GroEL/GroES ciclismo: ATP liga-se a um anel aberto antes da proteína do substrato favorecendo a ligação protéica e a produção do estado nativo

Resultados

Ligação do ATP Rápido à GroEL como Revelado pelas Mudanças de Intensidade de Fluorescência da GroEL F44C rotulada com Verde Oregon 488.

Para monitorar a ligação de ATP pela GroEL, contamos com uma variante GroEL previamente produzida, F44C, contendo uma única cisteína em uma versão “cisteína zero” da GroEL na qual todas as 3 cisteínas naturais da subunidade GroEL (aminoácidos 138, 458 e 519) haviam sido substituídas por alanina (21). Como ilustrado na Fig. 1A, F44 encontra-se em um laço apontando para cima na cavidade central do GroEL ao nível do domínio equatorial, posicionado entre os antiparalelos equatoriais β – cordões próximos cujas extremidades são resíduos que formam contatos de ligação de hidrogênio com o fosfato terminal de ATP ligado através de uma molécula de água e um íon de potássio. O laço e o resíduo 44 são assim dispostos para serem afetados pela ausência vs. presença de ATP. Um estudo anterior relatou que uma substituição de F44W poderia relatar a ligação de ATP (16). Aqui, utilizamos o mutante, F44C, que anteriormente tinha sido observado como sendo totalmente funcional, como indicado pela capacidade do seu plasmídeo codificador para resgatar o crescimento de um mutante GroEL-deficiente e pela capacidade da proteína purificada para realizar uma redobramento eficiente da proteína ATP/GroES-dependente in vitro (21). F44C foi rotulado com Oregon Green 488 (OG488)-maleimida a um nível de ocupação de ≈70%. Permaneceu totalmente funcional na redobramento mediador da desidrogenase de malato (MDH) in vitro, exibindo cinética quase idêntica à do WT GroEL. A taxa de rotação estável do ATP pelo mutante modificado, chamado EL44-OG, também se assemelhava à do WT GroEL (Fig. S1B).

Espectro de emissão de fluorescência de EL44-OG (excitado a 496 nm) revelou que a adição de ATP produziu uma grande queda na intensidade de fluorescência em estado estacionário (≈65% em 500 μM ATP), acompanhada por um pequeno deslocamento azul do máximo de emissão (Fig. 1B). Em contraste, o ADP produziu uma menor queda de intensidade, suportando que o γ-fosfato de ATP tem um efeito específico na conformação do laço 44-contido.

Em mistura de 0,5 mM ATP com EL44-OG, foi observada uma queda rápida da intensidade de emissão, com uma curva que poderia ser encaixada como a soma de 2 exponenciais, um com uma constante de taxa de ≈100 s-1 e outro com uma constante de taxa de 4 s-1 (Fig. 1C). A primeira taxa indica interação rápida de ATP com GroEL não-ligado e corresponde a taxas reportadas anteriormente tanto para F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1) quanto para 2 outras versões de GroEL com substituição de triptofano: Y485W, onde um triptofano foi substituído em outro lugar no domínio equatorial (ref. 18; 123 ± 2 s-1), e R231W (ref. 17; 80 s-1), onde um triptofano foi substituído no aspecto de cavidade do domínio apical (GroEL é de outra forma desprovido de triptofano). Como esperado, a taxa de interação de ATP com EL44-OG foi dependente da concentração de ATP (Fig. 1D), e uma constante de taxa bimolecular de 2 × 105 M-1 s-1 foi determinada para a fase mais rápida. A fase cinética mais lenta, também dependente da concentração de ATP, provavelmente corresponde à terceira fase fluorescente observada para o R231W da GroEL e Y485W na ligação de ATP (17, 18). A possibilidade desta fase reflectir a hidrólise de ATP foi excluída através da utilização de um chaperonin D398A/EL44-OG hidrólise-defectivo.

Alteração Rápida da Fluorescência na ligação ATP para o Anel Trans Aberto do Complexo Assimétrico GroEL/GroES/ADP.

Em condições fisiológicas, o estado de aceitação normal para ATP é o anel trans aberto de um complexo assimétrico GroEL/GroES/ADP. Com a mistura de fluxo parado, observamos que a taxa de ligação do ATP ao anel trans dos complexos EL44-OG/GroES/ADP foi semelhante à de um anel GroEL não iluminado (Fig. 1E, compare com a Fig. 1F). Aqui, também houve dependência de concentração de ATP semelhante à do EL44-OG nãoigandado (Fig. 1D).

Substrato de Polipéptido Ligado ao Anel Trans Não Afeta a Taxa de Ligação de ATP.

Em vários estudos in vitro, o polipéptido não nativo foi primeiramente complexado ao anel trans aberto de um complexo assimétrico de ADP GroEL/GroES antes da adição de ATP e GroES em excesso (8, 9). Nestas condições, a ligação ATP seguida da ligação de GroES é claramente capaz de encapsular o polipéptido não nativo e de dobrar directamente a produção. A taxa de ligação de ATP em tal contexto é afectada pela proteína do substrato ligado? Para testar isto, a MDH não nativa foi ligada aos complexos assimétricos EL44-OG/GroES/ADP, e o ATP foi então adicionado com a mistura de fluxo parado. Nestas condições, a taxa de alteração da intensidade de fluorescência foi praticamente idêntica à do complexo EL44-OG/GroES/ADP na ausência de polipeptídio (compare a Fig. 1G com a Fig. 1E). Assim, a presença de um substrato não nativo ligado aos domínios apicais do anel trans não tem qualquer efeito detectável na rápida entrada do ATP nos bolsos de ligação do nucleotídeo equatorial do anel trans.

Movimento do Domínio Apical Rápido Acompanha a ligação do ATP.

Quando o ATP se liga rapidamente ao GroEL, isso causa um ajuste significativo nos domínios de ligação apical de polipeptídeos na mesma escala de tempo rápida, ou as alterações apicais em resposta à ligação ATP são relativamente lentas, de tal forma que os efeitos da ligação ATP devem ser considerados como ocorrendo num momento posterior? O estudo anterior do R231W já tinha indicado que os efeitos apicais ocorreram rapidamente com aquele mutante (17). Também no presente estudo, uma sonda fluorescente no aspecto exterior dos domínios apicais, remota do local de ligação ATP no interior do cilindro (GroEL E315C num fundo cisteina-zero rotulado com OG), mostrou uma mudança rápida na intensidade de fluorescência, na mesma escala de tempo que a ligação ATP. Por exemplo, foi observada uma constante de taxa de 20 s-1 para um complexo assimétrico GroEL315-OG/GroES/ADP a uma concentração de ATP de 150 μM (Fig. 1H, compare com 25 s-1 na Fig. 1E). Tais alterações apicais ocorreram no mesmo anel ao qual o ATP está ligado, pois a análise de uma versão com anel único modificado para OG de E315C, SR315-OG, mostrou uma taxa semelhante de alteração da intensidade de fluorescência (Fig. 1I). A taxa de movimento apical também foi dependente da concentração de ATP, com as taxas paralelas às da ligação de ATP (Fig. S2, compare com a Fig. 1D).

Relativamente lenta ligação de poliptídeo de substrato como medido pelo FRET.

Para permitir uma comparação da taxa de ligação de poliptídeo de substrato não nativo com a de ATP de ligação, medimos em seguida a taxa de ligação de proteínas de substrato a complexos assimétricos GroEL/GroES/ADP usando FRET. Foram estudadas três proteínas de substrato diferentes: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa), e uma forma dupla de proteína de ligação de maltose (DM-MBP; 41 kDa). Todas as 3 proteínas se comportam como proteínas de substrato rigorosas a 25 °C, exigindo a presença de GroEL, GroES, e ATP para alcançar a forma nativa (3). Na sua ausência, segue-se uma agregação quantitativa. Para a monitorização da ligação, a FRET foi medida entre proteínas do substrato rotulado com coumarin propil maleimida (CPM; doador) sobre um resíduo de cisteína (ver Materiais e Métodos) e EL44-OG (aceitador). Excitando ao máximo a excitação para CPM (384 nm), foram coletados espectros de emissão para os substratos marcados com CPM (doador) enquanto ligado ao GroEL não marcado (Fig. 2A, DM-MBP-CPM como exemplo, traço preto), para EL44-OG complexado com substrato não marcado (Fig. 2A, aceitador marcado com traço azul), ou para complexos com substrato marcado com CPM ligado ao EL44-OG (Fig. 2A, traço vermelho). Para ambos DM-MBP-CPM e MDH-CPM, houve forte resfriamento do doador na associação com EL44-OG; ao mesmo tempo, houve o aparecimento de um sinal de aceitador substancial.

Em mistura com fluxo parado de 125 nM DM-MBP-CPM com 125 nM EL44-OG, foi observada uma queda na intensidade de emissão do doador, com uma curva que poderia ser ajustada como a soma de 2 exponenciais, um com uma constante de taxa de 1,33 s-1 e o outro com uma constante de taxa de 0,65 s-1 (Fig. 2B). A taxa mais rápida (k1) dependia da concentração de chaperonin (Fig. 2C), mas a mais lenta não o era. A uma concentração GroEL de 125 nM (Fig. 2B), a taxa de ligação do polipéptido de substrato (k1 = 1,33 s-1) é 60 vezes mais lenta que a taxa de ligação ATP (100 s-1 a 500 μM ATP; Fig. 1C). Embora a taxa de ligação do substrato fosse prevista para ser várias vezes maior na concentração fisiológica de GroEL de 1-2 μM (Fig. 2C), a taxa de ligação ATP também seria provavelmente um pouco maior, considerando que a concentração fisiológica de ATP é vários milimolares (Fig. 1D). Assim, a taxa de chegada de ATP sob condições fisiológicas provavelmente seria pelo menos 10 vezes maior do que a chegada do substrato.

Em um outro teste, a adição de ATP ao mesmo tempo que o DM-MBP rotulado fluorescentemente teve um efeito reprodutível de aumentar a taxa de ligação DM-MBP (Fig. 2D e Tabela S2). Em suma, a ordem fisiológica de adição a um anel trans parece compreender uma rápida chegada de ATP seguida de uma chegada mais lenta da proteína do substrato. Esta ordem é oposta à programada em estudos recentes, onde o polipéptido foi inicialmente ligado ao anel trans e o ATP foi então adicionado (8, 9). A ordem de adição tem algum efeito mensurável na redobramento da proteína do substrato? Para testar isso, realizamos experimentos de ordem de adição e medimos a recuperação da enzima nativa sob condições essencialmente de um único retorno.

Mais Extensa Recuperação do Estado Nativo Quando ATP é Adicionado Primeiro, Seguido de Poliptídeo, Comparado com a Ordem Oposta.

Um experimento de ordem de adição foi realizado usando a versão de anel único de GroEL, SR1, permitindo a análise “single-round”. O poliptídeo capturado pelo SR1 é quase quantitativamente dobrado para a forma nativa, após a ligação do GroES, dentro da cavidade cis de longa duração do complexo estável SR1/GroES (10, 11). Assim, o SR1 poderia ser incubado com ATP e polipéptido não nativo em qualquer ordem, seguido da adição de GroES, e a extensão da recuperação da proteína nativa poderia ser medida em relação tanto à ordem de adição como ao intervalo entre as adições (Fig. 3A). Para estes testes, o GroES foi adicionado 2 seg após ATP/polipéptido para permitir a conclusão das interações iniciais. Em um experimento inicial, observamos reprodutivamente que quando Rubisco não nativo foi adicionado primeiro seguido 2 seg depois por ATP, a extensão da recuperação de Rubisco na forma nativa foi apenas ≈30%. Isto comparado com >60% de recuperação quando o ATP foi adicionado primeiro e com a recuperação de ≈70% observada quando o ATP e o GroES foram adicionados a um complexo binário Rubisco-SR1 pré-formado (produzido por uma incubação de 10 minutos de Rubisco não nativo com SR1). Isto sugere que no contexto de uma reacção cíclica em que o anel trans de um complexo GroEL/GroES/ADP aceitante está aberto e disponível para ligação de polipeptídeos para apenas ≈1-2 s antes da ligação do GroES, a mobilização dos seus domínios apicais pela ligação rápida de ATP favorece a ligação de polipeptídeos não nativos. A ordem oposta, adição de polipeptídeo 2 s antes do ATP, pareceu ser menos favorável para a encadernação, apesar de os domínios apicais mobilizados com ATP estarem subsequentemente disponíveis por 2 s antes da adição do GroES. Notavelmente, quando o intervalo entre as adições de Rubisco e ATP foi aumentado para 4 s (Fig. 3A), o efeito de ordem de adição foi aliviado, com a cinética e a extensão da recuperação agora igualada à da adição de ATP primeiro, presumivelmente em função de uma ligação mais extensa de polipeptídeos durante o intervalo antes da adição de ATP. Embora a extensão da recuperação do Rubisco nos estudos de ordem de adição com intervalo de 2-s tenha sido significativamente afetada, a cinética de recuperação do estado nativo dentro dos complexos SR1/GroES estáveis foi semelhante, consistente com um efeito na ligação protéica do substrato e não na taxa de dobramento na câmara encapsulada.

Mais Extensa Ligação do Rubisco com ATP Adicionado Primeiro.

Para abordar o efeito da ordem de adição na ligação da proteína do substrato, utilizámos Rubisco com rótulo 35S e medimos a quantidade que se tornou ligada por SR1 durante as incubações da ordem de adição utilizando a filtração em gel das misturas do produto final para separar os complexos estáveis SR1/GroES/Rubisco do polipéptido não ligado. Isto revelou que ≈10,000 cpm 35S-Rubisco tinha ligado quando 40,000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) foi adicionado 2 seg antes de ATP e que ≈30,000 cpm tinha ligado quando ATP foi adicionado 2 seg antes de Rubisco (Fig. 3B). Esta última extensão de ligação também foi alcançada quando complexos binários SR1-Rubisco formados durante um período de 10 min foram então incubados com ATP e GroES juntos (Fig. 3B). Estas medidas da extensão da ligação do substrato paralela à extensão da recuperação da actividade enzimática (compare a Fig. 3B com a Fig. 3A) e apoiam a conclusão de que no contexto de um intervalo de 2-s entre a adição de ATP/polipéptido, a adição de ATP favorece inicialmente uma ligação mais eficiente da proteína do substrato.

Greater Rate of Rubisco Binding to an ATP-Exposed Chaperonin Ring.

A observação anterior de uma maior extensão de ligação Rubisco numa experiência de ordem de adição em que o ATP é adicionado inicialmente sugere que a taxa de associação de Rubisco com domínios apicais ATP-mobilizados pode ser maior. Para testar isto, uma versão D398A do SR1 com OG acoplado a um cisteína substituída na posição 44 (num fundo C138A) foi utilizada pela FRET para relatar a taxa de ligação do Rubisco marcado com CPM (Fig. 3 C-E). Observamos que a taxa de ligação de Rubisco, realizada com as mesmas condições dos experimentos de ordem de adição anteriores, foi 2 vezes maior na presença vs. ausência de ATP (compare a Fig. 3D com a Fig. 3C). Quando ATP e Rubisco não nativo foram adicionados simultaneamente, reflectindo a situação fisiológica, a taxa de ligação de Rubisco assemelhava-se à de quando ATP tinha sido adicionado antes de Rubisco (Fig. 3E, compare com a Fig. 3D). Estes dados suportam que Rubisco associa mais rapidamente com um anel cujos domínios apicais foram ATP-mobilizados e que, em condições fisiológicas em que tanto ATP como substrato não nativo estão presentes, são os domínios apicais ATP-mobilizados que são operativos na ligação do substrato.