Micronúcleo
MN originam-se de fragmentos de cromossomos ou cromossomos inteiros que ficam atrás da anáfase durante a divisão nuclear e não estão incluídos nos núcleos principais.13,18,19 MN são pequenos corpos extranucleares que surgem na divisão de células de fragmentos de cromossomos/cromossomos acêntricos ou cromossomos/cromatídeos inteiros que ficam para trás na anáfase e não são incluídos nos núcleos filhas na telophase.20 Na telófase, forma-se um envelope nuclear ao redor dos cromossomos e fragmentos retardados, que então se desenrola e gradualmente assume a morfologia de um núcleo interfásico, exceto que eles são menores que os núcleos principais da célula (daí o termo “micronúcleo”).19 MN abrigando fragmentos cromossômicos pode resultar da quebra direta de DNA de cadeia dupla, conversão de quebras de cadeia única em quebras de cadeia dupla após a replicação celular, ou inibição da síntese de DNA.20
MN pode ser formado através de diferentes vias: nomeadamente, a partir de cromossomas acêntricos ou fragmentos cromatídeos. Uma pequena proporção de fragmentos cromossômicos acêntricos pode simplesmente surgir de quebras de DNA não reparadas de cadeia dupla. Outros mecanismos que podem levar à formação de MN a partir de fragmentos acêntricos incluem a reparação simultânea da excisão de fragmentos danificados (por exemplo, 8-oxo-deoxiganosina) ou bases inadequadas incorporadas no DNA (por exemplo, uracil) que estão nas proximidades e em filamentos de DNA complementares opostos.21 Outro mecanismo que pode levar ao MN a partir de eventos de perda cromossômica é a hipometilação da citosina em seqüências de repetição centrômicas e pericentrômicas, tais como repetições clássicas de satélite em regiões pericentrômicas e repetições de ordem superior do DNA de satélite em DNA centrômero.21 Devido ao papel central das proteínas cinetócicas no envolvimento dos cromossomos com o fuso, é provável que mutações que levem a defeitos na dinâmica de interação entre cinetócitos e microtubulos possam causar a formação de MN devido à perda cromossômica na anáfase. Outras variáveis que podem aumentar o MN a partir da perda cromossômica são defeitos na montagem do fuso mitótico, defeitos no ponto de verificação da mitose e amplificação anormal do centrossomo.21
O destino do MN após sua formação na célula micronucleada é mal compreendido. O seu destino pós-mitose inclui: (1) eliminação da célula micronucleada como consequência da apoptose; (2) expulsão da célula (quando não se espera que o DNA dentro do MN seja funcional ou capaz de se replicar devido à ausência dos componentes citoplasmáticos necessários); (3) reincorporação no núcleo principal (quando os cromossomos reincorporados podem ser indistinguíveis dos do núcleo principal e podem retomar a atividade biológica normal); e (4) retenção dentro do citoplasma da célula como uma entidade extranuclear (quando o MN pode completar uma ou mais rodadas de replicação de DNA/cromossomo).20,22
A principal vantagem do ensaio CBMN está na sua capacidade de detectar tanto eventos clastogênicos quanto aneugênicos, levando a aberrações cromossômicas estruturais e numéricas, respectivamente.20 Os clastogênios induzem o MN pela quebra da dupla hélice do DNA, formando fragmentos concêntricos que são incapazes de aderir às fibras do fuso e de se integrar aos núcleos filhas, sendo assim deixados de fora durante a mitose. O mesmo ocorre com cromossomos inteiros com cinetócitos danificados; eles não podem se fixar aos microtubos que puxam os cromatídeos para as células filhas durante a mitose e, portanto, permanecem fora dos novos núcleos. Estes danos podem ser gerados por produtos químicos que reagem com as proteínas que formam os cinetos.23,24
Aneugênios são produtos químicos que impedem a formação do aparelho do fuso durante a mitose. Estes agentes geram não só cromatídeos inteiros que ficam fora dos núcleos, formando assim MN, mas também a formação de células multinucleadas, nas quais cada núcleo conteria um número diferente de cromossomos. Estes agentes são também susceptíveis de induzir um aumento de figuras mitóticas que são claramente vistas nas mesmas lâminas. Com o ensaio CBMN é possível distinguir entre MN originário de cromossomos inteiros e aqueles originários de fragmentos acêntricos, bem como determinar se a má segregação dos cromossomos está ocorrendo entre núcleos de uma célula binucleada que pode não conter MN, usando sondas centrômicas.8,10,19
Sondas de DNA pancentrômicas são usadas para distinguir entre MN originário de qualquer evento de perda de cromossomo inteiro e MN contendo fragmentos de cromossomos acêntricos. O uso de sondas de DNA centrômicas específicas para cromossomos permite tanto a determinação de eventos específicos de perda cromossômica resultando em MN quanto a segregação desigual de cromossomos específicos entre núcleos filhas, mesmo na ausência da formação de MN.21 Sondas pancentrômicas devem ser usadas apenas para distinguir entre MN originário de quebras cromossômicas (centrômero negativo) e perda cromossômica (centrômero positivo). As sondas centrômeros específicas de cromossomos devem ser usadas apenas para medir a má agregação (devido à não disjunção ou perda cromossômica) envolvendo cromossomos únicos.8,10,19,21,25 A avaliação da origem mecanicista do MN individual por centômeros e identificação de cine-tocores contribui para a alta sensibilidade e especificidade do método.20
Fatores importantes influenciam a frequência basal do MN nos linfócitos humanos. Idade e gênero são as variáveis demográficas mais importantes que afetam o índice MN; as freqüências nas mulheres são maiores que nas masculinas por um fator de 1,2-1,6, dependendo da faixa etária.26 A freqüência MN foi significativa e positivamente correlacionada com a idade em homens e mulheres e é afetada por fatores dietéticos como deficiência de folato e níveis plasmáticos de vitamina B12 e homocisteína. Também foi proposto que o índice de MN pode ser influenciado pela propensão das células de um indivíduo a sofrer apoptose, e por fatores genéticos como polimorfismos genéticos.10,20,27
Em uma forma geral, a formação de MN é atribuída a uma variedade de insultos ao material genético, que poderiam ser classificados como fatores exógenos e endógenos. Os fatores exógenos incluem radiação, agentes químicos e invasão de microorganismos. Fatores endógenos incluem defeitos genéticos, alterações patológicas, deficiência de ingredientes nutricionais essenciais (por exemplo, ácido fólico) e lesões induzidas por produtos metabólicos deletérios (como espécies reativas de oxigênio).28
A hipótese de uma associação preditiva entre a freqüência do MN no ensaio de MNMC em linfócitos e o desenvolvimento de câncer é suportada por uma série de achados: (1) uma associação entre a frequência de MN e o risco de câncer foi inferida a partir de semelhanças mecanicistas com aberrações cromossômicas, que se mostraram preditivas para o câncer; (2) in vitro, observa-se alta concordância entre aberrações cromossômicas e MN; (3) um aumento na frequência de MN é observado em linfócitos de pacientes com câncer e em pacientes com síndromes que os tornam propensos ao câncer, como a síndrome de Bloom e a ataxia telangiectasia; (4) a frequência de MN está significativamente associada à concentração sanguínea de vitaminas como o folato, cujas deficiências estão associadas ao aumento do risco de alguns cancros; (5) existe uma ligação direta entre as frequências de MN e os estágios iniciais da carcinogênese: nomeadamente, uma associação significativa entre o aumento da frequência de MN e as categorias diagnósticas de baixo e alto grau de carcinogénese cervical nas mulheres.20
Formação de anomalias nucleares como MN, rearranjos cromossômicos e pontes anáfase (levando a ciclos de ruptura-fusão-ponte e geração de mais MN) são eventos comumente vistos nos estágios iniciais da carcinogênese. Níveis elevados de MN indicam defeitos na reparação do DNA e segregação cromossômica que podem resultar na geração de células filhas com dosagem alterada do gene, ou desregulação da expressão gênica que pode levar à evolução do fenótipo de instabilidade cromossômica freqüentemente observada no câncer. Estas considerações dão apoio mecanicista a uma possível associação causal entre a frequência MN e o risco de cancro. Um estudo de Bonassi et al.29 observou uma associação entre a frequência de MN e o risco de câncer em neoplasias malignas não hematológicas, o que sugere que os eventos de lesão do genoma em linfócitos podem estar correlacionados com eventos iniciadores de câncer em outros tecidos através de um fator genético, dietético ou ambiental comum.