Base clínica, genética e estrutural do aparente excesso de mineralocorticóides devido à deficiência de 11β-hydroxysteroid dehydrogenase tipo 2

Resultados

Nós relatamos a demografia e o fenótipo clínico de 36 pacientes com EMA geneticamente confirmada do International Consortium of Rare Steroid Disorders. A maioria dos pacientes era descendente de Omã (22 de 36) e persa (6 de 36), sendo 75% de casamentos consanguíneos, principalmente dentro de Omã (Fig. 1B e Tabela S1). A mediana da idade de diagnóstico de EMC foi de 4,6 anos (variação: 0,1-15) e a coorte foi distribuída igualmente para ambos os sexos. A maioria dos pacientes (86%) nasceu a termo, sendo que 76% nasceram pequenos para a idade gestacional. A figura 1A mostra que, em nossa coorte, houve seis falhas, uma inserção, duas deleções e três mutações de frameshift, e dois indels. Expectativa da fisiopatologia da EMA é que a pressão arterial média apresentada tenha sido elevada acima do percentil 90 para todos os sujeitos (Fig. 1C). O nível médio de potássio sérico no diagnóstico foi baixo em 2,72 mmol/L (variação: 1,5-4,1 mmol/L), enquanto o bicarbonato sérico foi alto em 29,5 mmol/L (variação: 20-38 mmol/L) (Fig. 1 D e E). Os níveis séricos de aldosterona foram esperados baixos (Fig. 1F), com dois pacientes com níveis elevados devido a razões pouco claras. Além disso, os níveis de renina foram baixos, exceto para dois pacientes (10,4 e 14 ng/mL/h) que estavam em terapia (Tabela S1). Em um subconjunto de 29 pacientes, a média (THF + alloTHF)/THE, representando os principais metabolitos urinários de cortisol e cortisona, foi significativamente elevada em 19 (faixa: 3-55, normal: 1,0) (Fig. 1G). É importante ressaltar que 27 dos 36 (75%) pacientes também apresentavam nefrocalcinose. A nefrocalcinose pode surgir de hipocalemia crônica de longa duração, como observado, por exemplo, na síndrome de Bartter tipo III (14).

Para entender se o fenótipo clínico da deficiência de HSD11B2 poderia ser previsto pelo exame das alterações na estrutura enzimática induzidas por uma dada mutação de HSD11B2, realizamos em análise silícica utilizando três HSD17B1 estrogênicas que exibiram uma semelhança de 27% em seqüência com HSD11B2 sobre 284 aminoácidos (Fig. S1A). O modelo humano HSD11B2 exibiu um motivo de dobra Rossmann de ligação NAD conservado (Fig. S1B) com um local adjacente de ligação do substrato (Fig. S1 C e D). As simulações MD de 500-ns das formas monômero e dimérico do HSD11B2 indicaram um modelo estável com proteína estavelmente dobrada (Fig. S1 E-H). Usamos o software Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18) para determinar ΔΔG de mutações de falta de sentido encontradas em pacientes com EMA ou mutações projetadas experimentalmente. Todas as mutações (Fig. 2A) mostraram um aumento nos valores de ΔΔG, sugerindo a perda da estabilidade e função da proteína (Fig. 2B).

HSD11B2 existe como um homodímero em seu estado inativo (13). Quatro resíduos – R186, E190, A237, e R336-lie na interface do dimer e poderia, portanto, interferir na formação do dimer (Fig. 2C). Os resíduos R186 e E190 são posicionados na interface do dímero na hélice α4. Uma interação entre pares de íons (R186-E190) é formada como resultado da dupla simetria invertida da subunidade adjacente (Fig. 2D), semelhante ao par de íons R112-E120 no HSD17B1 (15⇓-17). Importante, essa interação foi considerada estável, e foi mantida ao longo das simulações MD de 500-ns (Fig. 2 E-G). Além disso, a interação foi encontrada para estabilizar a hélice α4 e manter a flexibilidade em torno do local de ligação da coenzima. Assim, a mutação R186C resulta na perda do par de íons intersubunit e empurra o equilíbrio para a formação de uma enzima monomérica ativa (Fig. 2H). Ela também previne a formação da interação intra-helial entre pares de íons e assim permite a desestabilização dos elementos estruturais ao redor do local de ligação da enzima.

Existem várias outras mutações disruptivas nesta interface mais fraca envolvendo os resíduos A237, D244, L251, e D176. O resíduo A237 é cercado por L241 e V239 de ambas as subunidades HSD11B2. Sua mutação para Val melhora a hidrofobicidade deste aglomerado e fortalece o estado dimérico inativo da enzima (Fig. 2I). O resíduo D244 não só cria uma ponte de sal intrasubunit com R336 que mantém juntas as folhas de hélice α5 e β7, mas também interações de ligação de hidrogênio com R360 da subunidade adjacente (Fig. 2J). Sua mutação para Asn diminui a força da interação R360, levando à perda da ponte de sal com R366; isto, por sua vez, prejudica a estabilidade proteica. Da mesma forma, a mutação de uma cadeia lateral L251 hidrofóbica para o grupo hidroxila de Ser aumenta a polaridade e forma uma ligação de hidrogênio com os grupos de cadeia lateral de carga positiva de R361; isto melhora a ligação com dímeros (Fig. 2K). Finalmente, a mutação de D176 para Asn cria uma ligação de hidrogênio entre a asparagina e o T200, melhorando assim o estado inativo do dímero (Fig. 2L).

Mutações dos resíduos de HSD11B2 que formam o substrato ou a bolsa de ligação da coenzima (NAD+) foram mostradas em estudos in vitro para eliminar a atividade enzimática (19) e causar uma forte AME. Por exemplo, Y226 está localizado na bolsa de ligação do substrato (Fig. 3A). A cadeia lateral do fenol aromático forma interações hidrofóbicas com o anel aromático do substrato. A mutação Y226N substitui este resíduo por um resíduo não aromático, resultando na perda do empilhamento hidrofóbico, que interfere na ligação do substrato (Fig. 3A). Além disso, esta mutação muda a cadeia lateral de hidrofóbico para hidrofílico, o que é desfavorável para a ligação de um substrato hidrofóbico. A mutação A221V substitui a cadeia lateral curta por uma cadeia lateral ligeiramente mais volumosa da Val, interferindo assim na ligação do substrato ao reduzir o volume da bolsa, enquanto a mutação A221G diminui a hidrofobicidade e introduz flexibilidade em torno da bolsa rígida de ligação (Fig. 3B).

O nosso modelo mostra que o grupo polar 17-OH em cortisol está alojado numa região hidrofóbica rodeada por Y226, P227, e L229. Este grupo hidroxila está ausente na corticosterona, o que resulta em interações hidrofóbicas melhoradas e ∼10 – dobra maior afinidade de ligação ao HSD11B2 em relação ao cortisol (Fig. S2A). Além do rim, o HSD11B2 também é expresso na placenta. Embora o receptor mineralocorticoide não seja expresso nesse tecido, o HSD11B2 inativa o cortisol para eliminar seus efeitos inibidores de crescimento e proapoptóticos durante o desenvolvimento embrionário. Durante a gravidez, o alto nível de progesterona na circulação materna pode se ligar ao HSD11B2 e modular sua atividade. Isto pode traduzir-se em efeitos de quaisquer mutações que interrompam a ligação da progesterona ao peso ao nascer. Por exemplo, a mutação A221V afeta severamente a ligação da progesterona mais do que o cortisol devido aos choques estéreis entre o Val e os grupos metilo projetantes na progesterona (Fig. S2B). Muito interessante notar que os dois pacientes com a mutação A221V eram pequenos para a idade gestacional (Tabela S1). Da mesma forma, a mutação A221G afeta indiretamente a ligação da progesterona, alterando a estrutura do local de ligação. Da mesma forma, a mutação Y226N é mais prejudicial à ligação da progesterona, pois reduz as interações hidrofóbicas entre o esqueleto da progesterona e o anel hidroxifenil da tirosina (Fig. S2B). Em contraste, P227 fornece suporte estrutural indireto ao local de ligação, e a mutação para Leu tem efeitos similares tanto para o cortisol quanto para a progesterona (Fig. S2B).

Existem quatro mutações que residem e perturbam o local de ligação da coenzima, prejudicando severamente a atividade do HSD11B2. A cadeia lateral de resíduos L179 é normalmente posicionada espacialmente em uma curva curta entre a folha β4 e a hélice α4 (Fig. 3C). Ao permitir interações com as cadeias laterais hidrofóbicas de V174 e L282, essas interações tornam o local de ligação da coenzima mais flexível. A mutação para Arg introduz uma cadeia lateral de guanidínio, que permite interações com a cadeia lateral do grupo carboxil de E172 e a cadeia lateral do grupo hidroxil de T184 (Fig. 3C), introduzindo assim rigidez na curva e diminuindo a flexibilidade necessária para a função enzimática ideal (7). Situado na bolsa de ligação da coenzima, Y232 é um resíduo altamente conservado no motivo da dobra Rossmann (20), sugerindo que sua mutação será prejudicial à atividade enzimática (21). A cadeia lateral hidroxil-fenil do Y232 forma importantes ligações de hidrogênio com N171 e NAD+, mantendo a coenzima na posição correta para sua função catalítica (Fig. 3D). Esta interação é interrompida na mutação Y232C, causando uma grave EMA. A importância deste resíduo na atividade enzimática foi confirmada independentemente por várias mutações de engenharia (21) (Fig. 3D). Na mutação G89D, a cadeia lateral carboxil de Asp apresenta graves choques estéreis com a fracção de açúcar ribose da adenosina, que afecta a ligação do NAD+ (Fig. 3E). Uma outra mutação de engenharia K236R leva à ruptura da ligação do NAD (Fig. 3F). Enquanto mantém a capacidade de interagir com o NAD+ através da ligação de hidrogênio, a mutação elimina a atividade enzimática (21).

Impairments in structural stability of HSD11B2 disrupt its tertiary structure, causing a marked attenuation of enzyme activity and severe AME. O resíduo L250 está posicionado na hélice α5, e suas correntes laterais estão em uma bolsa hidrofóbica apertada rodeada pelas correntes laterais de L204, F246, W253, V255 e V257 (Fig. 4A). Os resíduos da bolsa hidrofóbica são bloqueados por uma interação de pares de íons entre R208 e E249. A introdução de uma cadeia lateral Pro quebra a hélice α5 introduzindo rigidez. Esta bolsa também é muito apertada para acomodar a grande e volumosa cadeia lateral de guanidínio de Arg (Fig. 4A). Uma subsequente perda de hidrofobicidade nesta região afeta a estabilidade estrutural. Outra interação estável entre pares de íons intra-helical é formada entre D144 e R147 (Fig. 4B). Essa interação permite que a hélice α3 se encaixe perfeitamente com as folhas adjacentes β, próximas ao local de ligação do NAD+. A mutação D144V resulta na perda desta interação e desestabiliza a disposição da embalagem (Fig. 4B). A embalagem hidrofóbica também é interrompida na mutação F185S, quando a cadeia lateral aromática da fenilalanina, rodeada por resíduos hidrofóbicos de V182, C188 e M189, é substituída por uma cadeia lateral polar de serina (Fig. 4C). Da mesma forma, a cadeia lateral hidrofóbica de L363, rodeada por M347, I350 e F362, é posicionada em uma hélice de volta-helix (Fig. 4D). A mutação L363P perturba a hélice e o ambiente estrutural local.

Outras mutações podem perturbar o empacotamento da proteína HSD11B2 para prejudicar a estabilidade através da introdução de um resíduo mais volumoso. O resíduo A328 forma interação hidrofóbica com V215, I260, I325, e Y338 (Fig. 4E). Ao substituir a alanina por um resíduo Val mais volumoso, a mutação A328V causa choques estéreis com a cadeia lateral de I260 e Y338 das folhas de β ao redor (Fig. 4E). O resíduo S180 é posicionado em um laço e sua cadeia lateral do grupo hidroxila interage com a cadeia lateral e o nitrogênio da espinha dorsal de T184 (Fig. 4F). Esta cadeia lateral fica dentro de um espaço muito apertado e restringe a acomodação de qualquer resíduo mais volumoso, o que causa choques estéreis, de fato, sem alterar a estrutura proteica. Assim, uma cadeia lateral de Phe com um anel aromático volumoso, como na mutação S180F, não é tolerada nesta posição (Fig. 4F).

As ligações de hidrogênio múltiplo e pontes salinas entre resíduos polares estabilizam a estrutura terciária da enzima HSD11B2. Certas mutações causam uma perda dessas interações, resultando em enzima inativa e EMA severa. Por exemplo, a ponte de sal entre R208 e E249 é crítica (Fig. 4G). Sua perda, como no caso das mutações R208C e R208H, desestabiliza a proteína e resulta em doença severa (Fig. 4G). Da mesma forma, D223 forma uma ponte de sal com R337 (Fig. 4H). Ao substituir esta ponte salina por uma ligação menos forte, uma ligação de hidrogénio, a mutação D223N altera o resíduo carregado negativamente para um resíduo polar não carregado, resultando numa atenuação marcada da actividade in vitro (22). Isto também sugere que a ponte de sal desempenha um papel crucial na manutenção da estabilidade e atividade do HSD11B2. As cadeias laterais do R213 formam ligações de hidrogênio com os átomos da espinha dorsal dos resíduos A331 e L329 (Fig. 4I). Ao diminuir essas ligações de hidrogênio, que ajudam a manter a estrutura terciária da proteína, a mutação de R213C prejudica a estabilidade enzimática (Fig. 4I).

O aglomerado Arg/Tyr de resíduos 335-339 foi previamente implicado na manutenção da estabilidade protéica, embora o mecanismo preciso tenha permanecido pouco claro (23). Mutações envolvendo esses resíduos têm sido relatadas em pacientes com EMA, incluindo R337C e Y338H. Simulações dos modelos monoméricos e diméricos HSD11B2 sugerem que o resíduo R337 forma uma interação de ponte salina com D223 e ligações de hidrogênio com o grupo OH de Y339 (Fig. 4J). Suas interações parecem ser importantes para manter a dobradura correta e a estabilidade da proteína. Assim, a sua mutação para Cys elimina tanto a ponte salina como a ligação de hidrogênio para desestabilizar a enzima e causar uma forte EMA. Mutações geneticamente modificadas deste resíduo mostram ainda mais que R337K, que mantém a polaridade e carga positiva, reduz a atividade enzimática em 70%, enquanto R337A, que é semelhante a R337C por ter cadeias laterais curtas e sem carga, inativa completamente o HSD11B2 (23) (Fig. 4J). No mesmo aglomerado Arg/Tyr, a mutação do Y338 para a Sua inactiva a enzima para causar uma EMA grave. Nosso modelo sugere que este resíduo Tyr forma interações hidrofóbicas com A328 e ligações de hidrogênio com D327 (Fig. 4K). Ambas as interacções ajudam a manter a estabilidade proteica, de modo que a substituição de Tyr por His, por exemplo, inactiva o HSD11B2. Isto porque, embora o Y338H mantenha a capacidade de ligação de hidrogênio, ele tem cadeias laterais mais curtas que desestabilizam a enzima. Da mesma forma, a substituição de Tyr por Phe numa construção de Y338F engenheirada não é tolerada. Aqui, as interações hidrofóbicas são mantidas, mas a ligação de hidrogênio é abolida (23). Finalmente, R337 e Y338 no aglomerado Arg/Tyr também são altamente conservados em muitas espécies; assim, quaisquer alterações a estes resíduos são pouco toleradas (23).

Mutações evasivas são relatadas como causadoras de uma forma mais suave de AME com manifestações clínicas e bioquímicas menos severas. As construções mutantes relevantes demonstraram ter mantido a atividade de HSD11B2 in vitro (4, 19, 24), consistente com o fenótipo clínico menos grave. Estruturalmente, essas mutações podem interromper indiretamente a ligação do substrato (como a mutação P227L em um de nossos pacientes) ou alterar a estrutura proteica (como as mutações R279C e R359W) para atenuar, mas não abolir a atividade enzimática (Fig. 5). Notavelmente, enquanto o resíduo P227 não está em uma posição que interage diretamente com o substrato, seu posicionamento adjacente ao resíduo Y226 sugere que ele pode ter um papel na ligação do substrato (Fig. 5A). Na verdade, este resíduo forma a “dobra” na região do laço, mantendo a conformação do local ativo e também mantém Y226 na posição correta para interagir de forma ótima com o substrato. A mutação deste resíduo para Leu (P227L) perturba a dobra e altera o posicionamento de Y226 (Fig. 5A).

Duas mutações não conservadoras pensadas para perturbar a estrutura terciária do HSD11B2 foram identificadas em pacientes com EMA tipo 2. R279 forma uma ligação de hidrogênio com a espinha dorsal de N171, que ajuda a manter e estabilizar o ambiente proteico local (Fig. 5B). A substituição de R279 por um resíduo que não forma uma ligação de hidrogênio, como na mutação R279C, leva a uma atenuação leve, mas não à eliminação total da atividade da HSD11B2 (24), consistente com um fenótipo clínico leve (Fig. 5B). Outra mutação não conservadora, R359W, muda as propriedades da cadeia lateral de carregada para hidrofóbica. Isto altera a interação local dentro da estrutura da proteína, na qual a cadeia lateral positivamente carregada de R359 forma uma ligação de hidrogênio com a espinha dorsal de oxigênio carbonil de I350 (Fig. 5C). A perda desta interação contribui para a maior flexibilidade estrutural, causando a atenuação da atividade enzimática. De notar que tanto o R279C como o R359W causam perturbações mínimas nas interacções intramoleculares e ocorrem perto da superfície da proteína.