O ensaio clonogênico tem sido utilizado em inúmeros estudos para quantificar o crescimento clonogênico e sua revogação por estímulos citotóxicos, incluindo radiação, medicamentos quimioterápicos e/ou agentes de alvo molecular, in vitro. O procedimento padrão atual para determinar as frações de sobrevivência é baseado na suposição de que o crescimento clonogênico em culturas de células tratadas pode ser normalizado para os controles não tratados através da divisão por uma linha celular específica e constante PE.
Aqui mostramos, entretanto, que isto não é universalmente aplicável. Em contraste, nossos dados indicam claramente que a correlação entre o número de células semeadas em um prato de cultura e o número de colônias obtidas está longe de ser sempre linear. Para linhas celulares com comportamento cooperativo, a análise baseada em PE dos dados de sobrevivência clonogênica produziu resultados com grandes a enormes erros intrínsecos ao ensaio. Mesmo que apenas pratos de cultura com número razoável de colônias (C = 5 a 100) fossem utilizados para análise, as frações de sobrevivência clonogênica em uma determinada dose diferiam em muito mais de uma ordem de magnitude para linhas de células com alto grau de cooperação celular. É importante notar que praticamente qualquer curva de sobrevivência (íngreme ou plana, moderada ou fortemente curva, linear, quadrática ou irregular) pode ser derivada desta faixa de resultados calculados a partir do conjunto de dados dado dado – uma observação que pode ser de particular importância para os biólogos da radiação.
Junto, nossos dados mostram que a análise convencional baseada em PE dos dados de sobrevivência clonogênica tem um desempenho inapropriado assim que a cooperação celular ocorre sob uma ou mais condições dentro de um experimento, e os resultados de sobrevivência extraídos irão variar dentro de uma faixa insatisfatoriamente grande. Especificamente, os resultados serão fortemente enviesados se apenas uma ou poucas densidades celulares similares forem cromadas. Esta prática gera erros intrínsecos ao ensaio que são uma consequência directa das densidades de células escolhidas e, portanto, não são passíveis de análise de erros estatísticos. Para linhas celulares em crescimento cooperativo, nossas observações podem explicar parcialmente os dados de resposta ao tratamento relatados entre ensaios, entre pesquisadores e incongruências interlaboratoriais. Uma meta-análise dos dados do ensaio de formação de colónias A549 suporta ainda mais esta hipótese: Num painel de 156 estudos diferentes, Nuryadi et al. relataram valores de SF4 para esta linha celular específica variando de 5 a 90% com uma variação interquartil de SF4 superior a 25% . Embora diversos outros parâmetros possam certamente influenciar os dados de resposta ao tratamento, concluímos a partir de nossos dados que a cooperação celular é um fator importante que explica a variabilidade interestudos. Uma vez que mesmo pequenas diferenças nas frações de sobrevivência clonogênica podem encorajar os pesquisadores a postular e estudar novas hipóteses científicas que podem eventualmente ser baseadas em falsa precisão, desenvolvemos uma nova abordagem de análise que é menos suscetível ao impacto da densidade celular – especialmente, mas não apenas para linhas celulares em crescimento cooperativo. Este método é responsável por relações não lineares entre o número de células semeadas e o número de colônias obtidas através da pontuação de pratos de cultura com uma ampla gama de números de células semeadas para todas as condições de tratamento.
Matematicamente, nossa abordagem utiliza a regressão de potência e interpolação de números combinados de colônias em diferentes doses de irradiação. Aplicado ao mesmo conjunto de dados que foi usado para cálculos baseados em PE, forneceu resultados claramente mais estáveis, independentes da densidade celular. Os leitores atentos podem ter notado que os cálculos da fração de sobrevivência realizados de acordo com o método aqui apresentado, baseiam-se apenas no coeficiente a e no expoente b, conforme extraído pela regressão de potência. Embora isto, obviamente, compense os efeitos da cooperação celular, tem outra qualidade de erro que deriva da imprecisão da regressão e que não pode ser comparada quantitativamente com a qualidade de erro semelhante nos cálculos da fração de sobrevivência baseada no PE. Assim, este erro deve ser minimizado, assegurando um desenho experimental cuidadoso com um número suficiente de réplicas independentes. Além disso, os cálculos da fração de sobrevivência só devem ser feitos com resultados de regressão de potência de desempenho adequado, como indicado pelo coeficiente de regressão R.
Nossa abordagem matemática basicamente substitui os cálculos de sobrevivência clonogênica baseados em PE pela pergunta:
Quantas vezes mais células precisam ser semeadas em um prato de cultura tratado para produzir o mesmo número de colônias como em um prato de controle?
O expoente b é de particular importância a este respeito. Ele indica se a correlação entre o número de células semeadas e o número de colônias contadas é linear (b ≈ 1) ou não. Valores altos de b, obtidos para células BT20 e SKLU1, indicam que o crescimento celular in vitro é desacelerado (ou totalmente anulado) se o volume de meio de cultura por célula for aumentado – seja pelo uso de grandes volumes de ensaio ou pela redução do número de células semeadas. Deve ser enfatizado que os valores b não são de forma alguma específicos para uma determinada linha celular, mas sim uma consequência do meio de cultura celular escolhido, de vários parâmetros de incubação do ensaio e do procedimento experimental, incluindo praticamente qualquer aspecto que possa afectar o crescimento clonal de células que se encontram numa situação de stress extremo quando tratadas como células únicas, tais como a formulação do meio, a suplementação com nutrientes e factores de crescimento, os métodos utilizados para a separação de células, os artigos de plástico, etc. Por exemplo, o uso de meios condicionados de células quase influentes de BT20 atenuou fortemente o comportamento cooperativo de células únicas de BT20, enquanto que este procedimento não teve impacto no crescimento clonogênico de células MDA-MB231 não cooperativas. Além disso, o tempo de duplicação das células cooperativas de BT20 dependia tanto do tempo de incubação do ensaio como da densidade celular no poço, dando assim uma explicação biológica óbvia para frações de sobrevivência clonogênica imprecisas obtidas por cálculos baseados em PE: A taxa de crescimento de um cluster de células em proliferação pode ser simplesmente demasiado lenta para atingir o limiar de 50 células por colónia dentro do tempo de incubação do ensaio. Assim, a aparente “não-clonalidade” de um aglomerado de, por exemplo, 35 células em proliferação lenta no momento da paragem é apenas uma consequência inevitável do tempo de incubação do ensaio que é – pelo menos até certo ponto – escolhido arbitrariamente. Neste contexto, analisámos adicionalmente o impacto do tempo de incubação nas fracções de sobrevivência clonogénica obtidas e observámos que é insuficiente para determinar o ponto de tempo de paragem apenas através da inspecção dos pratos de controlo, tal como sugerido por outros: o término prematuro do período de incubação pode levar a fracções de sobrevivência excessivamente baixas em pratos com tratamento mais agressivo, onde a reparação dos danos antes da continuação do crescimento celular requer tempo adicional.
Importante, nossos dados estão totalmente de acordo com os achados seminais dos pesquisadores pioneiros em cultura celular nos anos 1940 e 1950 e simplesmente refletem um fenômeno que estava sob investigação extensiva naquela época. Puck e colegas foram os primeiros a publicar uma curva de sobrevivência de células únicas irradiadas em 1956. No entanto, o maior desafio científico para esta conquista fundamental foi um problema não resolvido na época da cultura de células de mamíferos: As linhas celulares pararam de crescer in vitro, assim que as células foram tratadas a baixa densidade. Uma tentativa de superar este problema foi feita em 1948 por Sanford et al., que conseguiram crescer colônias de fibroblastos derivados de células únicas em pequenos capilares onde a difusão de fatores derivados de células para o meio foi fortemente reduzida, permitindo assim um estímulo de crescimento autocrítico suficiente. Eles identificaram a importância de pré-condicionar o meio de cultura por células cultivadas e concluíram que um meio de cultura celular suficiente para permitir o crescimento infinito da cultura celular de alta densidade está de fato “longe de ser ideal para o crescimento de uma única célula”. Em linha com isto, Earle et al. descreveram que o revestimento do respectivo tipo celular em densidade muito baixa resultou na morte celular, e este trabalho formou a base para a primeira publicação sobre crescimento clonogênico de células de mamíferos in vitro por Puck e Marcus, em 1955. Inspirados pela necessidade de um meio de cultura condicionado para facilitar o crescimento de células únicas, utilizaram um sistema de co-cultura de células únicas HeLa e uma camada de células de alimentação altamente irradiadas do mesmo tipo. De acordo com os estudos anteriores, eles concluíram que a inibição do crescimento de células únicas em grandes volumes de ensaio era devido à “perda de um fator difusível e de curta duração”. Em publicações posteriores, como aquela com a primeira curva de sobrevivência de células de mamíferos irradiadas, Puck e colegas frequentemente omitiram o uso de camadas de comedouros, uma vez que tinham desenvolvido técnicas avançadas de cultivo que permitiam o crescimento de células únicas com 100% de PE sem suplementação do fator de crescimento por células de comedouros. Eles afirmaram que protocolos cuidadosos de lavagem e tripsinização eram essenciais a este respeito e cunharam o termo “ação cooperativa” para descrever que as células em um prato de cultura podem diferir em relação ao genótipo, bem como em relação ao estado fisiológico. Os nossos resultados recapitulam estas observações: Dentro de um painel de 50 linhas de células cancerígenas, observamos que o crescimento subótimo de células únicas em meios de cultura modernos e padronizados suplementados com FCS ainda é um fenômeno muito comum, como pode ser deduzido do achado de que mais da metade das linhas de células apresentavam comportamento de crescimento cooperativo. Assim, se forem encontrados EM subótimas para uma determinada linha celular, o ensaio clonogênico provavelmente detectará simultaneamente tanto a influência do tratamento de interesse quanto o impacto da cooperação celular. Não foi no escopo deste estudo identificar fatores específicos de suporte ao crescimento que possam afetar o PE das linhas de células analisadas. No entanto, colocamos a hipótese de que condições subótimas de crescimento para células individuais de uma determinada linha celular podem resultar de parâmetros muito diferentes, tais como baixas concentrações de factores de crescimento clássicos e/ou hormonas (por exemplo, factor de crescimento epidérmico ou estrogénio) mas também vários metabolitos de baixo e alto peso molecular para os quais pelo menos uma fracção de células individuais apresenta auxotrofia. Além disso, a suplementação nutritiva de células isoladas num prato de cultura será provavelmente influenciada pelos parâmetros físico-químicos do meio circundante e dos artigos de plástico, incluindo o grau de ligação proteica dos respectivos factores auxotróficos ou a sua adsorção à superfície do plástico. Em teoria, este problema poderia ser resolvido tomando medidas que restaurem o PE máximo em condições de baixa densidade, de modo que uma correlação linear entre S e C seja (re)estabelecida (b = 1). As recomendações de Puck para o uso de células de alimentação, meios condicionados e/ou incorporação de células individuais em ágar macio podem ser suficientes para alcançar este objetivo para linhas de células selecionadas e devem aumentar a robustez dos cálculos baseados em PE em conformidade. Entretanto, é óbvio que pode ser mais do que um desafio refinar e padronizar as condições do ensaio para que as taxas de sobrevivência e crescimento de uma única célula sejam ótimas para cada tipo de célula de interesse. Decidimos aceitar condições de ensaio subótimas para o crescimento de células únicas e, em vez disso, desenvolvemos um método computacional para a análise de dados de sobrevivência clonogénica, o que explica este fenómeno bem descrito. Obviamente, nossa abordagem utilizando regressão de potência e interpolação estava além das capacidades técnicas dos anos 50, quando os dados de sobrevivência foram ajustados a olho nu. No entanto, de alguma forma, a relevância da cooperação celular saiu do foco durante as décadas seguintes. Embora alguns relatos sobre não-linearidade nos ensaios de formação de colônias tenham sido relatados ao longo do tempo, o desempenho limitado das análises baseadas em EP não foi abordado .
Interessantemente, estes estudos relataram um aumento menor do que linear no número de colônias, com números crescentes de células semeadas para certos tipos de células sob condições específicas. De acordo com isto, para algumas linhas de células em nosso painel também obtivemos valores b ligeiramente abaixo de 1,0. Três cenários diferentes podem explicar esta observação, dos quais dois são devidos a artefatos metodológicos: Primeiro, os valores b ligeiramente abaixo de 1,0 podem resultar da contagem de poços com um grande número de colónias em excesso onde pequenas colónias são ignoradas pelo pesquisador (ver poços marcados com “nd” na Fig. 1a). Em segundo lugar, o crescimento celular de pratos com elevado número de células pode ser inibido em fases bastante precoces devido a um rápido declínio na concentração de nutrientes, resultando assim em colónias abortivas. Uma terceira opção – e biologicamente menos intuitiva – é o comportamento competitivo do crescimento celular, por exemplo, devido à secreção de fatores inibidores do crescimento. Importante, qualquer um destes fenômenos é contabilizado pela abordagem de regressão e interpolação, pois considera qualquer desvio da linearidade como refletido pelo valor b.
Além disso, é notável que os valores b de várias linhas celulares para condições não tratadas em comparação com as irradiadas não são idênticos. Na maioria destes casos, os valores b de células irradiadas tendem a ser superiores aos respectivos valores b de controles não tratados, indicando que a cooperação celular aumenta com a irradiação. Consequentemente, o intervalo de valores da fração de sobrevivência obtida para C = 5 a 100 colônias torna-se maior do que no caso de valores b quase idênticos (ver linhas celulares HCC1806 e A549). Isto implica que tecnicamente não é possível extrair valores de sobrevivência mais precisos através do procedimento do ensaio clonogénico – a não ser que um número fixo de colónias (C) tenha sido seleccionado para análise. Além disso, linhas celulares com valores b excessivamente altos para células tratadas podem ser de particular interesse no que diz respeito aos estudos de resistência terapêutica. Por exemplo, o(s) fator(s) de sobrevivência induzido(s) pela radiação secretado(s) por um determinado tipo de célula pode(m) ser identificado(s) devido a um valor b correspondentemente alto.
Em resumo, nossos dados mostram a necessidade de analisar cuidadosamente os dados de experimentos de formação de colônias e considerar o impacto subestimado da cooperação celular nos cálculos da fração de sobrevivência. Isto pode aumentar muito a confiabilidade do ensaio clonogênico – e a resiliência de qualquer hipótese baseada nele.