Drosophila lines
Several lines (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP, e UAS-tdTomato) foram obtidos do Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) e MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) foram fornecidos por B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD), e DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) foram fornecidos por G. Rubin (Janelia Research Campus).
Geração de Act88F:Rpr construct e flies
Actin88F:Rpr strains (Act88F:Rpr flies) foram gerados usando um Actin88F:eGFP construct29. A linha Act88F:GFP, que abriga uma construção eGFP impulsionada por uma região 2053 bp do promotor actin88F, foi obtida de R. Benton (Universidade de Lausanne). Uma construção Act88F:Rpr foi gerada inicialmente usando o seguinte par de primer, para adicionar um site de restrição KpnI ao final de um clone rpr cDNA (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) e um site XbaI ao final do quadro de leitura aberto 3′, através de um kit de mutagênese direcionado ao site QuikChange (Agilent Technologies):
Primeiro em frente 5′ AGACGGTACCATGGCAGTGGCATTC 3′
Primeiro em frente 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGGGCTT 3′
A construção Rpr foi então emendada no Act88F:A construção eGFP atrás do promotor da Act88F no lugar da sequência eGFP. A construção Act88F:Rpr foi injetada em embriões Attp18 Drosophila para transgênese PhiC31 integrado-mediada local específico35 (transgene cytolocation 6C12 local de aterrissagem) pela BestGene Inc. (Chino Hills, CA). Para alguns experimentos, este transgene foi combinado com UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (gerado no laboratório do M.H.D.).
Fluorescência de músculos de vôo indireto
Microscopia fluorescente de hemi-águas foi realizada36,37. Em resumo, as moscas foram anestesiadas e suas cabeças e abdômens foram então removidos. As taças foram fixadas durante a noite em paraformaldeído a 4% a 4 °C e enxaguadas em solução salina tampão fosfato 1× (PBS) no dia seguinte. Os espécimes foram dispostos em uma lâmina de vidro, congelados em nitrogênio líquido e bissetados no plano médio-sagital usando uma lâmina de barbear. Os IFMs foram corados com Phalloidin Alexa-Fluor 568 (1:100 em PBS com 0,1% de Triton-X (PBST)) durante a noite a 4 °C, enxaguados com PBS e visualizados usando EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) com ampliação de ×4. Para imagens de montagem inteira de miofibrilas IFM, as moscas foram preparadas e os espinhos bifurcados como descrito acima. Hemi-thoraces foram corados com Phalloidin Alexa-Fluor 568 (1:100 em PBST) durante a noite a 4 °C. As amostras foram enxaguadas em PBS, montadas com Vectashield (Vector Laboratories) e visualizadas usando um microscópio confocal Leica TCS SPE RGBV (Leica Microsystems) com ampliação de 100x.
Immunofluorescência de cérebro e cordas nervosas ventrais
Cérebros e VNCs foram dissecados de 2-3 moscas fêmeas dpe em PBS. Os tecidos foram então fixados por 20 min em paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente. Após a fixação, os cérebros e VNCs foram lavados 2-3 vezes em PBS com 1% de Triton-X-100 (PBST) durante 10 min cada e depois incubados a 4 °C durante a noite em PBST. As amostras foram então colocadas em PBST com 5% de soro normal de cabra (PBSTS) durante 20 min à temperatura ambiente. Em seguida foram incubadas com anticorpos primários (coelho anti-GFP a 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; rato anti-Bruchpilot/nc82 a 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) diluídos em PBSTS durante 48 h a 4 °C. Os cérebros e VNCs foram lavados 2-3 vezes em PBST durante 10 min cada antes da incubação com anticorpos secundários (anticorpo secundário de cabra anti-coelho conjugado com Alexa 488 a 1:500; Thermofisher; anticorpo secundário de cabra anti-rato conjugado com Alexa 633 a 1:500; Thermofisher) diluído em PBSTS durante 48 h a 4 °C. Finalmente, os cérebros e VNCs foram enxaguados 2-3 vezes durante 10 min cada em PBST e montados em diapositivos com lamelas de cobertura de ponte em Slowfade mounting-media (Thermofisher).
Amostras foram imitadas usando um Microscópio Confocal de Varrimento a Laser Carl Zeiss LSM 700 com as seguintes configurações: ampliação ×20, faixa dinâmica de 8 bits, média de imagem 2×, 0,52 × 0,52 μm tamanho de pixel, 0,57 μm intervalo de z-passos. As projeções de desvio z padrão dos volumes de imagem foram feitas usando Fiji38. Para comparar a expressão de GFP no sistema nervoso central, a intensidade do laser e os ganhos de PMT para o canal verde foram mantidos constantes através de amostras do tipo selvagem, A1 > GFP e Act88F:GFP.
Expressão de GFPmaging nos músculos das pernas
Pernas foram dissecadas manualmente na articulação corpo-coxa e montadas em lâminas de vidro usando fita dupla-face. O suporte de montagem Slowfade (Thermofisher) foi então adicionado ao espaço entre o deslizamento da tampa e a lâmina. Em seguida, registramos a fluorescência GFP no canal verde usando um microscópio confocal de varredura a laser LSM 700 (Zeiss). A intensidade do laser, os ganhos de PMT e os parâmetros de varredura foram mantidos constantes através do tipo selvagem, MHC > GFP e Act88F:GFP animais: ampliação ×20, faixa dinâmica de 8 bits, média de imagem ×8, tamanho de pixel de 0,63 × 0,63 µm, e intervalo de 10 µm em passos z. A autofluorescência cuticular também foi registrada no canal vermelho.
Dissecção torácica para imagem VNC
Custom holders usados para montar moscas durante a imagem foram fabricados como descrito anteriormente39. Para imagens VNC, estes estágios foram modificados para ter (i) calços de aço planos em vez de dobrados, e (ii) vértices chanfrados para tornar a esteira esférica visível aos sensores de fluxo óptico (Shapeways, ‘file’). Os calços de aço foram fabricados em aço inoxidável 0,001″, recozido macio tipo 316 (McMaster-Carr, parte #2317K11). Os calços foram gravados (Etchit, Buffalo, MN) para gerar furos retangulares, como explicado ‘aqui’. O arquivo de desenho do calço pode ser encontrado ‘aqui’.
Todos os experimentos foram realizados em moscas fêmeas de 1-3 dpe levantadas a 25 °C em comida padrão de farinha de milho em um ciclo de 12 h claro:12 h escuro. As moscas foram anestesiadas a 4 °C. Uma mosca fêmea foi seleccionada e, em alguns casos, as suas asas foram cortadas para simplificar o processo de montagem. O tórax dorsal da mosca foi então empurrado através de um buraco no calço de aço da fase de imagem. O estágio foi então virado, cola de cura UV (Bondic, Aurora, ON Canada) foi cuidadosamente aplicada ao redor do perímetro do tórax e curada por iluminação UV (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). A cola UV foi então utilizada para fixar a cabeça e o abdómen na parte inferior do palco. O estágio foi então preenchido com soro fisiológico extracelular18. Sob um microscópio de dissecção de alta magnificação (Leica M165C), uma agulha hipodérmica (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) foi utilizada para cortar e levantar a cutícula do tórax dorsal40, tendo o cuidado de não cortar o conectivo do pescoço. Posteriormente, em animais não-Act88F:Rpr, um par de pinças baço foi usado para remover IFMs, predominantemente da região anterior-medial do tórax sobrevoando o intestino (este passo é desnecessário em animais Act88F:Rpr). Este processo expõe a superfície dorsal do proventriculus – uma grande estrutura intestinal bulbosa. Com muito cuidado, uma pinça super fina foi então usada para agarrar e levantar o proventrículo para deslocar grande parte do intestino (incluindo a cultura e glândulas salivares) do tecido nervoso mais localizado ventralmente. Com o intestino assim elevado, foram usadas tesouras ultra-finas (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) para transgredi-lo na sua secção mais anterior. O provériculus foi então descascado para trás e uma incisão posterior foi feita para remover completamente estas porções do intestino, revelando o tecido nervoso subjacente. Notavelmente, esta dissecção também remove a aorta, restringindo o fluxo hemolinférico do vaso dorsal abdominal. No entanto, descobrimos que as moscas eram viáveis e se comportavam por até 4 h. Em alguns casos, observamos que o intestino ou tecido muscular começaria a obscurecer a VNC durante a imagem. Portanto, o tecido solto deve ser removido nesta fase, tomando muito cuidado para não cortar a VNC. Após cada dissecção, examinamos até que ponto o animal movimentava suas pernas em resposta a um sopro de ar ou agarrava um objeto com cada uma de suas pernas. Isto provou ser um preditor preciso do sucesso da preparação. Para avaliar a qualidade de uma dissecação, examinamos os movimentos de cada perna na esteira esférica. Se uma mosca podia andar de forma coordenada, a dissecação era considerada bem sucedida. Caso contrário, o animal foi categorizado como tendo uma deficiência nos movimentos dos membros. Animais com múltiplas pernas disfuncionais foram categorizados como incapacitados.
2-fótons microscopia durante o comportamento
Experimentos foram realizados no período noturno Zeitgeber (Z.T.) e os animais foram tipicamente imitados 30-60 min após a dissecção. Os porta moscas foram fixados a uma plataforma elevada sobre a esteira esférica (Fig. 3a suplementar). O VNC foi então localizado usando microscópio ocular e posicionado no centro do campo de visão por imagens de 2-fótons.
A esteira esférica é uma haste de alumínio com um furo em forma de bola fresado em uma extremidade22. Fabricamos bolas de espuma com 10 mm de diâmetro (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA USA) e as manchamos manualmente usando uma caneta Rapidograph (Koh-I-Noor, Leeds, MA USA) para fornecer características de alto contraste para medições de fluxo óptico. Um fluxo de 500-600 mL min-1 de ar filtrado e umidificado foi passado através do suporte usando um controlador de fluxo digital (Sierra Instruments, Monterey, CA USA). Os movimentos da esfera foram medidos usando dois sensores de fluxo óptico (ADNS3080) equipados com lentes de zoom (Computar MLM3X-MP, Cary, NC EUA). A esfera e a mosca foram iluminadas usando um par de LEDs IR (850-nm de comprimento de onda de pico) acoplados a fibras ópticas e lentes colimadoras (ThorLabs, Newton, NJ USA). As medidas de fluxo óptico foram passadas para uma placa microcontroladora (Arduino Mega2560) para serem gravadas usando código Python personalizado. Simultaneamente, foram feitas gravações de vídeo de animais comportando-se na bola usando uma câmera firewire sensível ao infravermelho (Basler, Ahrensburg, Alemanha) a aproximadamente 30 fps.
Fizemos microscopia de 2-fótons usando um microscópio Bergamo II (ThorLabs) equipado com dois detectores GaAsP PMT para imagens GCaMP6 e tdTomato e acoplado a um laser Ti:Sapphire (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA EUA) afinado a 930 nm. Usamos uma lente objetiva Olympus 20× de imersão em água com 1.0 NA (Olympus, Center Valley, PA EUA). O microscópio foi controlado usando o software ThorImage (ThorLabs). Foram realizadas experiências com imagens de secção coronal no modo de imagem Galvo-Galvo a 6-9 Hz. Este framerate variou com o tamanho da imagem que variou entre 26,58 × 26,58 µm e 53,15 × 53,15 µm. A potência do laser variou entre 3 mW e 5,7 mW. A imagem volumétrica também é possível com hardware apropriado (por exemplo, scanner Galvo-Resonance e colar objetivo Piezo-driven).
Ocasionalmente, um sopro de ar foi usado para eliciar comportamentos de caminhada. Estes sopros foram codificados digitalmente (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). O software ROS personalizado fez interface através de um dispositivo de saída analógico (Phidgets, Calgary, Canadá) com o software ThorSync (ThorLabs) para sincronizar medidas de fluxo óptico, videografia de comportamento, medidas de sopro de ar, e aquisição de imagens de 2-fotões. Para imagens de seção coronal, um colar Piezo (Physik Instrumente, Karlsruhe, Alemanha) foi usado para controlar movimentos rápidos do eixo z da lente objetiva do microscópio.
Para comparar a atividade neural entre os animais de controle e Act88F:Rpr, adquirimos imagens de 512 × 512 pixels a 1,7 fps usando uma intensidade de laser constante e ganho de PMT. As regiões de imagem selecionadas foram escolhidas empiricamente como cortes horizontais consistindo de pontos de referência observados a ~61-65 µm de profundidade no Filme Suplementar 1,
Caminhando com ou sem dissecção
Para avaliar os efeitos da dissecção na locomoção, os animais do tipo selvagem foram submetidos ao seguinte procedimento. Os animais foram montados em estágios de imagem e a soro fisiológico foi adicionado a cada estágio. Apenas um subconjunto aleatório de animais foi dissecado. Cada mosca montada foi então colocada na esteira esférica e os seus comportamentos de marcha foram registados durante 30 min. O fluxo óptico foi registrado como descrito acima. Para aumentar a probabilidade de locomoção, um pulso de 500 ms de 100% CO2 foi dirigido para as antenas da mosca com um intervalo de um minuto entre pulsos (0,05 ln min-1 usando um controlador de fluxo de massa; Vögtlin Instruments, Suíça).
Enestimulação da antena laser infravermelha
Para comparar os comportamentos de marcha entre Act88F:Rpr e animais de controle, estimulamos suas antenas com um laser de 830 nm próximo ao infravermelho (Schäfter + Kirchhoff, Alemanha). Primeiro anestesiamos os animais fêmeas de 7-8 dpe a 4 °C e os montamos em estágios de imagem. As moscas foram então aclimatadas durante 10 minutos. Para cada experiência, um animal recebeu dez pulsos de estimulação laser de 2 s (18,1 mW) para sua antena direita em um intervalo de 60 s entre os pulsos. Controle e Act88F:Animais Rpr foram testados em alternância para minimizar os efeitos do tempo circadiano nas comparações comportamentais.
Estatisticas
Tamanhos de amostra para experimentos com animais foram escolhidos da seguinte forma: realizamos pelo menos três experimentos para ilustrar os registros populacionais e neurais esparsos e realizamos mais de dez experimentos por grupo ao realizar comparações estatísticas. Um critério pré-estabelecido de sinais fluorescentes de baixo sinal-ruído resultou na remoção de dois experimentos MDN do nosso conjunto de dados. Não foi utilizada randomização ou cegueira. Para a estimulação antennal a laser, os dados não foram normalmente distribuídos, portanto foram realizados os testes U de Friedman e Mann-Whitney. Estimativas de variação são apresentadas como média e intervalos de confiança de 95%.
Análise de dados
Analisamos todos os dados usando scripts Python personalizados. Como a frequência de aquisição de dados diferiu para fluxo óptico, videografia comportamental e imagens de 2-fotões, interpolamos sinais para corresponder aos da maior frequência. Posteriormente, os dados de fluxo óptico foram suavizados usando uma média de execução (janela = 200 ms) e então traduzidos em rotações s-1 para eixos anterior-posterior, medial-lateral e yaw22. Para tornar essas medidas mais intuitivas, as rotações s-1 foram então convertidas em mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) para os movimentos anterior-posterior (vforward) e medial-lateral (vside) e em graus s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) para os movimentos de guinada (vrotation)22,
A análise da locomoção em animais dissecados (Figura Complementar 2) foi realizada da seguinte forma. Os dados de fluxo óptico de Vforward para 20 moscas dissecadas e 20 não dissecadas foram reduzidos para 1500 pontos s-1 e suavizados usando uma média de duração de 0,2 s. Para calcular a porcentagem de tempo caminhando para frente/atrás, ou caminhando lateralmente dois limiares, -0,31 mm s-1 e +0,31 mm s-1, foram empiricamente definidos para diferenciar entre caminhar parado e caminhar para frente (direita) ou para trás (esquerda), respectivamente. Valores acima de 0,31mm s-1 foram considerados momentos de marcha para frente (direita) e valores abaixo de -0,31mm s-1 foram considerados momentos de marcha para trás (esquerda). Os valores de fluxo óptico entre esses limiares foram considerados momentos de parada. A percentagem de tempo de marcha foi calculada como a proporção de pontos de dados em que um animal não foi considerado em pé parado. Da mesma forma, limiares de 10,8 e -10,8 graus s-1 foram utilizados para definir os momentos de viragem. Um momento foi definido como um período contínuo de caminhada ou viragem.
Grandes deformações teciduais poderiam ocorrer durante o comportamento. Portanto, realizamos o registro de imagem pan-neuronal post-hoc (Fig. 2). Registramos todos os quadros de um experimento de imagem em uma imagem de referência. Como a complexidade das deformações não pôde ser capturada usando modelos simples de movimento paramétrico (por exemplo, transformações afins), usamos uma abordagem não paramétrica, variacional, projetada para modelar deformações arbitrariamente complexas. Calculamos o campo de movimento w entre a imagem de referência, denotado Ir, e a imagem no tempo t, denotado It, resolvendo o problema da minimização
where D(w) é um termo de ajuste de dados, o segundo termo é uma regularização promovendo a suavidade do w penalizando seu gradiente ∇w41, Ω é o domínio da imagem discreta, e o parâmetro λ equilibra as contribuições dos dois termos.
GCaMP6s imagens apresentam um desafio para a estimativa de movimento porque a atividade neural produz grandes mudanças de intensidade local. Portanto, usamos um fluoróforo independente de atividade adicional, tdTomato, e definimos um termo de dados da forma
O primeiro termo modela a hipótese padrão de conservação de intensidade ao longo da trajetória de cada pixel. É definido por
onde usamos uma norma para ganhar robustez parcial às mudanças de intensidade42. O segundo termo em Eq. (2) é uma restrição de correspondência de características inspirada por Revaud e colegas de trabalho43, escrita como
In Eqs. (2)-(4), Ir e It são do canal tdTomato. Minimizando a função ϕ favorece que os vetores de movimento w(x) estejam próximos às correspondências m(x, Ir, It), computadas em um conjunto esparso de pontos-chave relevantes. Obtemos m com o algoritmo de correspondência de características proposto pela Revaud e colaboradores43, que é especificamente projetado para lidar com grandes deformações de imagem. Nós calculamos m usando o canal de imagem tdTomato, de tal forma que as correspondências também são insensíveis às mudanças de intensidade entre Ir e It. Como resultado, a estimativa é guiada por correspondências de características confiáveis. O parâmetro γ equilibra os dois termos em Eq. (2).
Para cada experimento, otimizamos os valores para λ e γ usando uma busca em grade para registrar imagens da seção horizontal do VNC (Fig. 4 Suplementar). Como função objetiva para otimização, utilizamos o gradiente da média temporal da imagem44. Pequenos valores de λ (ou seja, λ < 1000), ocasionalmente levaram a artefatos nas imagens registradas. Estes artefatos foram associados a forte convergência no campo vetorial w(x) (Fig. 4c suplementar). Portanto, nós definimos empiricamente artefatos como clusters de pixels com {\mathrm{div},{\mathbf{w}}}esquerda({\mathbf{x}}} < – 1,2}) e cardinalidade >20 (obtivemos resultados semelhantes com cardinalidade >5). Finalmente, selecionamos os valores de λ e γ como aqueles sem artefatos e com o maior gradiente da imagem média. Amostra de imagens não registradas, campos vetoriais de transformação e imagens registradas dos três exemplos otimizados são mostrados no Filme Complementar 5.
Resolvemos o problema de otimização em Eq. (1) com um algoritmo de multiplicador de direção alternada (ADMM)45. Introduzimos duas variáveis de partição, associadas à regularização e ao termo de correspondência de características, respectivamente. Cada sub-problema do algoritmo foi resolvido de forma analítica. Utilizamos partes da biblioteca de problemas inversos descrita na ref. 46. Um pós-processamento baseado na filtragem da mediana ponderada foi aplicado usando o método de47,
Na Fig. 2, os comportamentos foram anotados semi-automaticamente, usando um módulo Python personalizado. Este módulo permite que o usuário selecione duas regiões de interesse (ROIs) no primeiro frame do vídeo. O primeiro ROI é usado para detectar o andar e deve ser posicionado sobre as pernas metatorácicas e mesotorácicas. O segundo ROI é responsável por detectar o grooming pro-torácico das pernas e deve ser posicionado em frente à mosca. Para detectar movimento nessas regiões, são subtraídas armações consecutivas. As imagens diferenciais resultantes são então desfocadas medianamente (raio = 5 pixels), para reduzir o ruído. Com base nesta imagem desfocada, é aplicado um limiar no número de pixels não zeros em cada um dos dois ROIs para extrair sequências binárias de grooming e walking bouts. Note que os movimentos protorácicos das pernas observados durante a caminhada são ignorados (ou seja, a classificação de grooming é subserviente à classificação de caminhada). Um filtro de histerese foi então aplicado em seqüências comportamentais binárias de filtro passa-baixo e para remover transições que ocorrem sobre muito poucos quadros para serem biologicamente plausíveis. Exemplos de ROIs e anotações comportamentais são ilustrados no Filme Complementar 6. Estes dados comportamentais foram usados na Fig. 2, como mostrado no Filme Complementar 2. Ele foi anotado usando os seguintes parâmetros: limiar para caminhada = 400, limiar para grooming = 5, comprimento da histerese para caminhada = 8, comprimento da histerese para grooming = 10.
Para a Fig. 2b, c, usamos a regressão linear para encontrar regiões no VNC associadas a caminhada ou grooming. Os regressores Xw e Xg (para caminhada e grooming, respectivamente) foram construídos a partir das duas sequências comportamentais, Sw e Sg, usando Eq. (5) por convolução com um sinal de Cálcio em decadência exponencial Resposta ao Impulso (CIR) derivado da constante de tempo medida para GCaMP6s (t½ = 1.1448 s)19.
As funções alvo foram traços pixel-wise ∆F/F, onde ∆F = Ft – F. Ft é a fluorescência no momento, t. F é um sinal de fluorescência de base medido como o valor médio de pixel para as primeiras dez imagens sequenciais GCaMP6s em que nenhuma atividade celular foi observada (ou seja fluorescência mínima e imutável dos GCaMP6s).
Os pesos do regressor foram calculados usando Eq. (6).
where y is the pixel-wise ∆F/F trace.
Figure 2b, c mostra mapas de calor dos pesos do regressor, ww para andar e wg para o grooming, normalizados para os seus respectivos máximos. O ROI 1 foi escolhido como uma região do mapa de calor com um peso alto para o grooming, mas um peso baixo para o grooming. O ROI 2 foi escolhido como a localização espacial com o maior valor de ww. Cada ROI abrange uma região com um raio de 15 pixels.
Para identificar dados de imagens neurais esparsas do processo (Figs. 3-5), os ROIs foram inicialmente selecionados usando scripts Python personalizados que dependiam de bibliotecas OpenCV e Numpy. Para isso, foi selecionado um quadro de referência para o qual o software identificou todos os ROIs potenciais. Para fazer isso, a imagem do GCaMP6s foi suavizada para reduzir o ruído de fundo e então um limiar de filtro Otsu foi aplicado à imagem. Um fator de erosão foi então aplicado em todos os objetos detectados dentro da imagem. Os contornos de todos os objetos detectados foram então apresentados ao usuário para seleção manual. Uma vez selecionados esses ROIs de referência para neurônios esquerdo e direito, usamos um algoritmo de registro de imagem baseado em correlação cruzada48 para identificar os ROIs mais prováveis à esquerda e à direita para cada quadro de imagem com base naqueles selecionados manualmente no quadro de referência. Um segundo script foi usado para verificar manualmente os ROIs selecionados automaticamente e, se incorreto, para exibir todos os ROIs potenciais dentro do quadro para seleção manual. Se os valores de erosão produziam ROIs mal-formados, outro script foi usado para posicionar manualmente ROIs elípticas de orientação arbitrária em qualquer frame. Finalmente, imagens ROI binárias foram usadas como uma máscara de imagem para extrair sinais fluorescentes médios das imagens GCaMP6s ou tdTomato originais. Estes sinais foram reportados como %∆R/R como em ref. 49 para reduzir os efeitos do movimento em nossas medidas. Devido à ausência de estímulos, a linha de base R foi calculada como a razão mínima de GCaMP6s/tdTomato dentro de um bin.2,5 s.
Para detectar aumentos transitórios na atividade, desenvolvemos um algoritmo baseado parcialmente na ref. 50. Primeiro determinamos quando a primeira derivada do sinal %∆R/R cruzou um limiar, que foi determinado pelo exame de todos os valores derivados para uma determinada classe de neurônio (MDN, MAN, ou A1). Argumentamos que os valores limiares devem ser característicos e potencialmente diferentes para cada tipo de neurônio porque a dinâmica de fluorescência está relacionada a propriedades fisiológicas intrínsecas que podem diferir entre classes de neurônios, mas não entre experimentos de uma única classe. Nós estabelecemos esse limiar como o percentil 97,5 para MDNs e dMANs e o percentil 90 para neurônios A1. Um valor de limiar inferior foi selecionado para os neurônios A1 porque muitos outros transitórios fluorescentes foram observados em traços A1. Esses transientes teriam sido negligenciados usando um limiar de 97,5° percentil. Para identificar o início do aumento da fluorescência encontramos o ponto de tempo anterior mais próximo onde a derivada cruzou zero. Este cruzamento zero é considerado o ponto de tempo de um ‘evento’ associado com o aumento de fluorescência identificado. Os eventos detectados próximos uns dos outros, sem nenhuma interferência da derivada zero-crossing, foram comprimidos em um evento associado ao primeiro ponto de tempo. Havia ~10 experimentos separados por animal. Os eventos no primeiro e último 10 s de cada experimento não foram considerados uma vez que a janela de apresentação de dados abrangia 10 s antes e 10 s depois de cada evento.
Porque as atividades MDN e dMAN esquerda e direita foram fortemente covariadas (Fig. 5 Suplementar), uma etapa adicional foi realizada para a detecção de eventos: se os eventos fossem detectados tanto nos neurônios esquerdo e direito dentro de 2 s um do outro, ambos os eventos seriam mantidos; caso contrário, um evento identificado para o neurônio A (por exemplo esquerda MDN) e não para o neurônio B (por exemplo, MDN direito) também foi adicionado à biblioteca de eventos do neurônio B.
Por contraste, as atividades da esquerda e da direita A1 não covariaram fortemente. Portanto, os eventos foram associados a um e não ao outro neurônio. Para isso, se um evento foi detectado para os neurônios A1 esquerdo e direito dentro de uma janela de tempo de 0,25 s, nenhum dos eventos foi usado para análise.
%∆R/R e os traços de fluxo óptico ligados a cada evento foram alinhados ajustando os pontos de tempo do evento para 0 s. Em seguida, calculamos a média e iniciamos intervalos de 95% de confiança para esses traços alinhados usando a biblioteca Python Seaborn. O fluxo óptico e as medidas de %∆R/R foram reduzidos para 500 valores s-1 para esta análise. Para aumentar a clareza, os traços %∆R/R foram subtraídos da baselina para torná-los zero no momento do evento nos painéis de resumo (Figs. 3d, 4d e 5d, e). Controle, dados embaralhados (traços cinza) foram computados atribuindo-se, em vez disso, pontos de tempo aleatórios no lugar de eventos reais, identificados. Esses pontos de tempo aleatórios foram tratados como eventos reais e sua média e intervalos de confiança de 95% foram calculados e plotados para comparação.
Análise de co-variância (Fig. 5) foi realizada usando um script Python personalizado que dependia das bibliotecas Matplotlib e Numpy. Gráficos de dispersão foram computados para comparar os valores de neurônio esquerdo e direito %∆R/R de todos os experimentos para cada mosca separadamente. Os valores r de Pearson são reportados como média ± desvio padrão.
Comportamentos relacionados a eventos (Filmes Suplementares 8, 10, 12 e 13) foram selecionados manualmente de eventos detectados automaticamente, como descrito acima. Para dMANs, os eventos foram selecionados entre aqueles que maximizaram a diferença nas rotações de bola anterior-posterior entre 1 s antes e 2 s após o evento. Para MDNs, os eventos foram selecionados entre aqueles que minimizaram as rotações de bolas anteriores-posteriores até 2 s após o evento. Para neurônios A1, foram selecionados eventos entre aqueles que maximizaram a média de rotações da bola de guinada (positivos para os neurônios A1 da esquerda e negativos para os da direita) para até 2 s após os eventos.
Na Fig. 8 Complementar, as respostas à estimulação laser quase infravermelha foram calculadas como média em 10 testes para cada animal. O fluxo óptico foi reduzido para 500 valores s-1. A média e os intervalos de confiança de 95% para traços de fluxo óptico foram medidos e traçados usando a biblioteca Python Seaborn. A biblioteca Python Scipy foi usada para realizar os testes Friedman e Mann-Whitney U-tests.