membrana bacteriana e o polímero não interage com as membranas das células de mamíferos (veja acima). Entretanto, dadas as propriedades inesperadas de entrada de células bacterianas do PHMB e nossas observações recentes de que o PHMB entra em macrófagos de cultura28 e queratinócitos29 , decidimos avaliar diretamente sua capacidade de entrar em um painel de células de mamíferos. O PHMB-FITC foi adicionado a várias linhas de células de mamíferos e os fibroblastos primários e sua captação foi avaliada por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. Observou-se clara absorção em todos os tipos celulares testados (Fig. 6a,b). Além disso, estas condições não levaram à ruptura da integridade da membrana celular dos mamíferos (Suplemento Fig. 5a). Uma inspeção cuidadosa das imagens microscópicas revela que o PHMB-FITC estava contido dentro das vesículas e excluído dos núcleos (Fig. 6a). Se for verdade que os endossomos prendem PHMB, então a liberação para o citoplasma deve remover o PHMB-FITC e levar a um aumento da fluorescência. Isto porque a fluorescência FITC é extinguida a pH baixo e o pH endossômico tardio é <630, enquanto o pH citoplasmático é 7,4. Observamos que a adição de cloroquina, um agente osmolítico/bufferante31, aumentou a fluorescência das células tratadas com PHMB-FITC (Fig. 6c), consistente com o aprisionamento de polímeros dentro dos endossomos. Portanto, o PHMB entra eficientemente nas células de mamíferos, mas é aprisionado dentro dos endossomos, o que parece restringir a entrada nos núcleos.
PHMB entrada nas células de mamíferos.
(a) Os fibroblastos primários foram tratados com PHMB-FITC (3,5 μg/mL), contra corados com Hoechst 33258 e observados por microscopia de fluorescência. (b) Análise por citometria de fluxo de um painel de células de mamíferos tratadas com PHMB-FITC. Inset: um exemplo representativo de um histograma de citometria de fluxo de populações de células de HeLa não tratadas (população roxa) ou tratadas com PHMB-FITC (0,4 μg/mL) (população verde). (c) As células de HeLa foram tratadas com PHMB-FITC (3,5 μg/mL) e cloroquina (0-20 μM) durante 2 horas. Os efeitos da cloroquina na fluorescência foram medidos por citometria de fluxo, usando intensidade de fluorescência média geométrica (unidades arbitrárias (U.A.), escala log).