Frontiers | Myosin Light Chain Kinase: A Potential Target for Treatment of Inflammatory Diseases | Pharmacology

Em mamíferos, a miosina light chain kinase (MLCK) é codificada pelos genes mylk1 e mylk2 (Herring et al., 2006). mylk2 codifica uma isoforma MLCK que é exclusivamente expressa em células musculares esqueléticas (Herring et al., 2006; Wang L. et al., 2016). Devido à falta de dados sobre os produtos de codificação do gene mylk2, discutimos principalmente os produtos do gene mylk1, que incluem a cadeia longa MLCK (220 kDa), a cadeia curta MLCK (130 kDa), e a proteína não-catalítica carboxi-terminal (17 kDa), telokina (Chen et al, 2013; Chen C. et al., 2014; An et al., 2015). Os produtos codificadores do gene mylk1 são expressos em diversos tipos de células e tecidos, incluindo músculo, plaquetas e células secretoras e cerebrais (Jin et al., 2002). Numerosas atividades celulares, tais como contração, adesão, migração celular e formação de barreira epitelial ocorrem em uma cadeia leve reguladora da miosina (MLC) dependente ou independente da fosforilação (Chen et al., 2013; Chen C. et al., 2014; Kim e Helfman, 2016). A expressão anormal da MLCK tem sido observada em muitas doenças inflamatórias, incluindo pancreatite (Shi et al., 2014), doenças respiratórias (Zhou et al., 2015), doenças cardiovasculares (Cheng et al., 2015), cancro (Zhou et al., 2014) e doença inflamatória intestinal (IBD) (Yi et al., 2014). É discutido o envolvimento da MLCK e da via de sinalização da MLCK que está subjacente às doenças inflamatórias representativas. Algumas doenças nas quais a MLCK está envolvida estão listadas na Tabela 1.

TABLE 1

TABLE 1. Papel da miosina cinase leve (MLCK) em doenças selecionadas.

MLCK em Doenças Respiratórias, Aterosclerose e Pancreatite

Em doenças inflamatórias pulmonares, danos à integridade da barreira celular endotelial pulmonar alteram a permeabilidade vascular, e inundação alveolar freqüentemente resulta (Mao et al., 2015). A expressão anormal da MLCK ocorre na lesão pulmonar, e o inibidor ML-7 da MLCK ou deleção do gene MLCK pode atenuar a lesão pulmonar (Wang T. et al., 2016). A MLCK tem atividade similar na lesão asmática e na inflamação pulmonar, e a variação do gene MYLK está fortemente associada à lesão pulmonar aguda e à suscetibilidade à asma (Wang et al., 2014, 2015; Wang T. et al., 2016).

A disfunção da barreira endotelial induzida pela MLCK também está envolvida na pancreatite e aterosclerose (Cheng et al., 2015; Wang et al., 2014; Wang T. et al., 2016). A pancreatite aguda grave está associada a alta morbidade e mortalidade. Sua patogênese não é completamente compreendida (Zerem, 2014), mas a expressão da MLCK está significativamente aumentada em modelos de ratos de pancreatite aguda (Shi et al., 2014), e a elevação do fator de necrose tumoral (TNF)-α na pancreatite aguda grave tem demonstrado mediar a regulação do citoesqueleto dependente da MLCK, levando à destruição da função da barreira endotelial (Shi et al., 2014; Yu et al., 2016). O início e desenvolvimento da aterosclerose frequentemente leva à lesão vascular progressiva, que é acompanhada por disfunção endotelial (Phinikaridou et al., 2015). O envolvimento da MLCK na história natural da aterosclerose tem sido confirmado pelo alívio da lesão vascular e da aterosclerose por ML-7, um inibidor da MLCK (Cheng et al, 2015).

MLCK no desenvolvimento do câncer

Expressão anormal da MLCK tem sido observada em linhas de células cancerosas do pâncreas, pulmão e próstata (Tohtong et al., 2003; Nagaraj et al., 2010; Chen et al., 2011). São necessárias mudanças rápidas e dinâmicas do citoesqueleto para a invasão e metástase das células cancerígenas. A fosforilação da miosina citosesquelética II dependente de MLCK aumenta o potencial metastático das células tumorais, e o rearranjo do citoesqueleto dependente de MLCK modula as funções da barreira endotelial vascular associada à angiogênese, que é um passo crítico no desenvolvimento do câncer (Dudek e Garcia, 2001). Por outro lado, o potencial metastático das células cancerosas da mama é aumentado pela perda de MLCK (Kim e Helfman, 2016). Alterações na migração e adesão celular também são passos iniciais característicos na inflamação, mas há poucos relatos de regulação da MLCK na migração celular inflamatória.

MCLK na DII

Doença inflamatória intestinal, incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn, é caracterizada por inflamação gastrointestinal crônica, e está associada a uma deficiência significativa do paciente e altos custos de tratamento (Rai et al., 2015). Embora a patogênese da DII permaneça obscura, há evidências de que a disfunção da barreira intestinal é o principal fator propulsor (Hindryckx e Laukens, 2012; Pastorelli et al., 2015). A disfunção da junção estreita leva a danos na barreira intestinal, o que permite a passagem de diversos patógenos (Jin e Blikslager, 2016). As junções estreitas consistem em proteínas transmembranas, como as oclusinas e claudinas e as proteínas da membrana periférica, ou seja, proteínas zonula ocludentes (Van Itallie e Anderson, 2014). As junções estreitas estão localizadas na região apicolateral das células endoteliais e estão ligadas a um anel de actomiosina perijuncional. A fosforilação de actomiosina perijuncional induzida por MLCK mede a perda de junção apertada, que pode desencadear o início e desenvolvimento da DII. A expressão e atividade da MLCK é aumentada na DII humana e está associada à evidência histológica da atividade da doença (Blair et al., 2006). A elevação anormal da MLCK também tem sido observada na colite experimental induzida pela administração de dextranas sulfato de sódio ou administração intracolônica de ácido trinitrobenzenossulfônico (Su et al., 2013; Xiong et al, 2016).

MLCK Ativação na DII

TNF-α é uma citocina pró-inflamatória que causa disfunção da barreira de junção apertada intestinal, que é central para a patogênese da DII (Saleh et al., 2016). Na DII, a sinalização mediada pelo receptor 2 de TNF (R2) contribui para o aumento da expressão epitelial MLCK (Su et al., 2013; Suzuki et al., 2014). Em um relatório recente de Al-Sadi et al. (2013), a permeabilidade apertada da junção das monocamadas de células Caco-2, em um modelo in vitro de epitélio intestinal, foi aumentada pela ativação de TNF-α do caminho de sinalização ERK1/2. Ativação da via ERK1/2 de fosforilação induzida pelo fator de transcrição de domínio ETS Elk-1. O Elk-1 activado passou então para o núcleo e ligado ao promotor MLCK, resultando finalmente na expressão epitelial MLCK. LIGHT (proteína induzível semelhante à linfotoxina que compete com a glicoproteína D para a entrada do vírus do herpes nas células T) é um membro do núcleo da família TNF que está envolvido na patogénese da IBD humana (Krause et al.., 2014), e no epitélio de cultura, a inibição da MLCK aliviou a perda da barreira induzida pela IL-1β, o que sugeriu que a perda da barreira epitelial induzida pela IL-COPY17 pode depender da ativação da MLCK (Schwarz et al., 2007).

Aumento da permeabilidade da junção apertada por meio de IL-1β-aumento da expressão da MLCK tem sido demonstrado em doenças inflamatórias (Beard et al., 2014). Na migração de células-tronco mesenquimais, a IL-1β demonstrou causar um aumento na expressão epitelial da MLCK através da ativação da via PKCd/NF-κB; também estimulou a atividade da MLCK através da via de sinalização PKCa/MEK/ERK (Lin et al, 2014).

IFN-γ também foi associada à ativação da MLCK, promovendo a adesão e a internalização de bactérias comensais por meio de uma escova com borda epitelial ativada por MLCK (Wu et al., 2014). Contudo, tal como no caso da regulação mediada por LIGHT da MLCK, é necessário um estudo adicional da regulação mediada por INF-γ da MLCK para determinar se esta é directa. As vias de sinalização associadas à regulação da MLCK são mostradas na Figura Complementar S1.

MLCK-Associated Signaling Pathways That Can Trigger IBD

In IBD, a disfunção da barreira epitelial induzida pela MLCK é desencadeada por duas vias de sinalização. Primeiro, no intestino, o epitélio forma uma barreira contra patógenos no lúmen. A expressão anormal da MLCK em doenças inflamatórias gastrointestinais leva à fosforilação da cadeia luminosa reguladora da miosina II (MLC), contração do anel da actomiosina e aumento da permeabilidade intestinal (Yi et al., 2015). Assim, a fosforilação da MLCK dependente da MLCK é um mecanismo essencial subjacente à disfunção da barreira epitelial induzida pela MLCK. Um segundo mecanismo envolve a upregulação estimulada por MLCK da claudina-2 e endocitose oclusal (Su et al., 2013; Jin e Blikslager, 2016). O aumento da expressão da claudina-2 tem sido associado à disfunção da barreira epitelial intestinal (Hu et al., 2015; Krishnan et al., 2015), assim como a diminuição da absorção, diarréia com fluxo de fuga e respostas inflamatórias (Hu et al., 2015). A desregulação da oclusina na DII diminui a permeabilidade gastrointestinal, o que pode perturbar a integridade da barreira contra uma variedade de patógenos (Yin et al., 2015).

Potencial Pathological Role of Smooth Muscle MLCK in IBD

Músculo liso (sm) MLCK é transcrito do mesmo gene que o epitelial MLCK. Ele está envolvido na regulação da contração do sm, e a variação do conteúdo smMLCK leva a distúrbios de motilidade (Chen et al., 2015). Os distúrbios de motilidade secundariamente causam crescimento anormal da flora intestinal, o que por sua vez agrava a patogênese da inflamação intestinal (Chen D. et al., 2014; Welch et al., 2014). Se existe um efeito direto da smMLCK em doenças inflamatórias precisa de mais estudos.

Inibidores MLCK com potencial uso farmacêutico

Myosin light chain kinase tem domínios catalíticos, inibitórios e calmodulino-ligantes (Chang et al., 2016). A atividade do domínio catalítico pode ser revelada pela digestão triéptica parcial, e pode ser bloqueada por inibidores MLCK (Luck and Choh, 2011; Chang et al., 2016). Os inibidores MLCK actuam por ligação competitiva no local de ligação ATP ou próximo deste na molécula MLCK (Saitoh et al., 1987; Luck e Choh, 2011). A MLCK tem sido extensivamente estudada em sm, mas está amplamente distribuída em células e tecidos animais. Consequentemente, determinar as atividades da MLCK em outros tecidos é fundamental; os inibidores da MLCK são boas ferramentas para isso. Os inibidores da MLCK também têm potencial farmacológico como vasodilatadores e agentes anti-inflamatórios. Alguns inibidores da MLCK, suas origens e evidências de efeito farmacológico estão listados na Tabela 2.

TABLE 2

TABLE 2. Os inibidores de miosina da cadeia leve cinase com potencial uso farmacêutico.

ML-9 e ML-7

ML-9 é um inibidor clássico da MLCK (IC50 = 3,8 μM), o qual foi encontrado para inibir tanto a smMLCK dependente de Ca2+-calmodulina quanto a smMLCK -independente (Saitoh et al., 1987; Shi et al., 2007). Tanto o ML-9 quanto seus derivados sintéticos são bons inibidores seletivos da smMLCK (Ito et al., 2004). O ML-9 demonstrou reduzir a pressão intra-ocular em olhos de coelho (Honjo et al., 2002).

Um outro inibidor da MLCK, ML-7 , é um agente permeável à membrana (Shi et al., 2007). Ambos ML-9 e ML-7 são derivados de naftaleno sulfonamida (Shi et al., 2007). A inibição do ML-7 é mais de 30 vezes mais potente que a do ML-9 (IC50 = 300 nM) (Shi et al., 2007). No entanto, em comparação com a ML-9, a inibição específica de MLCK da smMLCK e outras isoformas MLCK podem ser menos potentes (Saitoh et al., 1987). Os efeitos benéficos da ML-7 foram demonstrados em muitas condições, incluindo isquemia/reperfusão cardíaca (Lin et al., 2012; Zhang et al., 2015), IBD (Cheng et al., 2015), e aterosclerose (Cheng et al., 2015), 2015).

Inibidores de produtos microbianos de MLCK

K-252a, um alcalóide microbiano purificado de culturas microbianas, é um inibidor não selectivo de MLCK (Nakanishi et al., 1992), bem como de outras quinases proteicas incluindo a proteína quinase C e algumas quinases proteicas cíclicas dependentes de nucleotídeos (Nakanishi et al., 1992). KT592 é um derivado de K-252a com maior seletividade. A Wortmannin, isolada e purificada da cepa fúngica Talaromyces wortmannin KY12420, é outro inibidor do produto microbiano da MLCK (Nakanishi et al., 1992), Tem demonstrado diminuir as respostas secretoras em células medulares adrenais de rato através da inibição da MLCK (Warashina, 2000) e ter actividade antifúngica, hemorrágica e anti-inflamatória que pode não estar relacionada com a inibição da MLCK (Nakanishi et al., 1992). Os potenciais efeitos farmacológicos desses inibidores justificam mais estudos.

Inibidores Potenciais Inibidores da MLCK que Ocorram Naturalmente

Como mostrado na Tabela 2, alguns constituintes bioativos que ocorrem naturalmente podem ser inibidores da MLCK. Em um sistema in vitro que inclui miosina purificada e MLCK, a quercetina inibiu a fosforilação da miosina. A inibição pode ser bloqueada pelo inibidor de MLCK ML-7, indicando que a quercetina pode ser um inibidor direto de MLCK (Zhang et al., 2006). Em um modelo animal de distúrbio de motilidade intestinal, a administração de capsaicina diminuiu significativamente a expressão da MLCK, o que também implica a MLCK como alvo de inibição pela capsaicina (Chen et al., 2015). A inibição em resposta ao ácido salvianolico B pode ser indireta; outros sinais estão envolvidos. O ácido salvianólico B diminui a expressão de MLCK pela upregulação do microRNA1 (Xiong et al., 2016). A upregulação do microRNA-374a, microRNA-155, miR-520c-3p e miR-1290 também reduz a expressão de MLCK em vários tecidos (Adyshev et al., 2013; Weber et al., 2014). Compostos bioativos naturais que atuam indiretamente através de microRNAs são uma via alternativa de inibição. Entretanto, experimentos farmacológicos específicos da doença são necessários para confirmar os efeitos de potenciais inibidores naturais da MLCK.

Sumário

Esta revisão resume as evidências para o papel da MLCK em doenças inflamatórias, especialmente a DII. A expressão anormal da MLCK está envolvida em diversos eventos patológicos, principalmente por causar alterações citoesqueléticas que interrompem a função da barreira epitelial. O efeito dos agentes anti-MLCK em doenças inflamatórias específicas depende do grau em que a função endotelial está envolvida. A prevenção dos efeitos secundários relacionados com o tratamento é uma consideração fundamental porque a MLCK é abundantemente expressa em muitos tecidos. A consideração de dois aspectos da seletividade ajuda a antecipar e prevenir os efeitos colaterais dos inibidores da MLCK. O primeiro é a inibição seletiva da MLCK e outras quinases proteicas como a proteína quinase C e a proteína quinase cíclica dependente de nucleotídeos; o outro é a inibição seletiva das diferentes isoformas da MLCK como a smMLCK e a nmMLCK. Os potenciais agentes farmacêuticos anti-MLCK oferecem uma nova visão do tratamento de doenças inflamatórias que difere da terapia anti-inflamatória tradicional.

Contribuições dos autores

Conceberam e desenharam a revisão: DC. Verificação das referências: DC, YX, CW, LW, ZZ, e LS. Redigiu o artigo e o revisou de forma crítica para conteúdo intelectual importante: DC, YX, CW, LW, ZZ, e LS. O manuscrito foi aprovado por todos os autores.

Conflict of Interest Statement

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Confirmações

Este estudo foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (subsídio número 81600440, 81273919) e Dalian Municipal Medical Research Foundation.

Material Suplementar

O Material Suplementar para este artigo pode ser encontrado online em: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2017.00292/full#supplementary-material

FIGURA S1 |Mecanismos subjacentes à regulação da função de barreira endotelial induzida pela MLCK são mostrados. Setas sólidas indicam interação direta e setas pontilhadas indicam interações indiretas.

Adyshev, D. M., Moldobaeva, N., Mapes, B., Elangovan, V., e Garcia, J. G. (2013). MicroRNA regulação da expressão da cadeia leve da miosina não-músculo cinase no endotélio pulmonar humano. Am. J. Respir. Mol. celular. Biol. 49, 58-66. doi: 10.1165/rcmb.2012-0397OC