Abstract
Previamente, nosso grupo demonstrou que a expressão nuclear de E3 ubiquitin ligase (MDM2) no mesotelioma pleural maligno (MPM) está significativamente associada com a diminuição da sobrevivência global. Uma possível explicação pode ser que a superexpressão do MDM2 leva a uma degradação proteasômica do TP53 que eventualmente resulta em uma perda de apoptose induzida pelo TP53 e senescência. É bem conhecido de outras entidades tumorais que a restauração da atividade do TP53, por exemplo, pela inibição do MDM2, resulta em uma resposta instantânea de estresse induzido pelo TP53 e/ou danos ao DNA das células cancerosas. Nutlin-3A (um análogo cis-imidazolina) foi descrito como um potente e seletivo inibidor de MDM2 que previne a interação MDM2-TP53 por ligação específica com a bolsa de ligação hidrófoba TP53 de MDM2. No presente estudo, os efeitos da inibição do MDM2 em MPM via Nutlin-3A e agentes quimioterápicos padrão à base de platina foram testados comparativamente em três linhas de células MPM (NCI-H2052, MSTO-211H e NCI-H2452) mostrando diferentes perfis de expressão do TP53, MDM2 e seu inibidor fisiológico do MDM2-P14/ARF. Nossas experiências in vitro em linhas celulares MPM revelaram que Nutlin-3A em combinação com cisplatina resultou em até 9,75 vezes maior indução de senescência (p=0,0050) e até 5 vezes maior taxa de apoptose (p=0,0067) em comparação com os regimes comumente aplicados de cisplatina e pemetrexe. Assim, Nutlin-3A, um potente inibidor do MDM2, está associado a uma significativa indução de senescência e apoptose nas linhas celulares MPM, tornando Nutlin-3A uma substância promissora para uma terapia direcionada no subgrupo de MPM mostrando superexpressão de MDM2.
1. Introdução
Malignant mesothelioma is a highly aggressive tumor arising from mesothelial lined surfaces, mostly from the pleural cavities (malignant pleural mesothelioma, MPM) . Quando não tratado, a sobrevida mediana dos pacientes é de nove meses. Os pacientes com MPM são negativamente afetados pelas modalidades de tratamento atuais, na maioria das vezes insuficientes, que consistem em regimes contendo platina usando cisplatina ou carboplatina como primeira escolha. O tratamento com cisplatina resulta em uma taxa de resposta de apenas 14% e uma mediana de sobrevida de menos de sete meses . A carboplatina resultou em taxas de resposta semelhantes, variando de 6 a 16% . Na prática clínica, o antifolato pemetrexado, como a única terapêutica aprovada pelo FDA para MPM, é usado em combinação com compostos de platina .
Estudos transversais mostraram a eficácia da avaliação da expressão intratumoral dos membros do metabolismo do ácido fólico para a previsão da resposta terapêutica antifolato multifocada em pacientes com diferentes entidades cancerígenas, mas são discutidos de forma controversa . Como os platina-análogos são compostos genotóxicos que induzem danos no DNA levando à parada do ciclo celular induzida pelo TP53 e apoptose, é basicamente concebível que o mecanismo de reparação do DNA possa ser uma das chaves associadas a uma resposta terapêutica prejudicada. Como a identificação de propriedades moleculares compartilhadas pelos MPMs pode ajudar a superar a má resposta ao tratamento observada, vários estudos abordaram esta questão. Entretanto, as razões para a eficácia bastante ruim dos compostos de platina permanecem em grande parte desconhecidas.
Summing up, nem biomarcadores preditivos confiáveis nem conceitos terapêuticos individualizados para MPMs existem até agora. Portanto, as diretrizes atuais enfatizam a necessidade de terapias inovadoras e inovadoras.
Desde que as mutações do gene TP53 são extremamente raras no MPM , outros mecanismos como a deleção do locus ou alterações epigenéticas podem contribuir para a inativação do TP53 . A superexpressão do MDM2 em alguns tipos de tumor pode levar a uma perda da função reguladora do TP53 nas células cancerígenas pelo seu aumento da degradação proteasomal . P14/ARF, o inibidor fisiológico do MDM2, é reconhecido como um supressor tumoral e contribui para este mecanismo pela indução da parada do ciclo celular, tanto de forma dependente como independente do TP53. Além disso, a regulação do miRNA parece desempenhar um papel importante. Em estudos anteriores, temos demonstrado uma forte superexpressão nuclear do MDM2 em aproximadamente 25% do MPM; esta observação foi restrita ao MPM epitelióide ou aos componentes epitelióides do MPM bifásico. Pacientes com MPM MDM2-positivo mostraram uma significativa diminuição da sobrevida global (SO) e da sobrevida livre de progressão (PFS) em comparação com a MPM MDM2-negativa. Isto pode ser explicado por uma atividade TP53 significativamente reduzida ou completamente abolida e/ou estabilidade mediada por uma superexpressão do MDM2 .
A restauração da atividade TP53, por exemplo, pela inibição do MDM2, pode resultar em uma resposta instantânea de estresse induzido pelo TP53 e/ou danos ao DNA de células cancerígenas. Nutlin-3A (um análogo cis-imidazolina) é um potente e seletivo inibidor de MDM2 com um valor de IC50 de 90nM e previne a interação de MDM2-TP53 ligando-se à bolsa de ligação hidrófoba TP53 de MDM2 .
Assim, o objetivo deste estudo foi testar o efeito da inibição de MDM2 em MPM via Nutlin-3A em comparação com as estratégias quimioterápicas comuns contemporâneas, usando três linhas celulares mostrando diferentes perfis de marcadores relativos ao TP53-status, P14/ARF- e nível de expressão de MDM2.
2. Material e Métodos
2.1. Experimentos com linhas celulares
Baseados na revisão da literatura, as concentrações para os citostáticos foram estimadas (Nutlin-3A , cisplatina , e pemetrexed , respectivamente).
Linhas de células MPM humanas foram obtidas da American Type Culture Collection em 2012-08 (Manassas, VA, EUA). As linhas de células foram autenticadas e testadas para contaminações usando um serviço comercial (Multiplexion, Heidelberg, Alemanha) e foram testadas por último diretamente após o término dos experimentos.
NCI-H2052, NCI-H2452, e MSTO-211H foram cultivadas no meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Invitrogen, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal bovino (Invitrogen) a 37°C em uma atmosfera com 5% de CO2-humidificação. As células foram cultivadas até 85% a 95% de confluência, depois lavadas com tampão fosfato salino (Invitrogen), e tripsinizadas com 1 ml de tripsina 0,05%-0,53 mM de ácido etilenodiaminotetracético, vermelho fenol (Invitrogen). A tripsinização foi interrompida pela adição de meio fresco à reação. Aproximadamente 10 μl foi transferido para um hemocitômetro (BRAND, Wertheim, Alemanha) para fins de contagem de células. 1.000 células por poço (100 μl) foram semeadas em microplacas 96/U (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) adequadas para a detecção de luminescência e fluorescência. As células foram autorizadas a fixar durante a noite a 37°C e 5% de CO2. No dia seguinte, o meio foi removido e o meio fresco contendo ou um dos citostáticos ou sem aditivo foi aplicado em cada poço. Cisplatina (10μM; TEVA, Petah Tikva, Israel) pemetrexada (200μM; Lilly, IN, EUA) e Nutlin-3A (5, 10 ou 20μM; Sigma-Aldrich, MO, EUA) foi aplicada isoladamente ou em combinação. Nutlin-3A teve de ser solubilizado em sulfóxido de dimetilo (Sigma-Aldrich). As concentrações dos citostáticos aplicados estão resumidas na Tabela 1. As culturas celulares contendo citostáticos e meio branco foram incubadas por três dias a 37°C e 5% de CO2. Dentro de 72 horas, necrose, apoptose e viabilidade celular foram avaliadas através dos seguintes ensaios de luminescência: CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega), e CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Os ensaios foram realizados como recomendado pelo fornecedor. Por cada droga citostática e ensaio de luminescência foram medidos pelo menos quatro pontos de dados. A luminescência foi avaliada utilizando um leitor de microplacas SpectraMax Luminescence (Molecular Devices, CA, EUA). A luminescência (unidades luminescentes relativas; RLU) foi medida a 570 nm e o tempo de integração foi ajustado para 1 segundo. A temperatura do SpectraMax L foi mantida entre 21,5°C e 24,5°C durante as medições. Além disso, de cada linha de células foi preparado um bloco FFPE para análise imuno-histoquímica e qPCR.
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2.2. RNA Isolation and Real-Time qPCR
Níveis de expressão de ACTB (gene de referência), MDM2 e P14/ARF, foram investigados por TaqMan real-time qPCR nas três linhas de células MPM. Portanto, o RNA foi isolado através do corte de três a cinco seções do 4μm do bloco FFPE usando um micrótomo (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Alemanha). O RNA total foi isolado usando o kit miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Alemanha) e o protocolo do fabricante, exceto por duas modificações (digestão da proteinase K durante a noite; eluição em 25μl). As concentrações de RNA foram medidas usando espectrometria UV/VIS (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha). O RNA foi armazenado a -80°C. Para a síntese de cDNA, o kit e protocolo iScript Select cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., EUA) foi armazenado a -80°C, CA, EUA) foi usado com uma entrada de 1μg RNA total por reação.
Para qPCR em tempo real, foram usados os Ensaios de Expressão de Gene TaqMan sob Demanda (AoD) para ACTB (Hs03023943_g1), MDM2 (Hs01066942_m1), e P14/ARF (Hs99999189_m1) (Applied Biosystems®; CA, EUA). Os volumes de reação foram modificados usando 50% dos volumes de reação totais recomendados com 50 ng de entrada de cDNA. Cada alvo foi medido em triplicado. Os valores Ct- de P14/ARF e MDM2 foram normalizados para os valores médios de ACTB. O qPCR em tempo real e a análise dos dados foram realizados em um Roche LightCycler 480 II (Roche, Basiléia, Suíça) e software correspondente. Todos os experimentos qPCR em tempo real foram realizados de acordo com as orientações do MIQE .
2,3. Immunohistochemistry
Immunohistochemistry foi realizado de acordo com protocolos padrão usando um corante automático (Ventana Discovery XT, Munique, Alemanha). Após validação em tecidos de referência (lipossarcoma para MDM2, adenocarcinoma pulmonar para TP53), as investigações imunohistoquímicas foram realizadas com anticorpos direcionados contra MDM2 (clone IF2, Calbiochem, Darmstadt, Alemanha, diluição: 1:80) e TP53 (clone BP53-12, Zytomed, Berlim, Alemanha; diluição: 1:5000). O pré-tratamento para recuperação de antígenos foi realizado por aquecimento em água desionizada a pH 6 durante 30 minutos. A expressão das proteínas foi avaliada utilizando um sistema de pontuação IHC de quatro estágios baseado na percentagem de núcleos de células tumorais com uma imunoreacção positiva (Escore 0: sem sinal; Escore 1 (expressão fraca): 1-25%; Escore 2 (expressão moderada): 26-50%; Escore 3 (expressão forte): >50%).
2.4. Análise estatística
Análises estatísticas e gráficas foram realizadas com o ambiente de programação estatística R (v3.4.2).
Para análise entre grupos individuais, foi aplicado o teste Wilcoxon Mann-Whitney rank sum (não paramétrico) ou o teste t de dois lados (paramétrico). Para variáveis ordinais com mais de dois grupos (diferenças de sinal de luminescência entre todos os grupos de tratamento), foi utilizado o teste Kruskal-Wallis (não paramétrico) ou ANOVA (paramétrico) para detectar diferenças entre grupos.
O nível de significância estatística foi definido como p<0.05.
3. Resultados
Os perfis de expressão de MDM2, TP53 e P14/ARF diferem entre as linhas celulares investigadas e estão resumidos na Tabela 2. As varreduras de coloração imunohistoquímica são mostradas na Figura 1; os resultados de qPCR são visualizados na Figura 2. O NCI-H2052 mostrou pronunciada imunoexpressão MDM2, mas pouca expressão de P14/ARF e TP53. Imuno-histoquímica, MSTO-211H não mostrou expressão de MDM2 e P14/ARF, mas TP53-expressão estava presente. NCI-H2452 não mostrou nem MDM2- nem TP53-expressão, mas a expressão de P14/ARF foi detectada. As linhas celulares investigadas representam a constelação molecular que foi relatada em estudos anteriores de pacientes com MPM .
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-: mínima a nenhuma expressão
>+: expressão mensurável +/-: pequena expressão mensurável |
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(a) NCI-H2052, coloração anti-P53
(b) NCI-H2052, coloração anti-MDM2
(c) NCI-H2452, coloração anti-P53
(d) NCI-H2452, coloração anti-MDM2
(e) MSTO-211H, coloração anti-P53
(f) MSTO-211H, coloração anti-MDM2
(a) NCI-H2052, coloração anti-P53
(b) NCI-H2052, coloração anti-MDM2
(c) NCI-H2452, coloração anti-P53
(d) NCI-H2452, coloração anti-MDM2
(e) MSTO-211H, coloração anti-P53
(f) MSTO-211H, coloração anti-MDM2
3.1. Resposta das Linhas Celulares MPM a concentrações de Pemetrexed, Cisplatina e Varying Nutlin-3A
Cisplatina (10μM) e pemetrexed (200μM) como agente único bem como em combinação foram testadas versus três concentrações de Nutlin-3A (5μM, 10μM, e 20μM).
3.1.1. Viabilidade celular
NCI-H2052. Qualquer concentração de Nutlin-3A foi superior na redução da viabilidade celular em relação à cisplatina ou pemetrexada ou sua combinação, respectivamente (p=0,0039). Em contraste, o tratamento com pemetrexed isoladamente mostrou uma viabilidade celular significativamente elevada. O tratamento com cisplatina isoladamente mostrou maior viabilidade celular do que cisplatina e pemetrexado em combinação.
MSTO-211H. A pemetrexia combinada com cisplatina foi associada à maior viabilidade celular, seguida pela cisplatina isolada e a menor concentração de Nutlin-3A (p=0,0952). Pemetrexado combinado com cisplatina reduziu significativamente a viabilidade celular, mas a Nutlin-3A (10μM) exibiu uma redução ligeiramente mais forte. A maior concentração de Nutlin-3A reduziu a viabilidade celular a um mínimo.
NCI-H2452. A concentração mais alta de Nutlin-3A (20μM) reduziu a viabilidade celular a um mínimo (p=0,0017). 10μM Nutlin-3A foi o segundo inibidor de viabilidade celular mais forte seguido por cisplatina sozinha, pemetrexada sozinha, e cisplatina em combinação com pemetrexada. A menor concentração de Nutlin-3A mostrou o impacto mais fraco na redução da viabilidade celular.
Potes para viabilidade celular destacam a diminuição da viabilidade celular com o aumento da concentração de Nutlin-3A nas linhas celulares testadas. Os resultados para todas as linhas celulares em relação à senescência/viabilidade celular estão resumidos nas Figuras 3(a)-3(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3,1.2. Apoptosis
NCI-H2052. Na linha de células NCI-H2052, a maior taxa de apoptose foi encontrada para 20μM Nutlin-3A, enquanto as outras abordagens de tratamento mostraram indução de apoptose semelhante (p=0,14).
MSTO-211H. Na MSTO-211H, as maiores taxas de apoptose foram encontradas para a pemetrose seguida pela pemetrose em combinação com cisplatina e diferentes concentrações de Nutlin-3A (p=0,0219). Quase nenhuma apoptose foi observada apenas para cisplatina e Nutlin-3A.
NCI-H2452. NCI-H2452 revelou a maior taxa de apoptose em resposta à Nutlin-3A na maior concentração (20μM) seguida pela cisplatina (p=0,0359). Foram encontradas taxas de apoptose significativamente menores para os demais citostáticos.
Os resultados para apoptose estão resumidos nas Figuras 4(a)-4(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3,1.3. Necrose
Necrose de células não foi influenciada por nenhuma das quimioterapias em comparação ao controle (dados não mostrados).
3.2. Resposta das Linhas Celulares MPM às Concentrações Variáveis de Nutlin-3A Combinadas com Cisplatina
Em outras experiências, a indução da apoptose foi testada usando um regime Nutlin-3A ou uma combinação de Nutlin-3A e cisplatina. Três combinações de Nutlin-3A (5μM, 10μM e 20μM) mais cisplatina (10μM) foram comparadas com cisplatina (10μM) sozinha, pemetrexada (200μM) sozinha, Nutlin-3A sozinha (10μM) e uma combinação de cisplatina e pemetrexada.
3.2.1. Viabilidade celular
NCI-H2052. Nutlin-3A sozinho e sua combinação com cisplatina mostrou um aumento significativo da indução de senescência em comparação com o outro regime (p=0,0051). Somente 5μM Nutlin-3A em combinação com cisplatina mostrou menor potência de indução de senescência como 5μM Nutlin-3A sem cisplatina. As maiores concentrações de Nutlin-3A (10 e 20μM) com cisplatina reduziram a viabilidade celular a um mínimo. A maior viabilidade celular foi encontrada para o pemetrexado seguido pela combinação de pemetrexado e cisplatina.
MSTO-211H. Qualquer combinação de Nutlin-3A com cisplatina induziu um aumento significativo da senescência celular em relação à cisplatina, pemetrexada, ou uma combinação de ambas (p=0,0059). Contudo, a combinação de cisplatina e pemetrexada mostrou uma eficácia semelhante em comparação com o regime mais baixo de Nutlin-3A/cisplatina e Nutlin-3A apenas. Maiores concentrações de Nutlin-3A combinadas com cisplatina reduziram a viabilidade celular a um mínimo.
NCI-H2452. Nutlin-3A em combinação com cisplatina ou isoladamente foi superior em relação aos outros citostáticos, exceto na menor concentração de 5μM (p=0,0089). Curiosamente, a cisplatina mostrou eficácia comparável a 10μM Nutlin-3A sozinho e cisplatina em combinação com 5μM Nutlin-3A. A maior viabilidade celular foi observada com pemetrexia, cisplatina em combinação com pemetrexia, e 5μM Nutlin-3A. A maior concentração de Nutlin-3A (20μM) com cisplatina mostrou a maior taxa de senescência.
Lotes de viabilidade celular destacam que a viabilidade celular diminuiu com o aumento da concentração da cisplatina/Nutlin-3A nas linhas celulares testadas. Os resultados para senescência/viabilidade celular estão resumidos nas Figuras 3(a)-3(c).
3.2.2. Apoptosis
NCI-H2052. Na linha celular NCI-H2052, maiores concentrações de Nutlin-3A combinadas com cisplatina aplicada induziram a apoptose significativamente aumentada em comparação com a pemetrexada sozinha ou combinada com cisplatina (p=0,0069). As maiores taxas de apoptose foram encontradas para 10μM Nutlin-3A em combinação com cisplatina.
MSTO-211H. A linha celular MSTO-211H apresentou a maior apoptose quando tratada apenas com pemetrexia (p=0,0035). A segunda maior taxa de apoptose foi encontrada para 10μM Nutlin-3A combinado com cisplatina. Pemetrexado em combinação com cisplatina resultou na terceira maior taxa de apoptose. A cisplatina em combinação com 20μM Nutlin-3A foi mais potente que a cisplatina sozinha, Nutlin-3A sozinha, e a menor concentração de Nutlin-3A (5μM) em combinação com cisplatina.
NCI-H2452. As maiores taxas de apoptose foram encontradas para o agente único 20μM Nutlin-3A assim como 10μM e 20μM Nutlin-3A em combinação com cisplatina, seguido por cisplatina (p=0,1).
Os resultados relativos à apoptose estão resumidos nas Figuras 4(a)-4(c).
3.2.3. Necrose
Necrose das células não foi influenciada por nenhuma das quimioterapêuticas em comparação ao controle não tratado (dados não mostrados).
Todos os resultados dos experimentos de inibição da linha celular estão resumidos na Tabela 3.
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(a) Resposta das linhas de células MPM à cisplatina pemetrexada, cisplatina, e Nutlin variável…3A concentrações
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(b) Resposta das linhas de células MPM à variação de Nutlin-3A concentrações combinadas com cisplatina
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4. Discussão
> Em estudos anteriores identificamos o MDM2 como um biomarcador prognóstico em pacientes com MPM e essa expressão é regulada através de miRNA específico. Nutlin-3A inibe a interação MDM2-TP53 e assim induz a parada do ciclo celular, senescência e apoptose, dependendo do tipo celular . Além disso, é uma droga não atóxica que apresenta pouca toxicidade em modelos animais e está associada a um menor risco de resistência do que as drogas convencionais .
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A partir deste contexto, colocamos a hipótese de que a sobreexpressão do MDM2, talvez em combinação com a perda parcial ou completa de P14/ARF, pode ser alvo de um regime terapêutico baseado em Nutlin-3A para restaurar a actividade do TP53 num subgrupo de MPM.
Nesta abordagem in vitro, os efeitos da cisplatina e da pemetrexagem quimioterapêutica de última geração, isoladamente e em combinação, em comparação com Nutlin-3A, foram investigados em três linhas celulares que cobrem o padrão encontrado nos pacientes . Nutlin-3A induziu a senescência de forma eficiente em todas as três linhas celulares MPM e foi superior em comparação à cisplatina e/ou pemetrexada, enquanto que a apoptose só podia ser induzida em altas concentrações. Sabe-se pela literatura, que os efeitos da Nutlin-3A são específicos do tipo celular, induzindo mais a parada do ciclo celular e a senescência do que a apoptose. Assim, investigamos a cisplatina e a Nutlin-3A em combinação para aumentar o estresse celular, induzindo danos no DNA baseado na platina. A combinação de Nutlin-3A com cisplatina resulta em maior apoptose e senescência em relação à Nutlin-3A isoladamente, já que uma das principais funções do TP53 é o dano ao DNA e a resposta ao estresse .
O mesmo mecanismo parece ser verdadeiro quando se combina Nutlin-3A e radioterapia para proporcionar dano celular adicional e deslocar a resposta celular TP53 para a apoptose, já mostrada no carcinoma escamoso esofágico tipo selvagem TP53 in vitro e in vivo . Curiosamente, Shimazu et al. encontraram um efeito inibitório de crescimento adicional na MPM ao combinar Nutlin-3A com metformina, um inibidor do mTOR, sugerindo uma possível conversa cruzada entre a via mTOR- e TP53. Os autores confirmaram nossos achados das linhas celulares NCI-H2052 e MSTO-211H como as melhores respostas à terapia Nutlin-3A, postulando um valor de IC50 de 0,37μM (MSTO-211H) e 0,50μM (NCI-H2052), respectivamente .
Como mencionado anteriormente, a superexpressão do MDM2 pode levar a uma perda da função reguladora do P53 através do aumento da degradação proteasômica. Além de seu inibidor fisiológico P14/ARF, a análise da relação de sinalização entre estes genes indica um papel adicional do RB1 nesta rede de sinalização . Tem sido demonstrado que, além da inibição da interação MDM2-TP53, Nutlin-3A também influencia as interações MDM2-RB1, tornando isto uma possível explicação para os efeitos independentes do TP53 baseados em Nutlin-3A .
Interessantemente, mesmo o baixo MDM2 expressando a linha celular MSTO-211H bem como a linha celular negativa MDM2 e TP53 NCI-H2452 mostra indução de apoptose reduzida mas claramente detectável via Nutlin-3A combinada com cisplatina. Além disso, células imunohistoquímicas negativas têm, como relatado anteriormente, padrão de expressão gênica detectável de MDM2, resultando em concentrações de proteína MDM2 abaixo do limite de detecção de IHC. Hipóteses, como a regulação do MDM2 do TP53 é um mediador essencial da apoptose e do estado celular em uma situação fisiológica, também a inibição da interação TP53-MDM2 a estes baixos níveis de MDM2 terá um efeito benéfico na citotoxicidade dos compostos de platina, explicando os efeitos colaterais ocorridos da terapia com Nutlin-3A. Para NCI-H2452, uma linha celular com ausência de expressão de TP53, o efeito observado deve ser TP53 independentemente e é muito provavelmente baseado nos efeitos inibidores de RB1.
Currentemente, Nutlin-3A é administrado por os como substância R05045337 num ensaio clínico multicêntrico fase I para terapia de neoplasia hematológica . Adicionalmente, o RG7112, um derivado de Nutlin-3A entrou em ensaios clínicos fase I em pacientes com lipossarcomas que são tumores tipo TP53 com MDM2 amplificado . Neste ensaio clínico, o RG7112 foi administrado por os em 20 pacientes em um ambiente neoadjuvante . Um paciente mostrou remissão parcial e 14 mostraram doença estável, mas todos os pacientes sofreram efeitos colaterais como neutropenia . Uma possível explicação pode ser as altas doses de 1440 mg m-2 dia-1 por os . Em estudos in vivo anteriores, a administração oral de Nutlin-3A mostrou várias limitações como altas quantidades de Nutlin-3A (200-400 mg/Kg) e dificuldades na administração destas altas dosagens . É de salientar que foram desenvolvidos sistemas de administração eficientes utilizando polímeros como poli(lacto-coglicolido) (PLGA) e anticorpos monoclonais .
5. Conclusão
Neste estudo in vitro, foi comprovada a nossa hipótese de que o MDM2-overexpressor pode ser alvo de uma quimioterapia à base de Nutlin-3A. Particularmente, para um ajuste ótimo do biomarcador de MDM2-sobre-expressão e baixa/ausência de expressão P14/ARF, foram observadas apoptose e taxas de senescência superiores em comparação com a quimioterapêutica convencional. Mesmo para um ajuste de biomarcador menos ótimo com expressão mínima de MDM2, uma indução favorável de apoptose e senescência foi óbvia para Nutlin-3A em combinação com cisplatina em comparação com o regime de drogas convencionais. Portanto, a abordagem terapêutica baseada em Nutlin-3A poderia ser de grande valor para um subgrupo de pacientes com MPM.
Data Availability
Os dados utilizados para suportar os achados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente mediante solicitação.
Disclosure
Os resultados deste estudo foram apresentados no German Cancer Consortium (DKTK), 1º Simpósio Translacional de Oncologia Essen (ETOS) (Essen, 2018), e 33º Congresso Alemão de Oncologia (Berlim, 2018).
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Avalores
O estudo foi financiado pelo Instituto de Patologia, Hospital Universitário Essen, e Ruhrlandklinik Essen.