RECEPTOR
O receptor de eritropoietina foi clonado por uma estratégia de expressão a partir de uma biblioteca cDNA de células eritroleucêmicas murinas (D’Andrea et al., 1989). O gene receptor de eritropoietina humana está localizado no cromossomo 19p (Winkelman et al., 1990). Existem oito exons e sete introns, codificando um peptídeo aminoácido 507 com um peso molecular de 66 kDa. No gene humano, os exons 1-5 codificam o domínio extracelular 251-aminoácido, exon 6 a 20-aminoácido de membrana a-elical, e exons 7-8 o domínio citoplasmático 236-aminoácido (Youssoufian et al., 1993). O receptor de eritropoietina humana não tem sítios de glicosilação ligados ao N, mas uma alta frequência de resíduos serinosos e de treonina (Jones et al., 1990). Há 82% de identidade entre a eritropoietina humana e a murina. A ligação cruzada da eritropoietina à superfície celular das células eritróides revelou duas moléculas acessórias de 85 e 100 kDa que não são reconhecidas pelos anticorpos anti-p66 (D’Andrea e Zon, 1990; Mayeux et al., 1991). Contudo, a sua função tem de ser determinada.
O receptor de eritropoietina pertence à família de receptores de citocinas mono-transmembrana tipo 1. Esta família compartilha um domínio extracelular conservado composto de subdomínios de fibronectina tipo III (FNIII), assim como um motivo conservado da caixa citoplasmática da cadeia α 1 que se liga seletivamente a Janus kinases (JAK) (Bazan, 1990b). A região extracelular do receptor de eritropoietina contém dois subdomínios de FNIII (D1 e D2), que formam uma forma em L, com o eixo longo de cada domínio alinhado a aproximadamente 90° com o outro eixo. O domínio NH2-terminal D1 é composto de quatro em quatro cordas a, e o domínio D2 de sete cordas aniparalelas a (Livnah et al., 1996). O domínio D1 forma uma dobra do tipo h com uma topologia híbrida tipo FNIII/imunoglobina e dois pares distais de resíduos de cisteína formam pontes de dissulfeto. A membrana proximal do domínio D2 dobra com uma topologia padrão do tipo S FNIII, e contém um motivo WSXWS conservado (ou seja, triptofano-serina – qualquer aminoácido-triptofano-serina), que é importante para a dobra do receptor de eritropoietina (Quelle et al., 1992). Os domínios D1 e D2 contribuem juntos com seis loops para as interações eritropoietina. A região citoplasmática, rica nos aminoácidos prolina, glutamina e aspartase, contém um domínio caixa 1 (resíduos 257-264) específico para JAK2 (Zhuang et al., 1994; Jiang et al, 1996), um domínio caixa 2 (resíduos 303-313), e oito sítios de fosfotirosina (Tyr 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464, 479) que medeiam o recrutamento de homólogos de domínio Src-2 (SH2) efetores de codificação de domínio. Uma caixa estendida2 (resíduos 329-372) é essencial para ligar o KIT receptor de tirosina quinase após ativação por seu ligante e causa fosforilação do receptor de eritropoietina indicando uma interação funcional entre ambos os receptores (Wu et al., 1995a). A eritropoietina ativa o receptor de eritropoietina por dimerização (Philo et al., 1996). Uma molécula p66 liga a eritropoietina com alta afinidade (Kd em torno de 1 nM), a outra com menor afinidade (Kd em torno de 2 μM). Usando mutações e deleções, os locais ativos da eritropoietina foram mapeados (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994; Elliott et al., 1997). Anticorpos monoclonais bivalentes, mas não monovalentes, dirigidos ao domínio extracelular do receptor de eritropoietina induzem a proliferação de linhas celulares dependentes de eritropoietina e a formação de BFU-E sugerindo uma ativação do receptor através de sua dimerização (Elliot et al., 1996). O mesmo efeito pode ser obtido usando pequenos peptídeos miméticos de eritropoietina (EMPs) (Livnah et al., 1996; Wrighton et al., 1996). Embora a PEM não compartilhe nenhuma homologia de seqüência com a eritropoietina, eles se ligam especificamente ao receptor de eritropoietina. Mutações pontuais no domínio extracelular (R129C, E132C ou E133C) formam ligações dissulfeto e também ativam constitutivamente o receptor (Watowich et al., 1994). Em particular, a mutação do resíduo de arginina 129 em um cisteína é oncogênica e induz a eritroleucemia (Longmore e Lodish, 1991). Pelo contrário, a EMP33 é capaz de dimerizar, mas não de ativar, o receptor indicando um papel essencial da mudança conformacional no receptor dimerizado para sua sinalização (Livnah et al., 1998; Remy et al., 1999). A existência de dímeros receptores inativos pré-formados na superfície celular foi proposta, mediada pelas regiões intervenientes de D1-D2 e proporcionando uma separação de 79 A na base de seus domínios extracelulares (Livnah et al., 1996). Depois de ligar um agonista, os domínios receptores extracelulares mudam sua estrutura numa orientação definida com um espaçamento de 39 Å fornecendo um ajuste de seus componentes citoplasmáticos e levando à sinalização (Wilson e Jolliffe, 1999).
Besides binding erythropoietin, o receptor de eritropoietina pode ser ativado por outros mecanismos. A proteína envelope gp55 codificada pelo vírus murine Friend induz a eritroleucemia em ratos após a ligação e ativação do receptor de eritropoietina murina (Wolff e Ruscetti, 1985; Li et al., 1990). Além disso, os peptídeos sintéticos que não compartilham nenhuma sequência homológica com a eritropoietina são capazes de estimular o receptor de eritropoietina (ver abaixo).