Frontiers in Immunology

Esta revisão do ponto de vista está organizada em torno de duas figuras tabeladas, uma resumindo os achados de autoanticorpos NMDAR1 (AB) e integrando-os em um modelo explicativo (Figura 1) e a outra tentando dar recomendações claras para o processo de decisão clínica sobre o tratamento imunossupressor com base no presente estado de conhecimento (Figura 2).

Por favor note que a nova nomenclatura GluN1 para NMDAR1/NR1 é desconsiderada aqui por consistência com a maioria da respectiva literatura revisada.

NMDA Receptores em Cérebro e Periferia

N-metil-d-aspartato receptores (NMDAR) são canais de íons com glutamato, abundantemente expressos em cérebro de mamíferos (1). Eles formam heterômeros das subunidades NR1, NR2 e NR3, sendo a NR1 o único parceiro obrigatório. Os NMDAR são fundamentais para a regulação da função neuronal/synapse e também são expressos por tipos de células não neuronais no cérebro como astrócitos, oligodendrócitos, ou células endoteliais (2-5). Além disso, a expressão periférica tem sido relatada, por exemplo, no trato gastrointestinal ou em células imunes (6).

Anti-NMDAR Encefalite

Autoanticorpos da classe imunoglobulina G (IgG) dirigidos contra NMDAR1 foram originalmente ligados a uma condição chamada “encefalite anti-NMDAR” (7-10). Em 2007, Dalmau e colegas descreveram pela primeira vez uma síndrome paraneoplásica, baseada em 12 mulheres com teratoma ovariano, portadoras de IgG AB contra as subunidades NMDAR NR1/2. A síndrome consistiu de psicose, declínio cognitivo, crises epiléticas, discinesia, diminuição da consciência e instabilidade autonômica. Os autores relataram em muitas publicações subsequentes, com base no número crescente de indivíduos com encefalite anti-NMDAR, títulos séricos e de líquido cefalorraquidiano (LCR) elevados de NMDAR1-AB da classe IgG nesta condição, bem como resposta frequentemente favorável à terapia imunossupressora (7-10). Como mecanismo fisiopatológico síndrome-pertinente, o NMDAR1-AB induziu a diminuição das correntes mediadas por NMDAR, devido a uma melhor internalização dos receptores e, portanto, a redução da expressão superficial (11). Entretanto, durante vários anos, sujeitos saudáveis não foram sequer investigados em números apreciáveis para a soroprevalência NMDAR1-AB. Entretanto, a presença de NMDAR1-AB da classe IgG no soro (não apenas no LCR) foi e ainda é alegada como sendo específica da doença (7-10), causando alguma confusão na literatura e infelizmente também na prática clínica.

Syndromes Reminiscente do Antagonismo NMDAR1

Desde que a hipofunção NMDAR tinha sido hipotética como sendo um mecanismo central na esquizofrenia, devido à indução de sintomas psicóticos por antagonistas (12, 13), a questão surgiu há vários anos atrás se uma subpopulação de sujeitos esquizofrênicos poderia ser previamente negligenciada nos casos de encefalite anti-NMDAR. Até agora, a literatura – baseada principalmente em amostras pequenas e seguindo a “alegação original de especificidade de doença de NMDAR1-AB da classe IgG” – produziu resultados discordantes (14-20). Analogamente, outras condições patológicas, igualmente reminiscentes do antagonismo NMDAR, como epilepsia ou demência, foram investigadas pela presença de NMDAR1-AB. Apareceu uma enchente de publicações – muitos deles relatos de casos – descrevendo associações de NMDAR1-AB com uma grande variedade de síndromes. Finalmente, NMDAR1-AB de outras classes de imunoglobulina (Ig) (IgM e IgA) também foram relatadas como associadas a condições da doença (17, 21-23). Uma questão interessante que permanece totalmente aberta até agora é se o NMDAR1-AB também pode levar a “fenótipos periféricos”, considerando a expressão do NMDAR em órgãos e tecidos periféricos (6).

Distribuição equitativa do soro NMDAR1-AB através da saúde e da doença

Unexpectativa, trabalho recente nosso e de outros em conjunto >5.000 indivíduos desafiaram a “reivindicação de especificidade de doença” de qualquer NMDAR1-AB, demonstrando seroprevalência dependente da idade até >20% NMDAR1-AB, incluindo IgM, IgA e IgG, tanto em indivíduos saudáveis como doentes. Curiosamente, o NMDAR1-AB da classe IgE foi pesquisado, mas nunca detectado (24). As doenças investigadas nesses estudos compreendem condições neuropsiquiátricas (esquizofrenia, distúrbios afetivos, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral, esclerose múltipla e distúrbios de personalidade), bem como condições médicas gerais, por exemplo, diabetes ou hipertensão arterial (24-28). Também a faixa de titulação NMDAR1-AB no soro e a distribuição das classes de Ig foram comparáveis em todos os grupos de doenças investigadas, bem como em indivíduos saudáveis (24-28). Qualquer pessoa de 40 anos tem ~10% e qualquer pessoa de 80 anos tem ~20% de chance de exibir seropositividade NMDAR1-AB (24).

Funcionalidade do NMDAR1-AB

Esta descoberta surpreendente levantou a questão de se estes AB são todos funcionais. Desde os mosaicos biochip e um ensaio baseado em células, o procedimento padrão clínico (células HEK293T transfectadas com NMDAR1 e AB secundário contra IgG, IgM ou IgA humano; Euroimmun, Lübeck, Alemanha), foram usados para todas essas determinações NMDAR1-AB (ver também abaixo), ensaios adicionais tiveram que ser realizados para consolidar ainda mais essas descobertas imprevistas, provando a funcionalidade do AB. Estes ensaios in vitro (todos realizados com soros após a precipitação de imunoglobulinas de sulfato de amónio e diálise) revelaram efeitos semelhantes do NMDAR1-AB, independentemente da internalização dos receptores da classe Ig em neurónios humanos derivados de IPSC, bem como em neurónios primários de ratos. Da mesma forma, NMDAR1-AB de todas as classes de Ig reduziu as correntes evocadas pelo glutamato na NR1-1b/NR2A expressando oócitos Xenopus laevis (26, 28, 29). Estudos in vivo em camundongos e humanos sugerem efeitos comparáveis do soro NMDAR1-AB de todas as classes de Ig em relação à modulação das funções cerebrais (veja mais detalhes abaixo).

Métodos de detecção de AB – Sala de Parada para Melhoria

Um problema ainda pendente de padronização é a diversidade de métodos aplicados para determinação de AB com diferentes especificidade e sensibilidade. Em relação ao NMDAR1-AB (onde temos a mais sólida experiência própria), os ensaios baseados em células são certamente o método superior para detectar o NMDAR1-AB uma vez que os epitopes são expostos de forma natural para permitir que o AB os detecte especificamente. Mas mesmo esses ensaios diferem, com alguns autores usando células vivas transfectadas transientemente aceitando sua variabilidade potencial e problemas de variação de lote para lote, ao contrário de outros usando células fixas e permeabilizadas expressando toda a subunidade NMDAR1, provavelmente permitindo uma melhor padronização (Euroimmun). Este último ensaio está actualmente a ser utilizado em todo o mundo para diagnosticar a encefalite NMDAR1-AB. Com base em nossa própria experiência com este ensaio em associação com estudos de funcionalidade realizados em paralelo (internalização de receptores, eletrofisiologia e estudos in vivo), ele parece ser o método mais confiável neste momento. No entanto, é fortemente recomendado o uso deste ensaio em combinação com AB secundário que são altamente específicos para as várias classes de Ig (IgG anti-humana, IgA anti-humana e IgM anti-humana) uma vez que o AB de reacção cruzada pode levar a conclusões erradas em relação, por exemplo, à prevalência de AB IgG. O uso de secções do cérebro de rato, rato, humano ou macaco para a detecção imunohistoquímica de AB específicos pode ser uma adição útil, fornecendo evidência de apoio. Em contraste, o típico ELISA baseado em peptídeos não pode ser recomendado como método de detecção para NMDAR1-AB, uma vez que muitos resultados falso-positivos e/ou falso-negativos podem ser obtidos devido à exposição não natural (removida da posição na membrana celular) epitopada. Estes ensaios parecem adequados apenas para análises de acompanhamento, por exemplo, a determinação do curso de titulação do AB usando uma série de amostras do mesmo doador, previamente claramente diagnosticadas como soropositivas por ensaios baseados em células e funcionais.

A Papel Decisivo da Barreira Cerebral Sanguínea (BBB) para Relevância Sindrómica

Interrogando-se por que tantos portadores de NMDAR1-AB séricos permanecem saudáveis, nós colocamos a hipótese de que um BBB comprometido poderia decidir sobre sua significância fisiopatológica. É importante notar que a permeabilidade melhorada do BBB pode diferir regionalmente, explicando assim as consequências sintomáticas individualmente variáveis (30). Como modelo animal, estudamos os ratos ApoE-/- com fugas conhecidas de BBB em comparação com os animais de ninhada do tipo selvagem (31). A injeção intravenosa de frações de Ig purificadas de indivíduos humanos seropositivos NMDAR-AB (IgM, IgG e IgA) levou a alterações na atividade espontânea de campo aberto e resposta hipersensível (relacionada à psicose) ao MK-801 em campo aberto exclusivamente em camundongos ApoE-/- (28). Explorando o papel de um BBB comprometido posteriormente também em humanos, vimos de fato sintomas neurológicos mais graves em portadores de NMDAR1-AB (de qualquer classe de Ig) com histórico de complicações no nascimento ou neurotrauma, condições com provável vazamento crônico de BBB (28). Na mesma linha, investigamos portadores do APOE4 desde que o haplótipo APOE4 foi associado a um BBB permeável (32, 33). Obtivemos primeiros indícios de que o NMDAR-AB pode aumentar delírios de grandiosidade e mania em portadores do APOE4 neuropsiquiátricos, que são então mais provavelmente diagnosticados como esquizoafetivos (29). Um papel modificador do NMDAR1-AB pré-existente em circulação (novamente de todas as classes) também foi visto no derrame isquêmico humano. Em pacientes com BBB intacto antes da ocorrência do insulto, os NMDAR1-AB eram protetores em relação à evolução do tamanho da lesão, enquanto em portadores de APOE4, os NMDAR1-AB estavam associados a maiores volumes de insulto (24). Esses achados enfatizam que não apenas o grau, mas também a duração da disfunção BBB, aguda versus crônica, pode desempenhar um papel fundamental na formação da síndrome pelo NMDAR1-AB.

O Cérebro como Imunoprecipitador do NMDAR1-AB

Circulando o NMDAR1-AB de todos os isótipos Ig diminuiu temporariamente após o AVC (24). Isso nos levou a supor que o tecido cerebral com seu NMDAR1 densamente expresso (acessível após a quebra do BBB) pode atuar como uma armadilha para circulação do NMDAR1-AB (25). Primeiro abordamos a questão de se o soro NMDAR1-AB seria detectável no LCR. De N = 271 indivíduos de meia-idade (diagnosticados com esclerose múltipla ou controles de doenças) com pares de soro no LCR disponível, 26 eram NMDAR1-AB soropositivos (que está na faixa esperada) mas, notavelmente, apenas 1 era positivo para o LCR. Em contraste, o tétano AB (omnipresente devido à vacinação obrigatória, mas sem ligação ao tecido cerebral) estava presente no soro e no LCR de todos os sujeitos, com níveis de LCR mais elevados quando o BBB estava comprometido. Experimentos translacionais em camundongos provaram a hipótese de que o cérebro age como “imunoprecipitador”: a injeção simultânea de NMDAR1-AB IgG e um “não-cérebro” (anti-GFP IgG) não vinculativo resultou em alta detectabilidade do primeiro apenas no cérebro (nitidamente mais pronunciada na disfunção BBB) e do segundo apenas no LCR (25). Esses dados podem ajudar a explicar as potenciais consequências sintomáticas do AB sérico dirigido contra antígenos cerebrais. Enquanto que a vazamento do BBB tem um papel importante e deve ser avaliada em casos onde há suspeita de relevância patológica do NMDAR1-AB circulante, resultados negativos em relação aos títulos de AB no LCR não podem excluir automaticamente os efeitos cerebrais.

Epitopes reconhecidos pelo NMDAR1-AB

A próxima questão era se esses aparentemente funcionais NMDAR1-AB reconheceriam o mesmo epitópo e se isso poderia potencialmente explicar sua alta soroprevalência. Mais uma vez, inesperadamente, o mapeamento de epitopos usando sete construções diferentes NMDAR1 revelou o reconhecimento por soros NMDAR1-AB positivos de diferentes epitopos, localizados na ligação do ligante extracelular e no domínio N-terminal (NTD), bem como no domínio intracelular C-terminal e no domínio extracelular de poros grandes. A seropositividade NMDAR1-AB foi policlonal/poliespecífica em metade dos soros investigados e provavelmente mono ou oligoclonal/oligospecífica (principalmente IgG) na outra metade. No geral, não apareceu nenhum padrão específico relacionado com a doença: Os epitopos NMDAR1 eram comparáveis entre os grupos de doenças (26). O trabalho publicado sobre os epitopos NMDAR1-AB tem sido escasso antes desta investigação sistemática e tinha-se concentrado na IgG reconhecendo a DTN e o domínio NTD-G7 (N368/G369), provavelmente porque esta região e a classe de Ig foram primeiro consideradas patognomónicas para a encefalite anti-NMDAR (8, 34). De facto, parece que os factores que predispõem as mulheres jovens às manifestações neuropsiquiátricas da auto-imunidade associada ao NMDAR1 estão ligados aos epitopos NTD ou NTD-G7. O papel acentuado da IgG neste contexto ainda é uma questão de especulação, mas provavelmente relacionado à mudança de classe induzida pela inflamação no cérebro (36).

Fatores predisponentes para transportar ou impulsionar NMDAR1-AB

Na base destes achados in vitro e in vivo, temos que assumir que basicamente todos os NMDAR1-AB que ocorrem naturalmente têm potencial patogênico, independentemente do epitopo e da classe de Ig. Isto não significa, no entanto, que o tipo de classe de Ig não possa iniciar cascatas distintas de eventos secundários e assim dar forma à resposta tecidual final. Mas agora surgem ainda mais questões: Como podemos explicar a alta seroprevalência independente da doença do NMDAR1-AB, que aumenta com a idade? Sabemos de algum factor predisponente e, em caso afirmativo, como podemos integrar o seu papel no quadro completo? Os NMDAR1-AB foram inicialmente associados a condições oncológicas (teratoma) (7). Posteriormente, foi observada uma predisposição para transportar esses AB sobre a seropositividade de influenza A e B, um achado replicado em uma amostra independente (25, 28). Também foi encontrado um marcador genético significativo em todo o genoma, rs524991, mesmo relacionado à biologia NMDAR, associado ao NMDAR1-AB (28). Se um BBB vazante, causando maior exposição do NMDAR1 central a células do sistema imunológico, pode induzir a formação de NMDAR1-AB e/ou impulsionar clones de células B específicas pré-existentes, não está atualmente claro e precisa ser sistematicamente investigado. Outra ideia atractiva que ainda não foi seguida no campo NMDAR1-AB é a potencial influência modulatória do microbioma no reforço do NMDAR1-AB (37).

Outro Antígeno Cerebral Dirigido AB

Por que vemos o NMDAR1-AB tão abundantemente na saúde e na doença? Isto também se aplica a outros AB dirigidos contra antígenos cerebrais? Para responder a estas questões, estudamos de forma análoga 24 outros antigénios cerebrais dirigidos por soro AB, previamente ligados a condições patológicas. Mais uma vez, para alguma surpresa, este trabalho revelou uma frequência comparável, títulos e distribuição de classes de Ig em indivíduos saudáveis e doentes. A soroprevalência, entretanto, de todos esses 24 AB foi nitidamente menor (<2%) em contraste com NMDAR1-AB (até >20%) (27). De forma impressionante, a classe predominante de Ig também não dependia do estado de saúde ou doença, mas da localização do antígeno, com epitopes intracelulares predispondo a IgG (27). A distribuição igual desses 24 outros AB em saúde e doença é menos espantosa quando se considera que os múltiplos AB direcionados ao cérebro foram relatados no soro de humanos saudáveis e de diferentes espécies de mamíferos (38, 39), bem como abundantemente no LCR de casos de encefalite (40), mesmo que os respectivos antígenos cerebrais não tenham sido especificados. Resumindo, o AB em geral e o NMDAR1-AB em particular parecem fazer parte de um repertório auto-imune pré-existente (37, 41-44) que ganha significado (patogênico) fisiológico em condições de síntese intratecal ou comprometimento do BBB, por exemplo, em caso de lesão, infecção, inflamação cerebral ou predisposição genética para vazamento do BBB (haplótipo APOE4).

Conclusões e Recomendações

Todos os soro NMDAR1-AB que ocorrem naturalmente têm, obviamente, potencial patogênico. Por razões ainda muito inexploradas, eles são altamente freqüentes (mais do que outros AB até o momento identificados), e sua prevalência aumenta claramente com a idade. A seropositividade NMDAR-AB sozinha definitivamente não justifica o tratamento imunossupressor. A relevância sindromal do NMDAR1-AB sérico depende da acessibilidade ao cérebro, ou seja, da permeabilidade do BBB. Além disso, a inflamação cerebral provavelmente desempenha um papel crucial na determinação da acuidade e gravidade da síndrome, como contribuído pela circulação do NMDAR1-AB e ainda mais pronunciado pelas respectivas plasmócitos que residem no cérebro ou que potencialmente migram para o cérebro em condições inflamatórias para produzir AB intratecal (40). No meio inflamatório, eles são impulsionados pela exposição epitopular e experimentam mudança de classe para IgG (36). Achados em indivíduos com encefalite por herpes podem apoiar ainda mais esta visão (22, 45).

Ainda encefalite subjacente, seja infecciosa, induzida por lesão, genética, ou “idiopática”, pode sofrer uma síndrome proeminente moldada pela presença de NMDAR1-AB no sentido de “encefalite de Dalmau” (7-10), que então requer terapia imunossupressora em cima do tratamento da encefalite causal (se disponível). Se o NMDAR1-AB produzido por via intratecal sozinho, sem qualquer inflamação subjacente pré-existente, pode causar “encefalite da Dalmau”, ainda está por determinar. Em qualquer caso de suspeita de conseqüências sintomáticas da AB sérica dirigida contra antígenos cerebrais na ausência de encefalite aberta, deve-se avaliar a vazamento da BBB. Como o quociente de albumina (empregado como aproximação clínica para diagnosticar a quebra da BBB) indica antes um distúrbio da barreira hemato-CSF e pode nem sempre ser patológico em casos leves de vazamento de BBB (46-48), a determinação adicional da ruptura da BBB (global ou local) por um novo método de ressonância magnética (MRI) (47), que pode ser estabelecido como adição à RM de rotina com contraste, pode ser útil para estimar a necessidade e o benefício, especialmente de intervenções terapêuticas imunossupressoras prolongadas.

Contribuições do autor

O autor confirma ser o único contribuinte deste trabalho e o aprovou para publicação.

Declaração de conflito de interesses

O autor declara que a pesquisa foi conduzida na ausência de qualquer relação comercial ou financeira que pudesse ser interpretada como um potencial conflito de interesses.

Funding

Este trabalho foi apoiado pela Sociedade Max Planck, a Max Planck Förderstiftung, a DFG (CNMPB), a EXTRABRAIN EU-FP7, e a Niedersachsen-Research Network on Neuroinfectiology (N-RENNT).