Evidência de seleção positiva atuando no locus do gene humano D4 receptor de dopamina

Resultados e Discussão

Conjuntos de iniciadores foram escolhidos para amplificar os quatro exons do gene DRD4 altamente rico em GC (1), bem como a região promotora adjacente e as junções de emendas (Fig. 1). A ressequenciação inicial de toda a região promotora e codificadora do gene DRD4 a partir de 20 probandos de ADHD (dados não mostrados) revelou uma série de polimorfismos reportados anteriormente. Estes polimorfismos incluíram dois polimorfismos de inserção/delecção, um na região promotora (4,3 kb a montante da VNTR; ref. 18 e 19) e um no exon 1 (2,7 kb a montante da VNTR; ref. 20; ver Fig. 1). Além disso, foram descobertos vários novos SNPs de codificação no exon 3 VNTR (2), bem como dois SNPs anteriormente não relatados no intron 3, 20 nt separados e ≈350 bp a jusante do centro do VNTR (Fig. 1). Dado o elevado nível de polimorfismo VNTR identificado nesta amostra inicial, foi realizada uma ressequenciação PCR mais extensa de 600 alelos exon 3 VNTR, obtida de uma amostra populacional mundial (ref. 3 e 17; Tabela 1; Fig. 2). Esta amostra continha indivíduos representando a maioria das principais origens geográficas (ver Métodos). A maioria dos indivíduos eram heterozigotos, e os dois produtos de PCR alélica podiam ser separados por eletroforese em gel antes do sequenciamento, fornecendo haplótipos inequívocos. No total, foram analisados mais de 450.000 bp de ADN genómico e 2.968 repetições de 48 bp.

Nos 600 cromossomas sequenciados, foram encontrados 56 haplótipos diferentes (Tabela 1). Esses haplotipos foram compostos por 35 motivos distintos de variantes 48-bp (Fig. 2), 19 dos quais foram relatados anteriormente (designados α-ξ na Fig. 2; ref. 2). Propomos que estes motivos da variante DRD4 48-bp tenham os números indicados e não as letras utilizadas anteriormente (2), porque não existem caracteres suficientes no alfabeto grego. Propomos que as variantes DRD4 exon 3 sejam designadas no formato mostrado, ou seja, o alelo 4R mais comum sendo designado 4R(1-2-3-4), etc.

Amostrasamos intencionalmente os alelos não 4R aproximadamente 2 vezes, porque foi descoberta pouca variação de sequência no alelo 4R comum (Tabela 1) apesar de representar 65% da frequência da população mundial (3, 17). A maioria dos haplótipos desta amostra (85,7%) foi encontrada em frequências inferiores a 1% (Tabela 1). Observando a diversidade de nucleotídeos entre as variantes definidas por seu número VNTR, os alelos comuns 2R, 4R e 7R são os que apresentam menor diversidade, com 78,2, 95,2 e 88,9% dos alelos representados pelos haplotipos mais comuns 2R(1-4), 4R(1-2-3-4) e 7R(1-2-6-5-2-5-4), respectivamente (Tabela 1). Em contraste, embora os alelos 3R, 5R, 6R, e 8R sejam mais raros, eles têm proporcionalmente mais variantes (Tabela 1). Este padrão incomum de diversidade de alelos não é claramente um simples efeito de comprimento, ou seja, alelos mais longos têm maior diversidade. Muitos haplótipos raros específicos da população foram observados. Exemplos incluem o haplótipo 2R(30-4) encontrado apenas na amostra Surui (América do Sul) e o haplótipo 5R(1-3-2-3-4) encontrado apenas na amostra Han chinesa (asiática) (Tabela 1 e Fig. 2).

O padrão de variação de nucleotídeos observado nos haplótipos VNTR não é aleatório (Fig. 2). A maioria das variantes da seqüência de DNA muda a seqüência de aminoácidos, às vezes de forma bastante dramática (ou seja, de Gln para Pro; Fig. 2). Embora muitas dessas variantes sejam eventos mutacionais relacionados (abaixo), pode-se contabilizar essas relações no cálculo dos Ka/Ks (a razão entre o número de substituições de aminoácidos por local dividido pela estimativa do número de alterações sinônimas). Valores de Ka/Ks superiores a 1 são geralmente considerados como um indicador rigoroso de seleção positiva no segmento de DNA observado (22, 23). Para uma sequência de repetição tandem, muitas relações assumidas podem ser inferidas e, portanto, diferentes rácios Ka/Ks podem ser calculados. Para todas as relações assumidas das variantes do DRD4, entretanto, Ka/Ks > 1. Por exemplo, assumindo que os motivos mais abundantes de 1-6 variantes (Fig. 2) têm todos uma origem comum e que a diversidade foi gerada tanto pela mutação como pela recombinação (abaixo), obtém-se um valor Ka/Ks de 3. Expandindo esta análise para incluir a divergência entre espécies (um método poderoso para melhorar estes cálculos) não é possível devido à rápida geração de nova variação desta VNTR em linhagens primatas (28).

As abordagens padrão para definir relações evolutivas entre estes haplótipos não são aplicáveis devido à natureza repetitiva da sequência de ADN (23). Com base nas seqüências de DNA observadas e suas variações nucleotídicas, entretanto, é simples propor uma origem simples para a maioria desses haplótipos (Fig. 3; Tabela 1). Eventos de recombinação/mutação em uma etapa entre os alelos mais comuns podem ser responsáveis por quase toda a variação observada dos alelos 2R-6R. Fig. 3 é um diagrama simplificado dos eventos de recombinação mais comuns propostos. Embora a sequência inferida de nucleotídeos de um ancestral DRD4 não possa ser determinada, todos os alelos de uma determinada espécie de primata parecem ser derivados de um ancestral comum relativamente recente (28). O alelo 4R mais prevalente é proposto como o alelo progenitor humano, baseado em (i) dados de sequência limitada reportados para os alelos primatas DRD4 4R (28), (ii) o nível inferior de LD para os polimorfismos em torno deste alelo (como discutido abaixo), e (iii) os arranjos de motivo da sequência dos alelos não 4R. Uma recombinação desigual entre dois alelos 4R(1-2-3-4) produziria os alelos 2R-6R comuns observados (Fig. 3). A posição do crossover determina a sequência resultante. Por exemplo, os alelos mais comuns 3R(1-7-4) e 3R(1-2-4) diferem apenas na posição de cruzamento, seja dentro ou após a segunda repetição (Fig. 3; Tabela 1). Assim, a conhecida alta frequência de recombinação desigual entre repetições tandem (29) pode ser responsável pela maior parte da diversidade observada do gene DRD4.

Além de crossovers desiguais, mutações de ponto único são evidentes nesta amostra populacional (Tabela 1 e Fig. 2). Por exemplo, com uma exceção, todos os alelos 2R em todo o mundo têm a seqüência 2R(1-4) (Tabela 1). Todos os 12 alelos 2R ressequenciados do DNA Suruí (sul-americano) continham uma mutação de ponto único, o alelo 2R(30-4) (Tabela 1 e Fig. 2). Esta mutação, uma mudança de C para T na primeira repetição, não altera a sequência de aminoácidos e provavelmente tem uma origem recente (menos de 10.000-20.000 anos) (24).

Em contraste, a formação dos alelos 7R e superiores observados não pode ser explicada por simples eventos de recombinação/mutação de uma etapa do haplótipo 4R(1-2-3-4) (Fig. 3). A geração de um alelo 7R a partir do alelo 4R mais prevalente exigiria pelo menos uma recombinação e seis mutações para surgir. Mesmo permitindo eventos de conversão de gênero mais complicados, múltiplos passos de baixa probabilidade são necessários para converter um alelo 4R em um alelo 7R (Fig. 3). Por exemplo, o motivo central de cinco variantes encontrado no haplótipo 7R(1-2-6-5-2-5-4) comum poderia ser produzido por uma recombinação entre dois alelos 4R. A recombinação entre o motivo terminal de quatro variantes de um alelo 4R e o motivo inicial de uma variante do segundo alelo 4R produziria um haplótipo 7R(1-2-3-5-2-3-4) (Fig. 2). Três mutações adicionais de cada um dos dois motivos trivariantes neste suposto haplótipo 7R são necessárias para produzir o actual haplótipo 7R(1-2-6-5-2-5-4). Quatro dessas seis alterações nucleotídicas são não-sinônimas, alterando a seqüência de aminoácidos (Ser para Gly, Gln para Pro, Ala para Pro, e Ser para Gly; Fig. 2). Embora a conversão gênica ao invés da mutação pudesse ser proposta como mecanismo para “inserir” essas alterações nucleotídicas em um hipotético alelo 7R(1-2-3-5-2-3-4), dois eventos improváveis, um envolvendo a conversão do gene do alelo 7R-7R, seriam necessários (Figs. 2 e 3).

Nenhum desses supostos haplótipos 7R “intermediários” foi observado nesta amostra populacional mundial. Nossa amostra incluiu 47 alelos 7R sequenciados de indivíduos de origem africana que se pensava conterem populações com a maior diversidade genética e idade (24). É improvável, então, que existam haplótipos 7R intermediários com alta frequência. Não é nossa intenção, contudo, propor uma origem específica do alelo DRD4 7R. Pelo contrário, queremos enfatizar que com base na análise da seqüência de DNA, o alelo DRD4 7R parece bastante distinto dos alelos 2R-6R comuns. É impossível determinar se a origem do alelo DRD4 7R foi um evento único, altamente improvável ou uma série de eventos improváveis (Fig. 3).

Independentemente do mecanismo de origem do alelo DRD4 7R, é claramente capaz de participar em eventos de recombinação com os outros alelos. A maioria dos raros haplótipos 7R observados parecem ser eventos de recombinação, a maioria com o alelo comum 4R(1-2-3-4) (Tabela 1). Por exemplo, o haplótipo 7R(1-2-6-5-2-3-4) parece ser uma recombinação entre um alelo 4R(1-2-3-4) e um alelo 7R(1-2-6-5-2-5-4) (Tabela 1 e Fig. 2). Esta origem foi confirmada pela análise dos SNPs fora da região de recombinação (ver abaixo). Além disso, a origem de alguns dos raros alelos 5R e 6R e todos os alelos 8R e superiores podem ser explicados por recombinações envolvendo um alelo 7R, porque eles contêm o motivo de seis variantes exclusivo do alelo 7R (Fig. 2 e Tabela 1). Muitos destes alelos 8R e superiores, entretanto, parecem ter origens mais complicadas com base na análise da seqüência de DNA (Tabela 1 e Fig. 2).

Este modelo (Fig. 3) explica a aparente anomalia na diversidade de haplótipos observada acima (Tabela 1), onde o alelo 4R mais abundante (e antigo, veja abaixo) tem a menor diversidade de nucleotídeos. Se a recombinação é o gerador predominante de diversidade, então a maioria dos eventos de recombinação 4R-4R tem uma sequência de nucleotídeos inalterada. Tais eventos só podem ser inferidos através da recombinação de marcadores externos. Somente quando ocorre uma recombinação fora de registro serão geradas novas variantes de sequência (e comprimento) de nucleotídeos (Fig. 3). O padrão observado de diversidade de haplótipos é consistente com um sistema predominantemente de “2 alelos” (4R e 7R), com a maioria das variantes mais raras geradas pela recombinação destes dois haplótipos (Fig. 3).

A natureza incomum da organização da seqüência do alelo DRD4 7R, sugerindo que ele surgiu como um evento mutacional raro, nos levou a determinar se existem diferenças no LD entre os alelos 4R e 7R. O haplótipo de dois SNPs intrônicos adjacentes (G/A-G/C; Fig. 1) pôde ser determinado diretamente, pois estavam presentes no mesmo produto PCR usado para amplificar o 48-bpVNTR. O LD forte foi encontrado entre o par A-C SNP e o alelo 7R (Fig. 3). Noventa e sete por cento dos alelos 7R foram associados ao par A-C SNP (66 dos 68 examinados). Os dois alelos 7R associados aos SNPs G-G eram haplótipos recombinantes 7R-4R, conforme determinado originalmente a partir da análise da seqüência de DNA (acima). Em contraste, ambos os pares G-G e A-C SNP estão associados com os alelos DRD4 4R (487 alelos examinados). No entanto, o par G-G é mais frequente, representando 86,1% da amostra africana mas até 98,6% da nossa amostra asiática.

Todos os alelos 7R africanos estavam associados aos haplótipos A-C, enquanto que apenas 13,9% dos alelos 4R africanos estavam associados ao haplótipo A-C. A análise da sequência de DNA de várias amostras de chimpanzé e bonobo (dados não mostrados) indica que o par G-G SNP é provavelmente a sequência ancestral (Fig. 3). Assim, parece que o alelo DRD4 7R original surgiu sobre este fundo mais raro do A-C SNP. Uma amostra de 73 alelos 2R, 3R, 5R e 6R mostrou associação aproximadamente igual com os SNPs G-G e A-C, o que é consistente com sua origem recombinacional proposta a partir dos alelos 4R e 7R (Fig. 3). Curiosamente, todas as 26 amostras de alelos asiáticos 2R examinadas mostraram associação com os SNPs A-C, sugerindo sua origem a partir de recombinações envolvendo alelos 7R (Fig. 3).

Resultados semelhantes foram obtidos para polimorfismos de inserção/deleção mais distantes e exon 1 (Fig. 1). Neste caso a associação foi inferida indiretamente a partir dos dados obtidos para nossos estudos populacionais anteriores (3, 17) e análise por PCR de um subconjunto dos indivíduos utilizados neste estudo. Para 40 amostras onde o DNA parental também estava disponível e poderia ser genotipado para estes marcadores, a fase poderia ser inferida diretamente. Uma forte associação foi observada entre o longo (duplicado) polimorfismo promotor L1 (Fig. 1) e o alelo 7R (Fig. 3), com 90,8% dos alelos 7R associados ao L1 (607 alelos analisados). Em contraste, o polimorfismo L1 está associado a apenas 61,9% dos alelos 4R (2.102 alelos analisados). Embora tenha sido observada variação específica da população (por exemplo, mais acoplamento L1-4R nas populações chinesas do que nas africanas), foi detectada pouca ligação global L1-4R (Fig. 3). O polimorfismo L2 mais próximo no exon 1 (Fig. 1) foi associado a 93,4% dos alelos 7R e 86,4% dos alelos 4R, uma diferença relativa semelhante à observada para a associação L1-7R e L1-4R. O polimorfismo L2/S2 está em uma região codificadora, entretanto, e restrições seletivas podem estar influenciando a freqüência dos alelos também (30).

Métodos padrão de estimativa do tempo de coalescência para esses alelos não são aplicáveis, dada a natureza repetitiva da região e a alta freqüência de recombinação. No entanto, cálculos da idade dos alelos baseados na frequência relativamente alta da população mundial dos alelos DRD4 4R e 7R sugerem que estes alelos são antigos (>300.000 anos; ref. 25 e 26; ver Métodos). Por outro lado, cálculos da idade dos alelos baseados na variabilidade intraalélica observada (ref. 26 e 27; ver Métodos) sugerem que o alelo 7R é 5-10 vezes mais “jovem” (30.000-50.000 anos de idade). Estas grandes discrepâncias entre as idades dos alelos calculadas por estes dois métodos geralmente são tomadas como evidência de que a seleção aumentou a frequência do alelo para níveis mais altos do que o esperado pela deriva genética aleatória (26). Os valores absolutos dessas estimativas são muito afetados pelas suposições usadas em seus cálculos, por exemplo, a suposta freqüência de recombinação (26). Utilizamos estimativas conservadoras da frequência de recombinação com base na média observada para as bases terminais de 20 megabases de 11p (31). Dada a alta recombinação observada neste locus (Tabela 1 e Fig. 3), é provável que a idade real do alelo 7R seja ainda mais jovem, e uma análise posterior do LD refinará estas estimativas. A importante conclusão, entretanto, é que independentemente dos parâmetros assumidos, as diferenças de idade relativas para os alelos 4R e 7R calculadas a partir da variabilidade intraalélica permanecem grandes, enquanto sua freqüência populacional sugere que ambos são antigos.

A hipótese mais simples para explicar (i) o viés observado nas mudanças nucleotídicas (Ka/Ks), (ii) a organização incomum da seqüência do alelo DRD4 7R, e (iii) o forte LD em torno deste alelo é que o alelo 7R surgiu como um raro evento (ou eventos) mutacional que, no entanto, aumentou para alta freqüência por seleção positiva. Alelos vantajosos geralmente levam muito tempo para atingir uma frequência de 0,1, então aumentam rapidamente para frequências altas (>0,9). Embora seja possível observar a recente expansão de um alelo 7R altamente vantajoso, sugerimos que é mais provável que este sistema DRD4 de dois alelos (Fig. 3) seja um exemplo de seleção equilibrada. Tal seleção pode ser mais difundida no genoma humano do que geralmente se pensa (24). Um modelo de selecção equilibrada propõe que ambos os alelos 4R e 7R sejam mantidos em frequências elevadas nas populações humanas. Uma variedade de mecanismos poderia ser proposta para tal seleção balanceada, variando da vantagem heterozigota à seleção dependente da freqüência (24). De acordo com a teoria do jogo evolutivo (32), a remuneração evolutiva para um determinado tipo de personalidade dependerá da distribuição existente dos tipos de personalidade. Por exemplo, a alta agressão pode levar a uma alta aptidão física se quase todos forem mansos, mas pode resultar em baixa aptidão física quando muito comum, porque os indivíduos agressivos sofreriam as penalidades de conflitos frequentes. Este tipo de seleção dependente da freqüência pode ser aplicada a muitos tipos de variação psicológica, incluindo aqueles associados a este receptor neurotransmissor em particular (4-9).

Explicações alternativas para a seleção positiva proposta, tais como gargalos recentes, expansão populacional e/ou mistura populacional (24) são menos prováveis de levar em conta os resultados observados. Os gargalos certamente ocorreram durante a migração e evolução humana (33-35) e sem dúvida influenciaram a freqüência atual dos alelos DRD4 em todo o mundo. Numerosos estudos populacionais sobre outros genes (24, 33, 35) têm mostrado que uma constrição “fora de África” da diversidade de alelos (e um aumento no DL) provavelmente ocorreu. No presente estudo, foi encontrada uma maior diversidade (e menor DE) para os alelos africanos DRD4 4R em comparação com o resto da nossa amostra populacional, o que é consistente com a hipótese de fora de África (24). Embora se possa argumentar que a frequência dos alelos 7R foi aumentada por acaso durante a expansão fora de África, esta teoria não explica a incomum falta de diversidade nos alelos 7R africanos. O haplótipo L1L2-7R(1-2-6-5-2-5-4)-A-C mais comum (Fig. 3) é encontrado em frequências comparáveis às encontradas em todo o mundo (>85%). É difícil imaginar que tipo de gargalo poderia produzir tais resultados, ou seja, um LD forte no mundo inteiro para um único alelo (DRD4 7R), mas um LD pequeno para os alelos restantes. Um modelo que é consistente com os resultados observados é a hipótese do “Jardim do Éden fraco” (24), na qual o alelo DRD4 4R seria considerado como antigo e presente nas populações indígenas, enquanto que o alelo 7R foi espalhado pela expansão para fora (e para dentro) da África. Em uma hipótese tão fraca do Jardim do Éden, uma seleção positiva para o alelo DRD4 7R ainda deve ser proposta.

Embora sugerimos que uma origem mutacional recente e uma seleção positiva seja a melhor conta para os dados do alelo DRD4 7R, outra possibilidade não pode ser descartada. Dada a altamente improvável recombinação/mutação de eventos necessários para gerar o alelo 7R a partir do alelo 4R, uma possibilidade que vale a pena considerar é a importação deste alelo de uma linhagem hominídea intimamente relacionada. Que linhagem pode ser apenas especulada, mas as populações Neandertais estavam presentes no momento aproximado em que o alelo 7R se originou. Sob este modelo, o tempo de coalescência para os alelos 4R e 7R então seria antigo, com a importação ocorrendo apenas recentemente, conforme medido por LD. Obviamente, trabalhos experimentais adicionais podem esclarecer estas especulações.

Para o locus DRD4, é improvável que a seleção para um gene adjacente possa explicar a seleção proposta, dada a distinta e incomum seqüência de DNA do próprio alelo DRD4 7R. Se o alelo DRD4 7R teve origem em ≈40,000 anos atrás, pode-se perguntar o que estava ocorrendo naquela época na história humana? É tentador especular que a grande expansão humana que ocorreu naquela época, o aparecimento de uma nova tecnologia radical (o Paleolítico superior) e/ou o desenvolvimento da agricultura (24), poderia estar relacionado ao aumento da frequência do alelo DRD4 7R. Talvez indivíduos com traços de personalidade como a procura de novidade, perseverança, etc. tenham impulsionado a expansão (e substituição parcial). A especulação de que a migração poderia ser responsável pela atual distribuição dos alelos 7R foi proposta (34). Além de tal seleção fenotípica, a seleção sexual também poderia estar operando. Como definido originalmente por Darwin (36), “qualquer vantagem que certos indivíduos tenham sobre outros do mesmo sexo e espécie apenas em relação à reprodução” levará a um aumento da descendência. Se os indivíduos com um alelo DRD4 7R têm traços de personalidade/cognitivos que lhes dão uma vantagem (múltiplos parceiros sexuais, maior probabilidade de selecção de companheiros, etc.) então a frequência deste alelo irá expandir-se rapidamente, dependendo do meio cultural. Talvez as diferenças culturais possam explicar algumas das diferenças observadas na frequência do alelo DRD4 7R (3). Obviamente, a determinação da natureza exata da seleção do DRD4 e sua base bioquímica e comportamental aguarda novas experiências. Experiências recentes indicando que indivíduos com TDAH e possuindo este alelo incomum DRD4 7R realizam normalmente testes neuropsicológicos críticos de atenção em comparação com outros probandos de TDAH (6) apontam para apenas uma das muitas áreas de investigação futura.

Um pode perguntar por que um alelo que parece ter sido submetido a uma forte seleção positiva em populações humanas é agora desproporcionalmente representado em indivíduos diagnosticados com TDAH. A hipótese da variante comum/doença comum (16) propõe que a variação genética comum está relacionada com a doença comum ou porque a doença é um produto de um novo ambiente (de tal forma que os genótipos associados com a doença não foram eliminados no passado) ou porque a doença tem pequenos efeitos sobre a aptidão física (porque é de início tardio). Para os distúrbios de início precoce (como o autismo, TDAH, etc.) sugerimos entreter a possibilidade de os alelos predisponentes estarem de fato sob seleção positiva e só resultarem em efeitos deletérios quando combinados com outros fatores ambientais/genéticos. Neste contexto, é possível que restrições seletivas prévias não estejam mais operando sobre este gene. É possível também especular, entretanto, que os próprios traços que podem ser selecionados em indivíduos que possuem um alelo DRD4 7R podem predispor comportamentos que são considerados impróprios no ambiente típico da sala de aula e, portanto, diagnosticados como ADHD.