Necrotrophic lifestyle of Rhizoctonia solani AG3-PT during interaction with its host plant potato as revealed by transcriptome analysis

Análise transriptométrica

A interacção interespecífica entre R. solani AG3-PT isolar Ben3 com a cultivar de batata de resistência média ‘Arkula’ foi analisada em nível de transcriptoma usando sequenciamento de RNA. A fim de encontrar fatores importantes para o estabelecimento da interação e posterior progressão da interação, utilizamos três amostras diferentes: micélio puro de R. solani AG3-PT isolar Ben3 cultivado sem ser atraído por uma planta de batata em crescimento (Ben3); brotos de batata a 3 dpi dos tubérculos com R. solani (precoce) e 8 dpi (tardio). Em ambas as datas de amostragem de R. solani em interação com o broto da batata, todos os brotos emergentes foram colhidos e utilizados na análise. Lesões necróticas nos brotos tornam-se visíveis pela primeira vez aos 8 dpi. Posteriormente, a extração de RNA, seqüenciamento de RNA (RNAseq) e mapeamento das leituras para o genoma do Ben334 isolado foi realizada para calcular leituras por kilobase por milhão de leituras mapeadas (RPKM). Em geral, para as amostras inoculadas, entre 1 e 23% de cada conjunto de dados foi mapeado no genoma do rascunho do Ben3. Para as amostras de controle, entre 70 e 75% desses conjuntos de dados puderam ser mapeados no genoma Ben3.

Em todas as três amostras, um número comparável de genes pôde ser detectado como sendo expresso (Tabela 1). Em micélio puro foram expressos 11.206 genes dos 12.567 genes identificados no genoma R. solani AG3-PT isolado Ben3, enquanto as leituras puderam ser mapeadas em 10.181 e 9.939 genes a 3 dpi e 8 dpi, respectivamente. Em resumo, em todas as transcriptomas dentro deste experimento 11.287 genes dos 12.567 genes identificados no genoma R. solani AG3-PT isolado Ben3 foram expressos em qualquer uma das amostras analisadas.

Como é óbvio na Tabela 1, as quantidades do total de leituras mapeadas diferiram consideravelmente. Isto se deve ao fato de que na amostragem de Ben3 a transcriptoma do micélio puro de R. solani AG3-PT isolar Ben3 foi sequenciada, enquanto nas amostragens iniciais e tardias (3 e 8 dpi) uma abordagem dupla de RNAseq foi usada para acessar as transcriptomas de ambos os organismos interagindo simultaneamente30. Como os tamanhos das bibliotecas e a quantidade de sequências produzidas de cada biblioteca eram comparáveis, na amostragem do Ben3 quase todas as leituras puderam ser mapeadas para o genoma isolado do Ben3. Nas abordagens duplas de RNAseq das amostras de 3 e 8 dpi, apenas uma fração das leituras produzidas pôde ser mapeada para o genoma Ben3, enquanto as outras foram mapeadas principalmente para o genoma da batata. Devido a estas diferentes quantidades de leituras totais mapeadas para o genoma R. solani AG3-PT isolar o genoma Ben3 por amostragem, o seguinte deve ser considerado: (1) genes com baixo valor RPKM apenas em Ben3 não são necessariamente expressos quando o fungo desafia a planta, pode ser apenas devido ao tamanho da biblioteca; (2) genes que são encontrados em todas as três amostras podem ser atribuídos como sendo comumente expressos; (3) genes que são encontrados apenas nas bibliotecas muito menores das amostras de 3 e 8 dpi podem ser assumidos como sendo específicos da interação.

Os resultados do mapeamento resumido (Tabela 1) já indicaram que deve haver muitos genes comumente expressos em todas as três amostragens. Portanto, um diagrama Venn foi construído para comparar as três amostragens e visualizar o número calculado de genes que elas têm em comum versus o número de genes que distingue as amostras individuais (Fig. 1). Mais de 9.000 genes foram encontrados para serem expressos nas três amostragens, enquanto 871 foram transcritos exclusivamente no micélio sem contato com a planta. A expressão de 29 genes foi encontrada em comum nas amostras de 3 e 8 dpi, representando genes expressos apenas na presença da planta viva da batata. Além disso, a 3 dpi 27 genes foram exclusivamente expressos, e a sequência de leitura mapeada para um pequeno conjunto de 21 genes foram exclusivamente detectáveis a 8 dpi. As listas desses genes, juntamente com seus respectivos valores RPKM e descrições são dadas nas Tabelas Suplementares 1 – 4,

Dos 29 genes que foram comumente expressos na presença da planta viva da batata, quatro genes estão codificando as proteínas envolvidas na degradação da parede celular da planta. Isto corresponde à estratégia de virulência de um patógeno necrófilo com secreção de enzimas de decomposição da parede celular para induzir necrose das células hospedeiras e vazamento de nutrientes21. Além disso, um gene codificador para uma proteína envolvida na degradação da proteína suporta ainda mais esta linha de ataque. Além disso, dois genes que codificam proteínas com domínios de ligação ao DNA e função putativa na regulação transcripcional também estão nesta lista e são susceptíveis de desempenhar um papel na regulação transcripcional do delito (por exemplo, Ben3g4553, ver Tabela 2). A maioria dos 27 genes exclusivamente expressos em 3 dpi são codificados para proteínas hipotéticas onde nenhuma função putativa pode ser atribuída. Dos 21 genes que foram exclusivamente expressos em estágios posteriores da interação (8 dpi), oito genes codificam as proteínas envolvidas na degradação da parede celular da planta e dois codificam as proteases. Isto demonstra novamente a estratégia típica de um patógeno necrófilo.

Em resumo, um primeiro exame dos dados do transcriptoma das três amostragens revelou diferenças distintas e razoáveis, demonstrando assim o potencial deste estudo em encontrar fatores importantes para o estabelecimento da interação entre R. solani AG3-PT isolar Ben 3 com uma cultivar de batata suscetível e maior progressão da interação.

As transcrições mais abundantes de R. solani AG3-PT nas três amostragens

A interação interespecífica entre R. solani AG3-PT isolar Ben 3 com a cultivar de batata de resistência média ‘Arkula’ foi inicialmente avaliada pelo exame das transcrições mais abundantes nas três amostragens diferentes. Em micélio cultivado em cultura líquida, foram encontradas transcrições de 11.206 genes do genoma isolado Ben3. No total, 698 transcrições destes genes foram detectadas com valores medianos de RPKM de 100 e superiores, 37 com valores medianos de RPKM superiores a 1.000. Na fase inicial de interação (3 dpi) dos brotos do tubérculo com o patógeno, foram detectadas transcrições de 10.181 genes com 729 mostrando valores medianos de RPKM de 100 e superiores, 25 valores medianos de RPKM superiores a 1.000. Um número de 9.939 genes de R. solani AG3-PT foram transcritos com 742 mostrando valores medianos de RPKM de 100 e superiores, 26 valores medianos de RPKM superiores a 1.000 a 8 dpi (Tabelas Suplementares 5-7). No total, foram encontrados 9.679 genes do genoma isolado Ben3 expressos em todas as três amostras, entre eles estão as transcrições mais abundantes em cada uma das amostras analisadas. Cinco destes genes mais elevados expressos (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326, e Ben3g675) estão codificando para proteínas hipotéticas específicas de R. solani com funções desconhecidas. Portanto, não se esperava que estas proteínas desempenhassem papéis específicos durante a interação com a planta, estas proteínas podem ser mais importantes para o crescimento geral e metabolismo celular. Entre as transcrições mais abundantes em cada uma das amostras individuais estão também várias proteínas contendo domínios de lectina (Ben3g9146, Ben3g9350, e Ben3g8869). Várias dessas proteínas contendo um domínio de lectina tipo beta-trefólio rico também foram relatadas anteriormente como as mais abundantes no R. solani AG1-IB isolar 7/3/14 durante a interação com sua alface hospedeira30. Embora os papéis específicos destas proteínas do domínio da lectina sejam indeterminados, foi proposto que as lectinas de R. solani poderiam ter uma função como proteína de armazenamento dentro do micélio37. Além disso, dois genes codificadores para proteínas com domínio da toxina thuringiensis (Ben3g8806, e Ben3g11931) também foram fortemente transcritos em todas as três amostras analisadas. As toxinas Bacillus thuringiensis são proteínas bacterianas conhecidas pela sua actividade biocida contra os insectos38, mas também são alvo de uma série de outros organismos39. A forte expressão de tais toxinas em R. solani indica que estas toxinas podem ser de importância geral para R. solani AG3-PT isolar Ben3 em vez de desempenharem um papel específico na interação do fungo com a planta. Uma codificação gênica para uma proteína da tampa do poro septal (Ben3g7115) também estava entre as transcrições mais abundantes em todas as três amostragens, indicando sua contribuição para a homeostase hifálica em fungos basidiomicetosos40. Uma transcrição semelhante à proteína da tampa do poro septal (RSOLAG1IB_6054) também foi altamente abundante em R. solani AG1-IB isolar transcrições 7/3/14 encontradas na zona sem sintomas de interação com alface30. Esta proteína específica para R. solani é parte do material de obturação que fecha as perfurações dentro da tampa do poro septal das células hifálicas e impede o transporte de fluidos citoplasmáticos entre as células vizinhas. Além disso, um gene que codifica uma proteína do domínio da hemopexina (Ben3g6614) também estava entre os genes mais altos expressos em comum a todas as três amostras. Este domínio denota metaloproteinases dependentes de zinco, que são amplamente reconhecidas por desempenharem um papel importante na regulação homeostática do ambiente extracelular41, mas suas funções biológicas também podem se estender além da degradação da matriz extracelular42. Como todas estas proteínas mostraram alta abundância em R. solani AG3-PT com e sem contato com a planta hospedeira, elas podem ser importantes para o crescimento e metabolismo geral, mas não parecem ter uma relevância específica na interação fúngica com a planta.

A interação entre R. solani AG3-PT e a batata

A fim de encontrar elementos com relevância para a interação de R. solani AG3-PT isolar Ben3 com o broto da batata, a expressão diferencial do gene foi realizada como integrada na plataforma ReadXplorer (v2.2)43. Esta comparação em pares de transcriptomas de micélio puro de Ben3 isolado com transcriptomas de 3 dpi ou 8 dpi de interação com brotos de batata foi realizada utilizando o programa DESeq2. Os genes foram atribuídos como diferentemente expressos com um valor P ajustado menor que 0,05 e uma mudança mínima de dobra de |2| ou mais. Usando esses critérios 592 genes puderam ser atribuídos como diferentemente induzidos a 3 dpi (soma de 242 genes exclusivamente induzidos precocemente e 350 genes induzidos a 3 dpi e também a 8 dpi; precocemente para cima) enquanto 520 genes são diferentemente reduzidos a 3 dpi (soma de 412 genes exclusivamente reduzidos precocemente e 108 genes reduzidos a 3 dpi e também a 8 dpi; precocemente para baixo). Em 8 dpi, 688 transcrições foram diferentemente induzidas (soma de 338 genes exclusivamente induzidos tardiamente e 350 genes induzidos a 8 dpi e também a 3 dpi; tardiamente para cima) e 233 são diferentemente reduzidos (soma de 125 genes exclusivamente reduzidos tardiamente e 108 genes reduzidos a 8 dpi e também a 3 dpi; tardiamente para baixo). Os diagramas Venn foram construídos para comparar e visualizar os genes diferencialmente upregulados e downregulados em ambos os pontos de interação (Fig. 2). Listas desses genes, juntamente com seus respectivos valores de mudança de prega, são dadas nas Tabelas Suplementares 8-9,

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Diferenças de expressão encontradas com esta análise DESeq2 foram validadas em experimentos usando qRT-PCR. Portanto, um gene de controle adequado com padrão de expressão invariante tem que ser estabelecido. Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (Ben3g7151, GAPDH), enzima de conjugação ubiquitina E2 (EUC63156, UBC), ligase ubiquitina-proteína E3 (Ben3g494, UBI), fator de alongamento 2 (Ben3g3364, EF-2), e genes da beta tubulina (Ben3g4099; TUB1) e (Ben3g5288, TUB2) foram testados e o gene da beta tubulina Ben3g5288 (TUB2) mostrou ser a referência mais apropriada em nossas experiências. Os níveis relativos de transcrição de três genes candidatos com diferentes padrões de expressão foram normalizados com base na expressão deste controle invariante. Os valores de ΔΔCq foram calculados e comparados com a respectiva análise DESeq2 (Tabela 2).

Para todos os três genes candidatos com padrões de expressão muito diferentes, os valores de ΔΔCq calculados estavam de acordo com os respectivos valores de variação log2fold computados na análise DESeq2, demonstrando assim a validação das diferenças de expressão.

Além disso, foram realizadas anotações ontológicas de genes (GO) com o objetivo de atribuir as respectivas funções aos genes particulares. Na análise posterior, um foco específico foi colocado nos genes significativamente induzidos para, preferencialmente, capturar candidatos moleculares que possam ser importantes para iniciar e estabelecer a interação com a planta.

Genais diferencialmente expressos (DEGs) em Ben3 isolado a 3 dpi de brotos de batata

Genais diferencialmente induzidos em Ben3 isolado em interação com brotos de batata a 3 dpi em comparação com micélio puro do isolado foram selecionados assumindo funções no início e suporte do processo de interação com os brotos de batata. As funções supostas dos produtos genéticos particulares e sua distribuição nos aspectos GO comuns para o processo biológico (PB), função molecular (MF), e componente celular (CC) são dadas na Fig. 3.

A 3 dpi, os genes diferencialmente induzidos são atribuídos principalmente como estando envolvidos nos processos metabólicos dos carboidratos e compostos de nitrogênio celular e no transporte. Quase 10% (50 genes) dos genes diferencialmente upregulados estão codificando várias atividades de peptidase (por exemplo, Ben3g2070, veja a Tabela 2), enquanto 53 genes estão codificando enzimas degradantes da parede celular, incluindo várias hidrolases diferentes que atuam em ligações glicosil, e liases pectativas (por exemplo, Ben3g3530, veja a Tabela 2) ou xilanases. A fim de especificar melhor estas enzimas que degradam a parede celular, todos os DEGs também foram anotados de acordo com a base de dados do Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Tabela Complementar 11). A secreção de um grande arsenal de enzimas hidrolíticas como proteases e enzimas que degradam a parede celular durante a interação44,45 é necessária para que patógenos fúngicos necróficos de plantas como R. solani induzam necrose celular pela quebra de componentes proteicos estruturais e carboidratos das paredes celulares das plantas e causem vazamento de nutrientes9,30,46,47. Desta forma, é levantada a hipótese de que a parede celular induzida degradando enzimas e várias das peptidases induzidas funcionam como suporte da interação de R. solani AG3-PT com o tecido do broto da batata. Entretanto, as peptidases secretadas também têm sido amplamente estudadas por seu papel como efetores de bactérias gram-negativas48 e também de fungos47,49. Os efetores de patógenos são geralmente fornecidos como fatores de virulência nas células hospedeiras para suprimir as respostas de defesa basal e criar um ambiente adequado para a propagação de patógenos50,51,52. Assim, a modificação pós-tradução das proteínas do hospedeiro através do processamento proteolítico é um mecanismo amplamente utilizado na regulação da resposta de defesa da planta. Com o estágio atual do conhecimento, pode-se supor que uma ou mais destas proteases induzidas têm papéis putativos como efetores que suportam a interação de R. solani AG3-PT no hospedeiro da batata. No entanto, mais análises funcionais das proteases individuais são necessárias para atribuir claramente seu papel funcional na interação do hospedeiro patogênico.

Um outro grande grupo composto de 100 membros de genes diferencialmente upregulados da interação a 3 dpi é descrito como codificação para proteínas hipotéticas. A maioria destes genes são específicos de R. solani e homólogos podem ser encontrados nos outros cinco genomas anotados de R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8, e R. solani AG1-IA e AG1-IB. A partir de nossa análise de expressão diferencial de genes, espera-se que alguns destes genes estejam envolvidos no suporte da interação de R. solani AG3-PT no broto da batata. Já é sabido que os efetores segregados de patógenos fúngicos visam a imunidade do hospedeiro usando várias estratégias, por exemplo, hidrolisando um precursor ácido salicílico53 , ou ligando-se a fatores de transcrição, inibindo assim sua atividade54. Outras análises são necessárias para revelar funções putativas das proteínas hipotéticas até agora hipotéticas para seus vários possíveis papéis na interação de R. solani AG3-PT com batata.

Interessantemente, o gene mais forte e diferencialmente aumentado (Ben3g6247) é homólogo às proteínas da família LTE (lipid-translocating exporter), como RTA1 de Saccharomyces. A proteína RTA1 contém sete segmentos potenciais de membrana55 e é prevista uma proteína de membrana integral com função na resistência celular aos xenobióticos56. Outros genes da família LTE podem codificar transportadores ou sensores que facilitem a excreção de intermediários biossintéticos, seja direta ou indiretamente56. Estas funções putativas das proteínas da família LTE tornam o gene Ben3g6247 um candidato favorito envolvido na secreção de componentes importantes para o ataque do patógeno.

A fase inicial da interação necrotrófica está associada à morte celular do hospedeiro da planta e à produção de vários metabólitos secundários e ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio21. Tem sido demonstrado que processos antioxidantes e respectiva expressão gênica foram correlacionados com tecidos necróticos em vários patossistemas de R. solani (broto de batata-R. solani AG3; hipocotil-R. solani AG4 e folhas de soja-R. solani AG1-IA)27. Na fase inicial de interação do hospedeiro da batata com o isolado Ben3 (3 dpi) não foi possível observar fortes evidências de indução de processos antioxidantes em hifas patogênicas em nível transcripcional, pois não houve forte aumento na expressão do gene glutationa S-transferase ou upregulação de outros genes conhecidos por estarem envolvidos na depuração de espécies reativas de oxigênio. Portanto, pode-se postular que em nosso sistema para colonizar o broto da batata com R. solani AG3-PT, a análise tecidual a 3 dpi se assemelha a um estágio inicial da interação do patógeno da planta, talvez uma infecção prévia do tecido do broto. Nenhum sintoma visível foi observado neste momento.

Genais diferencialmente expressos no Ben3 isolado a 8 dpi de brotos de batata

A fim de encontrar transcrições que são importantes em um estágio avançado da interação, genes diferencialmente induzidos entre micélio puro do Ben3 isolado e Ben3 atraídos para brotos de batata a 8 dpi foram rastreados. As respectivas anotações funcionais dos produtos gênicos e sua distribuição nas características GO comuns são mostradas na Fig. 4. A 8 dpi, os genes induzidos diferencialmente são atribuídos principalmente como estando envolvidos nos processos metabólicos dos carboidratos e macromoleculares e no transporte. Neste último estágio de interação, os 152 genes upregulados (> 22%) estão codificando várias enzimas degradantes da parede celular (por exemplo, Ben3g3530, veja a Tabela 2). Além disso, todos os DEGs também foram anotados de acordo com a base de dados de Carboidratos Active enZyme (CAZy) (Tabela Complementar 11). Esta expressão aumentada da codificação dos genes das enzimas hidrolíticas da parede celular demonstra bem a crescente atividade patogênica do Ben3 isolado, assim como a importância da quebra dos componentes da parede celular para acessar os nutrientes durante o curso da interação, confirmando assim a estratégia de virulência descrita de um patógeno necrotrófico21,57. Esta tática destrutiva foi acompanhada por uma indução de expressão de genes que codificam componentes integrais das membranas. Estas 154 proteínas de membranas integrais em sua maioria não caracterizadas e transportadores putativos estavam presumivelmente envolvidos na absorção de nutrientes e produtos de degradação das atividades da hidrolase. Nesta fase de interacção a importância predominante dos genes que codificam as peptidases parecia estar a diminuir, mas ainda assim 33 genes que codificam peptidases estavam diferentemente upregulados (por exemplo, Ben3g2070, ver Tabela 2). Isto também poderia ser explicado pelo fato de que brotos inteiros foram colhidos, incluindo os brotos com até 8 dias de interação com o patógeno desafiador e os brotos emergentes subseqüentes com um período de interação mais curto. Em geral, isto também é representado nos 350 genes que estavam em comum, diferentemente aumentados a 3 e 8 dpi (Fig. 2).

Além disso, outro grande grupo de DEGs a 8 dpi é composto de 98 genes com função desconhecida. Como estes genes são específicos da Rhizoctonia sem nenhuma região de similaridade com seqüências com funções atribuídas, só se pode especular sobre seu papel no suporte da interação da planta patogênica. Outras comparações funcionais desses genes e, por exemplo, sua expressão diferencial nos respectivos sistemas patogênicos podem dar pistas para sua função putativa.

No sistema experimental aqui descrito para colonizar o broto da batata com lesões isoladas de R. solani AG3-PT Ben3 tornam-se visíveis pela primeira vez a 8 dpi. Foi demonstrado em outros experimentos25,27 que a interação necrotrófica e morte celular no hospedeiro da planta estava correlacionada com a respectiva expressão gênica na planta e no fungo. Samsatly e colaboradores27 demonstraram, usando RT-PCR quantitativa, que a expressão dos genes antioxidantes que codificam o glutationa S-transferase e a catalase foram significativamente aumentados em R. solani AG3 cinco dias após a inoculação dos brotos de batata desprendidos. Mas a expressão desses genes antioxidantes tão fortemente aumentada não pôde ser encontrada nas experiências aqui descritas. As razões para estas diferenças podem ser devidas à inoculação usando isolados de R. solani AG3 exibindo diferenças na patogenicidade. Entretanto, outra distinção é o fato de que Samsatly e seus colaboradores27 realizaram experimentos com brotos destacados em um sistema in vitro limitado, enquanto nosso arranjo experimental reflete plenamente as condições do ambiente in vivo com brotos crescendo em tubérculos de sementes cultivadas. Outras investigações juntamente com a análise concomitante do transcriptoma no hospedeiro da batata irão finalmente aumentar a compreensão de uma relação mútua na interação do patógeno hospedeiro em um ambiente semelhante à situação natural.

Genes expressos diferencialmente no isolado Ben3 comparando 3 e 8 dpi de brotos de batata

Diferenciar entre R. solani AG3-PT que foram principalmente relevantes no momento inicial e aqueles que se tornaram mais importantes em estágios avançados da interação genes diferentemente expressos entre 3 e 8 dpi da interação também foram analisados com DESeq2. Usando os critérios acima mencionados com valores de P ajustados inferiores a 0,05 e uma mudança mínima de dobra de |2| ou mais 173 genes poderiam ser atribuídos como diferentemente reduzidos expressos entre 3 e 8 dpi enquanto 400 genes são diferentemente aumentados expressos no ponto temporal posterior. As listas completas desses genes, juntamente com seus respectivos valores baseMean e valores de mudança de dobra são apresentadas na Tabela Suplementar 10, as listas dos 20 genes mais diferentemente expressos entre 3 e 8 dpi são apresentadas nas Tabelas 3 e 4. Enquanto 10 dos 20 genes expressos mais diferentemente reduzidos entre 3 e 8 dpi estão codificados para proteínas envolvidas na degradação de proteínas e absorção e assimilação de nitrogênio (Tabela 3), a maioria dos genes diferentemente aumentados expressos entre 3 e 8 dpi estão envolvidos na degradação de polissacarídeos com foco em polissacarídeos líticos dependentes de cobre monooxigenases para clivagem de cadeias de celulose com oxidação de vários carbonos (Tabela 4).

Sabe-se que o metabolismo do nitrogênio e a expressão de genes regulados por nitrogênio nos fungos patogênicos da planta é de grande importância para o estabelecimento da doença na planta hospedeira58. Entretanto, o nitrato é a fonte menos preferida de nitrogênio em comparação com amônia e L-glutamina no que diz respeito à utilização de nutrientes em fungos, pelo menos durante a infecção das folhas59. Em fungos, esta utilização preferencial de nutrientes é regulada através da repressão do metabolito de azoto e assegura a transcrição dos genes codificadores da amónia e da permease activa da ureia. Além da forte expressão transitória de genes que codificam amônia e compostos nitrogenados transportando permeases (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369, e Ben3g7775) no estágio inicial de interação em 3 dpi, R. solani AG3-PT isolou o Ben3 também exerceu alta indução e expressão de genes envolvidos na absorção e assimilação de nitrato (Ben3g6360, Ben3g6359, e Ben3g6361). Se esta é uma característica distintiva do Ben3 isolado ou uma característica de fungos patogênicos de plantas transmitidas pelo solo precisaria de mais investigações.

A maioria dos genes com expressão diferentemente aumentada entre 3 e 8 dpi estão envolvidos no código de degradação da parede celular para hidrolases que atuam em ligações glicosiladas, e liases pectativas. Isto era esperado e demonstra novamente a crescente importância da decomposição dos componentes da parede celular designando a estratégia de virulência de um patógeno necrotrófico21.