Microbiologia & Experimentação

O isolamento e caracterização de cepas bacterianas do Município de Barrackpore e do aterro sanitário de Dhapa foi realizado neste estudo. O crescimento bacteriano depende de várias condições físico-químicas tais como meios, pH, temperatura, período de incubação, fonte de carbono, etc. Portanto, condições diferentes sobre as quais as bactérias cresceram em habitat natural devem ser estudadas antes de se multiplicarem massivamente para serem usadas como decompositoras. Assim, os seguintes parâmetros foram levados em consideração:

Características físicas e químicas dos resíduos sólidos urbanos

As bactérias podem crescer em uma ampla gama de níveis de umidade. Neste estudo, verificou-se que o teor de humidade da amostra recolhida do município de Barrackpore e do aterro sanitário de Dhapa era de cerca de 65,32% e 66,45%, respectivamente. A população bacteriana de vários solos está estreitamente correlacionada com o seu teor de humidade. A densidade máxima de bactérias é encontrada em regiões com um teor de humidade bastante elevado e o nível óptimo para as actividades das bactérias aeróbicas é frequentemente 50%-75% da capacidade de retenção de humidade do solo.1 Números dos géneros Pseudomonas, Achromobacter e Bacillus são encontrados na maioria dos solos aeróbicos; onde as condições são anaeróbicas e húmidas ocorrerá o Clostridium. Actinomycetes mostraram um aumento quantitativo semelhante sob tais condições.15

Neste estudo o pH dos dois meios selecionados (BCDA e NA) foi otimizado para cultivar cepas bacterianas. O pH da amostra coletada foi de 7,79 em ambas as amostras. O pH é um fator chave para o cultivo de bactérias em meios artificiais. A otimização do pH foi realizada em dois meios selecionados, o Agar nutritivo (NA) e o Agar básico de czapek dox (BCDA). NA e BCDA a pH 7,2 e 7,6 foram considerados adequados para o crescimento máximo das cepas bacterianas. A partir dos resultados, verificou-se que o pH da amostra era de cerca de 7,79 e possível por este motivo, estas estirpes também cresceram bem, in vitro, a pH 7-8 em BCDA e NA. As bactérias podem tolerar uma reação do solo entre os níveis de pH 4 e 10, mas o pH mais favorável para a maioria é apenas um lado alcalino à neutralidade. Bactérias como Thiobacillus thiooxidans e Acetobacter sp. são capazes de crescer a valores muito baixos de pH entre o nível 0 e 2 e alguns Bacillus sp. podem crescer a pH 11.15 O crescimento ideal de Thermoactinomycetes ocorre a pH 8 ou 9 e é muito deprimido por reacções de cerca de pH 516 Vibrio, Streptococcus faecalis e Escherichia coli também toleram uma reacção alcalina (pH 8-9).16

O conteúdo NPK da amostra foi estudado inicialmente. O conteúdo de matéria orgânica foi de 27,84% (Município de Barrackpore) e 29,32% (Dhapa), o conteúdo de nitrogênio em % foi de 0,165 (Município de Barrackpore) e 0,179 (Dhapa), o conteúdo de fósforo em % foi de 0,502 (Município de Barrackpore) e 0,545 (Dhapa) e o conteúdo de potássio em % foi de 18,29 (Município de Barrackpore) e 19,21 (Dhapa). Todas estas análises deram um claro entendimento do ambiente nativo das bactérias e assim foram os fatores determinantes no isolamento e cultivo das cepas.

Características culturais dos isolados bacterianos

No nosso estudo, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 e C3 – estas 9 cepas bacterianas foram isoladas em meios de cultura. O ágar Czapek dox e o ágar nutriente foram selecionados para determinar os meios mais adequados para garantir o crescimento maciço das cepas isoladas. O ágar czapek dox (BCDA) foi adequado para o crescimento maciço de BM3, D1,C2 e o ágar nutriente (NA) foi adequado para o crescimento maciço de BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. Observou-se que o extrato de levedura contendo xylan era adequado para o crescimento máximo de bactérias, mas Pseudomonas sp., Bacillus spp., Aeromonas sp. crescem bem em meios de ágar nutriente. A observação visual e microscópica foi utilizada para caracterizar as estirpes selecionadas. Os detalhes das características da colónia das bactérias são anotados (Tabela 1). A coloração de Gram é um método antigo e confiável para a observação das bactérias. As bactérias Gram negativas foram descoloridas pelo álcool, perdendo a cor púrpura do violeta cristal. As bactérias Gram positivas não foram descoloridas e permaneceram roxas.

Na presente investigação, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 e C3 – estas 9 cepas bacterianas foram isoladas e a caracterização microbiológica foi feita. Os resultados mostraram que BM1, BM3, D1 são bacilos gram-positivos, BM2 são bacilos gram-positivos curtos, D2 são bacilos gram-positivos, D3, C2 são bacilos gram-positivos negativos, D4 é bacilos gram-positivos curtos e C3 é coccus gram-positivos. Também foram realizados diferentes testes bioquímicos para que os 9 isolados conhecessem suas características bioquímicas. Os detalhes dos caracteres bioquímicos das bactérias são anotados na (Tabela 2).

Os resultados acima deram uma ideia da morfologia, características da colónia e natureza bioquímica das estirpes isoladas, o que ajudaria na identificação e caracterização das estirpes bacterianas isoladas no futuro.

Optimização das condições de crescimento

Na presente investigação, o crescimento das cepas isoladas foi observado em vários meios de crescimento como NA, ACDA e BCDA. Foi observado que o ágar czapek dox básico (BCDA) foi adequado para o crescimento maciço de BM3, D1, C2 e o ágar nutriente (NA) foi adequado para o crescimento maciço de BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

Neste experimento, as culturas bacterianas de 9 cepas foram incubadas a diferentes temperaturas como 25, 29, 34, 37 e 40 °C. O crescimento óptimo de todas as estirpes foi encontrado a 37°C. A faixa ideal de temperatura para as bactérias é de cerca de 25-36°C. Um grande número de bactérias pode crescer bastante bem acima da temperatura de 10-4°C.6 Sultana17 observou que 33±4°C de temperatura era ideal para o crescimento de bactérias.17 Certas bactérias se desenvolvem mais vigorosamente a temperaturas abaixo de 20°C. Termófilos crescem bem a temperaturas de 45-65°C e alguns termófilos são incapazes de se multiplicar abaixo de 40°C.1

As estirpes obtidas neste estudo foram incubadas durante diferentes períodos de incubação (6, 12, 24, 36, 48 e 72h). O período de incubação de 24h foi adequado para BM1, BM2, D2, D3, D4, C3 enquanto que BM3, D1 e C2 foi considerado adequado com período de incubação de 36 h. As bactérias coliformes crescem no período de incubação de 24±2h e a 32°C e mostram bom crescimento a 37°C durante 48 h de incubação. Em observação visual, verificou-se que após 24h de incubação, a cor da BM2 era laranja claro, a BM1 era branca e a BM3 era branca cremosa no seu meio preferido (BCDA e NA). Após 48-72h de incubação, a cor da BM2 era laranja, BM1, D1 era amarelo, C2 era vermelho e BM3, D2, D3, D4, C3 permanecia branco-creme. Os tipos de colónia das estirpes BM1, BM2, D2 e D4 eram húmidos e as restantes eram cremosas. Os Staphylococci e Micrococci produzem colónias castanhas douradas, amarelas ou brancas em meios comuns. Alguns Enterococci, Coryneforms e Enterobacteria podem produzir colônias negras em meio comum.8

Ensaio de antagonismo

O método de estrias cruzadas foi empregado para determinar o antagonismo entre as cepas bacterianas para sua futura aplicação em diferentes aspectos. Os detalhes do antagonismo dentro dos isolados bacterianos são descritos (Tabela 3).

BM2 tem antagonismo com todas as outras estirpes, pelo que não é possível desenvolver um consórcio utilizando esta estirpe como um dos isolados. D1, D3 também têm antagonismo com a maioria das outras linhagens. BM1 é a estirpe mais potente, pois tem um antagonismo com nenhuma das outras estirpes isoladas. BM3, D2, D4, D5 e D6 têm antagonismo com alguns isolados e essas cepas, juntamente com BM1, podem ser testadas em diferentes combinações para a preparação do consórcio.

Ensaio de tolerância a metais pesados

Cinco metais pesados (As, Zn, Pb, Hg, Cd) foram selecionados para a determinação da capacidade de tolerância a metais das cepas de bactérias isoladas (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3). O teste de tolerância indicou que entre cinco metais pesados experimentados, a tolerância máxima foi mostrada para Pb mostrando o crescimento de microorganismos até 4000ppm e a tolerância mínima para Cd mostrando nenhum crescimento acima de 30ppm. O MIC foi observado quando os isolados não cresceram em placas mesmo após 10 dias de incubação. O resultado mostra que para as três bactérias o MIC variou de 250ppm a 350ppm para As, Cd (10-30ppm), Zn (200-300ppm), Hg (200-300ppm) e Pb (3000-4000ppm) (Tabela 4). No presente estudo, a maior tolerância de As e Cd encontrada em BM1, enquanto a maior tolerância de Zn é observada em BM2 e BM3 mostrou acúmulo máximo de Hg e Pb. Em nosso estudo, o metal mais tóxico (com o MIC mais baixo) é o cd enquanto o menos tóxico testado é o Pb (Tabela 4).

MIC foi observada quando os isolados não cresceram nas placas, mesmo após 10 dias de incubação.18 Mergeay et al.19 testaram as concentrações inibitórias mínimas (MICs) de vários metais diferentes e encontraram que o metal mais tóxico (com a MIC mais baixa) era o mercúrio, enquanto o metal menos tóxico era o manganês.19 A tolerância microbiana em cada concentração de metal pesado foi retratada pelo teste do ensaio em taça. O diâmetro da zona de inibição ao redor de cada copo aumentou com o aumento da concentração de metais pesados indicando o efeito tóxico dos metais pesados sobre o crescimento dos microorganismos. O Município de Barrackpore e Dhapa recolhe todos os resíduos sólidos domésticos e industriais da cidade de Barrackpore, cidade de Calcutá, respectivamente e seus arredores. Os resíduos provenientes de fontes domésticas e industriais são o ambiente apropriado onde os microrganismos podem desenvolver resistência aos metais pesados. A presença de pequenas quantidades de metais pesados nos resíduos sólidos pode induzir o surgimento de microorganismos resistentes aos metais pesados. A resistência microbiana ao metal pesado é atribuída a uma variedade de mecanismos desintoxicantes desenvolvidos por microrganismos resistentes, tais como complexação por exopolissacarídeos, ligação com envelopes de células bacterianas, redução de metais, efluxo de metais, etc. Estes mecanismos são codificados em genes plasmídicos facilitando a transferência de resistência a metais tóxicos de uma célula para outra.20 O organismo resistente a metais pesados pode ser um agente potencial para a biorremediação da poluição por metais pesados. Como os metais pesados são todos similares em seu mecanismo tóxico, múltiplas tolerâncias de metais são fenômenos comuns entre bactérias resistentes a metais pesados.21

Ensaio de sensibilidade a antibióticos

Teste de sensibilidade a antibióticos ajuda a determinar a eficácia de um antibiótico contra o organismo de teste. Os 9 isolados foram testados quanto à sua sensibilidade a quatro antibióticos e o resultado é anotado (Tabela 5). Os compostos antimicrobianos são produzidos pela maioria dos isolados que podem servir à ciência médica. Os isolados D1, D3 e D5 não mostraram atividade antimicrobiana.

Ensaio de atividade antimicrobiana

Produção de compostos antimicrobianos parece ser um fenômeno geral para a maioria das bactérias. No presente estudo 3 isolados mostraram atividade antibacteriana e 5 isolados mostraram atividade antifúngica, mas 3 isolados não mostraram atividade antibacteriana nem antifúngica contra os patógenos. O resultado foi retratado (Tabela 6). Estudo similar foi relatado por Subramaniam et al.22 Uma variedade de compostos antimicrobianos são produzidos por membros do gênero Bacillus, muitos destes identificados como peptídeos, lipopeptídeos e derivados fenólicos. A busca por novos metabólitos secundários com atividade biológica diversificada em diversos ambientes tem ganhado maior atenção nos últimos anos.

Produção de enzimas extracelulares

Com a crescente conscientização sobre a proteção ambiental, o uso de enzimas, particularmente de extremófilos, ganhou considerável atenção em muitos processos industriais. Nos últimos anos, as enzimas microbianas têm substituído os catalisadores químicos na fabricação de produtos químicos, têxteis, produtos farmacêuticos, papel e produtos químicos agrícolas alimentares. O bioprocesso industrial enzimático agora compete diretamente com processos químicos estabelecidos. No entanto, neste estudo, os 9 isolados foram submetidos a ensaios qualitativos para produção de oito enzimas diferentes, como protease, lecitinase, DNase, lipase, celulase, amilase, catalase e oxidase. Estudo semelhante foi relatado por Subramani e Narayanasamy.23 Curiosamente em nosso estudo 6 deles mostraram produção de enzima protease que tem um alto valor de mercado. Todas as 9 cepas produziram catalase e enzima oxidase. O resultado é anotado (Tabela 7).

Ensaio de prófase

6 cepas (BM1, BM3, D1, D3, C2 e C3) entre os 9 isolados expostos a produção de protease. Protease com uma ampla aplicação na indústria alimentar, indústria de detergentes, indústria farmacêutica, bem como na degradação de resíduos sólidos, foi realizado o ensaio quantitativo da protease produzida. A actividade da enzima protease assim produzida foi determinada e o resultado foi expresso em UI/ml. O resultado é apresentado (Tabela 8). O ensaio quantitativo de protease invariavelmente provou que entre as 6 cepas, BM1 está produzindo protease com alto valor de titulação e Gupta et al.,24 de protease alcalina de espécies bacterianas e sua aplicação industrial.

Potencial de degradação de resíduos por bactérias isoladas

A enzima de protease tem uma vasta aplicação na degradação de resíduos. Assim, as 6 cepas capazes de produzir a enzima protease foram submetidas a um teste de eficiência de degradação dos resíduos. Em nosso estudo pode ser observado que BM1 tem o maior potencial de degradação seguido por BM3. BM1 é também um potente produtor de enzimas proteases, possuindo assim uma melhor capacidade de degradação também (Figura 1). Como os resíduos são decompostos por microrganismos (bactérias), o peso da ninhada diminui. No presente estudo de decomposição, observamos que o peso da maca tratada diminuiu porque as bactérias a quebraram e a converteram em moléculas simples. A percentagem de perda de peso das amostras de resíduos foi aumentada com a progressão do processo de decomposição, como pode ser visto na Figura 1. Observação semelhante foi relatada por Zaved et al.,25 no estudo de perda de peso de lixo por bactérias específicas em Bangladesh. Em nosso estudo pode ser observado que o BM1 tem o maior potencial de degradação seguido. Assim, BM1 pode ser eficientemente utilizado para biorremediação de resíduos sólidos.