Atividade Modulatória de 2,4-Dinitrofenilidrazona como Agentes Contra Alguns Agentes Patogênicos Humanos ESKAPE

Abstract

Uma biblioteca de seis novas fenilidrazonas foram sintetizadas e avaliadas pela sua atividade moduladora in vitro antimicrobiana e de resistência contra um painel de espécies Gram-positivas, Gram-negativas e fúngicas. Os compostos foram produzidos em bons rendimentos de 60-92% p/p e caracterizados por técnicas de ponto de fusão, espectroscopia visível aos raios UV, infravermelho e ressonância magnética nuclear (1H, 13C e DEPT-Q). A espectroscopia de massa foi utilizada para confirmar a identidade de um dos compostos mais ativos, 5 . As fenilidrazonas mostraram atividade contra todos os seis microorganismos selecionados com concentração inibitória mínima (MIC) dos compostos mais ativos, 1 e 5 , a 138 µM (Klebsiella pneumoniae) e 165 µM (Streptococcus pneumoniae), respectivamente. O composto 1 demonstrou ainda uma actividade modulatória de alta resistência a 1,078 µM contra Streptococcus pneumoniae e Klebsiella pneumoniae.

1. Introdução

O mundo nas últimas décadas está ficando sem antibióticos eficazes devido ao aumento da prevalência de organismos multirresistentes. Isto levou a um aumento das infecções resistentes, exigindo que os cientistas explorem incessantemente a possibilidade de sintetizar análogos de compostos ativos ou de chumbo como novos antimicrobianos para conter estas infecções e as doenças resultantes. As doenças infecciosas ao longo dos séculos tornaram-se uma grande ameaça à existência da humanidade, uma vez que continuam a ter um impacto negativo significativo na sociedade. Os agentes patogénicos tais como bactérias, vírus, fungos e parasitas continuam a surgir e estão em ascensão especialmente no século XXI, apesar de várias tentativas de os reduzir. As doenças infecciosas são responsáveis pela morte de cerca de 17 milhões de pessoas anualmente, com o surgimento de pelo menos trinta novas doenças. O mundo está atualmente combatendo a pandemia COVID-19 causada pelo vírus corona que já ceifou mais de 25.000 vidas globalmente em três meses (OMS, 2020). Estas doenças ameaçam a saúde de milhões de pessoas, especialmente porque não existe cura ou vacina. A tendência crescente das infecções microbianas deve-se em grande parte à perene questão da resistência antimicrobiana, que tem estado em ascendência. As principais causas de miríades de resistência antimicrobiana incluem quimioterapia prolongada e não conformidade com o regime de dosagem .

A crescente resistência aos antibióticos levou à tendência crescente de patógenos como Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) multirresistente, e Escherichia coli (MDR-Escherichia coli) multirresistente. Além disso, a maior preocupação no tratamento das infecções nosocomiais são os patógenos ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Enterobacter species) . A sua presença nas infecções tem sido uma situação preocupante no sector da saúde, uma vez que a maioria delas é resistente a muitos antibióticos, e compreender o mecanismo de resistência destas estirpes é útil no desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos .

A Organização Mundial de Saúde deixou claro que a tendência de aumento das doenças infecciosas continuaria devido a uma série de factores, incluindo a migração rural-urbana, aumento da população global, adaptação microbiana e alterações climáticas . Estes favoreceriam o surgimento e a propagação de patógenos, pelo que as partes interessadas, incluindo os químicos medicinais, são continuamente instadas a conceber estratégias para descobrir novos agentes quimioterápicos que permitam superar a ameaça da resistência antimicrobiana. A atividade modulatória resistente de um composto é a capacidade do composto de ter influência controladora sobre os padrões já conhecidos, especialmente de uma forma positiva. Devido à crescente resistência dos microorganismos aos antibióticos, agentes de fontes naturais ou sintéticas parecem modular a atividade de alguns agentes antimicrobianos padrão, como a amoxicilina (a), ciprofloxacina (b) e fluconazol (c) (Figura 1).

(a)

(b)

(c)

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(b)
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Figura 1

Estruturas químicas de alguns antibióticos padrão : (a) amoxicilina; (b) ciprofloxacina; (c) fluconazol.

As actividades modulatórias de resistência de produtos (tanto naturais como sintéticos) sobre antibióticos padrão têm ganho interesse científico nos últimos anos. Isto visa maximizar a potência antimicrobiana com grandes avanços na redução da resistência microbiana e, portanto, levando à potencial descoberta de medicamentos. Uma classe importante de tais agentes sintéticos com efeito de modulação de resistência promissor é a hidrazona. As hidrazonas e seus análogos possuem a funcionalidade azometina, um importante grupo de compostos com amplo espectro de atividades biológicas . As hidrazonas foram escolhidas devido à sua ampla gama de atividades farmacológicas, como anticonvulsivos, anti-inflamatórios, antimicrobianos, antiprotozoários e anticancerígenos. Elas desempenham papéis cruciais não apenas em biologia, mas também nos campos da fotoquímica, química analítica e química inorgânica. As hidrazonas estão relacionadas a cetonas e aldeídos através da substituição do oxigênio por -NNH2. Devido a diferentes protocolos sintéticos e estudos detalhados da relação estrutura-actividade (SAR), diferentes derivados de hidrazonas foram desenvolvidos e descobertos como sendo farmacologicamente activos em vários alvos . Alguns derivados de hidrazona de isonicotinoyl foram considerados como tendo actividade antituberculosa. Além disso, o derivado do ácido benzóico hidrazona 4-hidroxibenzóico (nifuroxazida) mostrou atividade antibacteriana contra vermes intestinais, e o derivado ácido 4-fluorobenzoico -hidrazida mostrou atividade antibacteriana contra Staphylococcus aureus ATCC 29213 em 3,13 μg/mL e a cepa H37RV de Mycobacterium tuberculosis susceptível também em 3,13 μg/mL . Hidrazonas sintetizadas recentemente, incluindo nifuroxazida, foram encontradas ativas contra a cepa H37RV de Mycobacterium tuberculosis na faixa de concentração inibitória mínima de 0,78-6,25 μg/ml. Um novo agente, 3, 5-dibenzoylvanillin hydrazone, e complexos de metais de transição foram encontrados para exibir atividade antibacteriana impressionante .

Hence neste estudo, seis novos derivados de fenilidrazona foram sintetizados com sucesso pela reação de condensação nucleofílica, com suas atividades antimicrobianas e efeitos de modulação de resistência investigados.

2. Materiais e Métodos

2.1. Síntese: Materiais e Métodos Gerais

Um balão de fundo redondo (100 mL) equipado com uma barra de agitação magnética foi carregado com 2,4-dinitrofenilidrazina (1 eq.) em metanol (10 mL) mantido em um banho de gelo. A suspensão resultante foi agitada e resfriada a 0°C antes de adicionar H2SO4 concentrado (98% v/v, 2 mL) gota a gota o que deu uma solução amarela pálida. Após resfriamento à temperatura ambiente, um aldeído ou derivado de cetona (1,04 eq.) em metanol (5 mL) foi adicionado e a mistura foi agitada até que houvesse uma formação gradual de precipitado que foi deixado por 24 horas. O progresso das reações químicas foi monitorado por cromatografia em camada fina (TLC) de forma intermitente usando placas de alumínio revestidas com sílica gel (60 GF254). As placas foram visualizadas sob luz UV a 254 nm e 366 nm, que foi seguida por pulverização com anisaldeído para confirmação da identidade do ponto. O produto bruto foi filtrado por filtração por sucção e recristalizado a partir de etanol absoluto quente (96% v/v). O produto sólido foi obtido por filtração por sucção, seco e armazenado à temperatura ambiente.

As estruturas dos compostos sintetizados foram estabelecidas com determinações de ponto de fusão, espectroscopia de massa, 1D NMR (próton e carbono-13), e 2D NMR (DEPT-Q) espectroscopia com suporte de infravermelho (IR) e ultravioleta-visível (UV-Vis) espectroscopia .

2.1.1. 1-(2,4-Dinitrofenil)-2-(difenilmetileno) Hidrazina

2, 4-Dinitrofenil-hidrazina (0,50 g, 2,74 mmol, 1 eq.) na presença de benzofenona (0,53 g, 1,04 eq., 2,64 mmol) produziu o produto bruto que foi purificado por recristalização a partir de etanol quente para obter o produto (0,84 g, 85%) como um sólido laranja claro. (Éter pet. 70%: EtOAc 30%): 0,90. Mpt: 141-143°C; UV-V é (MeOH) : 382 nm. Infravermelho (puro) υmax cm-1: 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09-9,10 (1H, H-C3, s, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH), 8,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7.66-7,72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7,35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7,57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155,7, 145,1, 136,5, 131,9, 130,5, 130,4, 130,1, 129,9, 128,6, 128,2, 127,9, 123,4, 116,6 ppm.

2,1.2. 1-Benzilideno-2-(2,4-dinitrofenil) Hidrazina

2, 4-Dinitrofenilidrazina (0,90 g, 4,53 mmol, 1 eq.) na presença de benzaldeído (0,50 g, 1,04 eq., 4,71 mmol) produziu o produto bruto que foi purificado por recristalização a partir de etanol quente para obter o produto (1,01 g, 78%) como um sólido amarelo. (Éter de Pet. 70%: EtOAc 30%): 0,83. Mpt: 178-180°C; UV-V é (MeOH) : 224 nm e 378 nm. Infravermelho (puro) υmax cm-1: 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09 (1H, H-C3, s, ArH), 8,30-8,31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.02 (1H, H-C6, m, ArH), 7,41-7,69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7,40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147,9, 145,8, 144,9, 144,7, 131,0, 130,0, 129,0, 127,6, 123,5, 116,8 ppm.

2,1,3. 3-(2-2-(4-Dinitrofenil) Hidrazono) Metilfenol

2, 4-Dinitrofenilidrazina (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) na presença de m-hidroxibenzaldeído (0,50 g, 1,04 eq., 4,09 mmol) produziu o produto bruto que foi purificado por recristalização a partir do etanol quente para obter o produto (0,76 g, 64%) como um sólido vermelho escuro. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0,74. Mpt: 277–280°C. UV-Vis (MeOH) : 392 nm. Infravermelho (puro) υmax cm-1: 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,56 (1H, H-C1, s, NH), 10,04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8,88 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35-8,37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8,08-8,34 (1H, H-C6), d, J = 12,0, ArH), 8,05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7,66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7,14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6,87-6,89 (1H (H-C3′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160,5, 150,5, 144,9, 137,1, 130,2, 129,8, 129,5, 125,2, 123,6, 117,1, 116,4 ppm.

2,1,4. 4-(2-(2,4-Dinitrofenil) Hidrazono) Metil)-2-metoxifenol

2, 4-Dinitrofenil-hidrazina (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) na presença de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído (vanilina) (0,50 g, 1,04 eq.), 4,09 mmol) produziu o produto bruto que foi purificado por recristalização a partir do etanol quente para obter o produto (0,91 g, 70%) como um sólido vermelho vivo. (Éter de Pet. 70%: EtOAc 30%): 0,66. Mpt: 270–273°C. UV-Vis (MeOH) : 218 nm e 394 nm. Infravermelho (puro) υmax cm-1: 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,58 (1H, s, NH), 10,11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9,94 (1H, H-C3, s, ArH), 8,87 (1H, H-C5, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7,97 (1H, H-C2′, d, J = 4,0, ArH), 7,66-7,76 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH), 6,38-6,35 (1H, H-C5′, d, J = 12,0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150,7, 150,2, 148,6, 144,9, 137,1, 130,2, 125,6, 123,6, 123,1, 117,2, 116,1, 110,3, 56,2 ppm.

2,1,5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrofenil) Hidrazono) Fenol de Metilo

2, 4-Dinitrofenil-hidrazina (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) na presença de salicilaldeído (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 eq.) produziu o produto bruto que foi purificado por recristalização a partir de etanol quente para obter o produto (1,09 g, 92%) como um sólido laranja brilhante. (Éter pet. 70%: EtOAc 30%): 0,84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH) : 386 nm. Infravermelho (puro) υmax (cm-1): 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9,98 (1H (C1), s, NH), 9,11 (1H H-C3, s, ArH), 8,34-8.36 (1H, H-_C1′, s, N = CH), 8,33 (1H, H-C5, d, J = 4,0, ArH), 7,61-7,58 (1H, H-C6, d, J = 4,0, ArH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7,25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,24 (1H, H-C7, m, ArH), 6,95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157,9, 151,3, 132,9, 131,4, 130,6, 123,7, 120,3, 117,2, 116,9, 115,3 ppm. HRMS (ESI): m/z calculado para + C13H10N4O5: 302.2400, encontrado: 301.0000.

2.1.6. 4-(2-(2, 4-Dinitrofenilidrazono) Metil) Benzeno-1, 3-diol

2, 4-Dinitrofenilidrazina (0,69 g, 3,48 mmol, 1 eq.) na presença de 2, 4-dihidroxi benzaldeído (0,50 g, 1,04 eq.), 3,62 mmol) produziu o produto bruto que foi purificado por recristalização a partir do etanol quente para obter o produto (0,66 g, 2,07 mmol, 60%) como um sólido vermelho escuro. (Éter pet. 70%: EtOAc 30%): 0,51. Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH) : 403 nm. Infravermelho (puro) υmax (cm-1): 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11,58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10,11 (1H, H-C1, s, NH), 9,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8,36 (1H, H-C5, d, J = 12,0, ArH), 7,95-7,97 (1H, H-C6, d, J = 8,0, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 6,38 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161,8, 159,1, 148,2, 144,6, 136,7, 130,1, 129,3, 128,8, 123,6, 116,9, 112,0, 108,7, 102,1 ppm.

2,2. Avaliação Antimicrobiana dos Compostos

2.2.1. Fonte dos Organismos de Teste

Culturas puras de Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), Escherichia coli (EC) (ATCC 25922), e Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) foram obtidas da Divisão de Microbiologia do Departamento de Farmácia, Faculdade de Farmácia e Ciências Farmacêuticas, Universidade de Ciência e Tecnologia de Kwame Nkrumah (KNUST), Kumasi. Entretanto, Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA) e Streptococcus pneumoniae (SP) foram cepas clínicas obtidas no Komfo Anokye Teaching Hospital, Kumasi, e cultivadas no Departamento de Farmacêutica, KNUST.

2.2.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

O método de diluição por microbrota foi empregado para determinar as concentrações inibitórias mínimas (CIM) dos derivados da hidrazona e dos medicamentos de referência ciprofloxacina e fluconazol. Placas de microtitulação de 96 poços foram preenchidas com 125 µL de caldo de nutrientes de dupla força, e diferentes concentrações dos derivados da hidrazona foram adicionadas. Os fármacos de referência na gama 12.5 µL/mL a 40 µL/mL foram tratados de forma semelhante. Uma alíquota de 1 × 105 cfu/mL de organismos de teste foi adicionada a cada poço. A placa de controle foi preenchida apenas com caldo de nutrientes e organismos de teste. As placas de teste e controle foram incubadas a 37°C (24 horas para bactérias e 48 horas para fungos), após o que 20 µL de 1,25 mg/ml de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2, 5-difeniltetrazólio (MTT) foi introduzido em cada poço. As observações foram feitas após 20 minutos para uma coloração púrpura, que indica crescimento. As concentrações mínimas dos derivados de hidrazona e drogas de referência que não mostraram mudança de cor nos poços foram consideradas como os valores de MIC . As determinações foram realizadas em réplicas.

2.2.3. Estudos de Modulação Resistente

Para os estudos de modulação, as placas de 96 poços foram preenchidas com 125 µL de caldo de nutrientes de dupla força, e o mesmo volume de 40 µL de fenilidrazonas foi adicionado. Diferentes concentrações nas faixas de 50 µL/ml a 7,812 µL/ml e 15,625 µL/ml a 7,812 µL/ml de ciprofloxacina e fluconazol foram, respectivamente, adicionadas. A cada poço foram adicionados 25 µL contendo 1 × 105 ufc de organismos testados, e as placas foram incubadas a 37°C (durante 24 e 48 horas para bactérias e fungos, respectivamente), após o que 20 µL de MTT foram adicionados a cada poço. O aparecimento de uma mudança de cor de poços nublados para roxo foi registrado e comparado com os MICs apenas dos medicamentos de referência. As determinações foram feitas em réplicas.

3. Resultados e Discussão

3,1. Análise Estrutural das Fenilidrazonas

A via sintética utilizada para a síntese dos compostos foi seguida pela reação padrão de condensação entre aldeídos ou cetonas e hidrazinas, levando em consideração a disponibilidade comercial dos blocos de construção (Esquema 1). Uma abordagem de desconexão retro-sintética nos permitiu identificar vários aldeídos e uma cetona como intermediários chave para a síntese dos compostos desejados. O processo envolve um ataque nucleofílico aromático de 2, 4-dinitrofenilidrazina sobre o carbonilo em uma solução acidificada. Isto foi seguido pela desidratação do intermediário reativo para dar ao produto final 2, 4-dinitrofenilidrazona derivada.

Os dados para os procedimentos sintéticos são incluídos na secção experimental e interpretados de acordo com a sequência: intervalo de ponto de fusão (Mpt.) em grau Celsius (°C), comprimento de onda de absorção máxima do espectro ultravioleta-visível, espectro infravermelho, 1H NMR , 13C NMR e HRMS como ferramenta de confirmação para SA5 (composto 5) (um dos compostos mais ativos).

3.1.1. Espectroscopia UV-Vis

Os espectros para todos os seis compostos foram determinados tanto no ultravioleta como no comprimento de onda visível (200-800 nm) como uma ferramenta de confirmação para BP1 na informação suplementar usando metanol como o branco. As faixas de absorção a 203 nm e 403 nm, que foram obtidas nos espectros eletrônicos das fenilidrazonas sintetizadas, podem ser creditadas às transições, que são contribuídas pelos diversos auxocromos substitutos das fenilidrazonas. Sabe-se que as fenilidrazonas são absorvidas em vários comprimentos de onda dentro da faixa UV visível .

Por exemplo, o composto BP1, quando dissolvido em metanol e escaneado dentro da região UV visível, mostrou absorção a 203 nm, 314 nm e 382 nm, o que poderia ser atribuído à conjugação extensa nas fenilidrazonas após o acoplamento de benzofenona e 2,4-dinitrofenilidrazina. Entretanto, a BP1 composta mostrou absorção máxima a 382 nm, e isto poderia ser atribuído a um aumento na conjugação. Também os compostos BA2, MHB3, VL4, SA5 e DHB6 apresentaram absorção máxima a 378 nm, 392 nm, 394 nm, 386 nm e 403 nm, respectivamente, conforme observado nas informações de suporte.

A conjugação extensa pode ser atribuída à presença de cromóforos nas fenilidrazonas que incluem BP1 (dois cromóforos aromáticos em anel), MHB3 (meta-hidroxi auxocromo), VL4 (um hidroxi e metoxi auxocromo), SA5 (ortoxi auxocromo), e DHB6 (dois hidroxi auxocromo). Isto sugere que as hidrazonas com auxócromos e o auxócromos extra cromóforo tiveram conjugação estendida levando a um deslocamento para a direita (deslocamento bathochromic).

3.1.2. Espectroscopia infravermelha

O espectro infravermelho dá uma idéia dos grupos funcionais em um composto. Do espectro infravermelho do composto 5 como amostra, a presença de banda larga que se estende de cerca de 3300 cm-1 e inclinada para a região do CH alifático de cerca de 3000 cm-1 indica a presença de um grupo funcional hidroxilado, neste caso o de um fenol, conforme observado na informação de suporte.

Também foi observado a partir do espectro IR (informação suplementar) que compostos como MHB3, VL4, SA5 e DHB6 apresentaram forte pico acentuado de sua banda de alongamento C = C na região de 1138-1620 cm-1 em comparação à BP1 e BA2 que não têm a função hidroxilada como mostrado na Tabela 1. A presença do C = N, que é formado a partir da reação de condensação entre a hidrazina e os carbonilos, foi sobreposta pelos carbonos aromáticos hibridizados sp2 (C = C) no benzeno que vibram a 1138-1640 cm-1 dependendo das ligações de substituição. Como as frequências vibracionais C = N se situam entre 1580-1600 cm-1, as suas bandas não podem ser claramente distinguidas na presença das suas contrapartidas aromáticas C = C, como mostram os dados experimentais.

3.1.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

NMR foram realizadas para todas as seis fenilidrazonas sintetizadas usando a técnica de RMN unidimensional (1D) (1H e 13C) e a técnica de RMN bidimensional, realce sem distorção por transferência de polarização para carvões quaternários (DEPT-Q). Estes dados são atribuídos a cada composto na seção experimental. As estruturas foram confirmadas com dados espectrais de 1H NMR, 13C NMR e DEPT-Q, como mostrado nas informações suplementares para os compostos BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5 e DHB6, respectivamente. Considerando DHB6 (composto 6), (Figura 2, Tabela 1), e a partir do próton NMR (informação suplementar), um deslocamento químico mostrando ressonância muito abaixo do campo significou a presença do próton hidroxilado com um sinal singlet. Ele ressonou mais abaixo do que o próton amina secundário devido ao aumento do efeito de desproteção do oxigênio eletronegativo. Este deslocamento químico foi ligeiramente superior ao do grupo hidroxila (9,94 ppm) porque o primeiro está mais próximo do ambiente químico do átomo de nitrogênio eletronegativo na ligação imina. Assim, o primeiro sinal de hidroxil simples a 11,54 ppm foi seguido por um sinal simples de amino próton secundário a 10,11 devido à eletronegatividade do grupo nitrogênio antes do outro sinal de hidroxil. O próton aromático ensanduichado entre dois grupos nitro-electrónicos foi o sinal seguinte a ressonar em campo a 8,86 ppm. Este foi seguido pelo próton próximo ao grupo do amino terciário. O grupo do amino terciário ligado ao protão imine causou a desprotecção e a ressonância do imine prótons a 8,86 ppm com um único sinal. O próton solitário mais próximo do grupo nitro na posição para foi o próximo sinal com um pico de doublet a 7,95-7,97 ppm. O outro próton solitário mais próximo do grupo do amino secundário menos electronegativo também deu um sinal de doublet a 7.64-7.66 ppm. Os outros dois prótons solitários (um entre o diol e o outro orto para a ligação imina) deram um sinal multiplet a 7.52-7.54 ppm, enquanto o próton mais próximo do grupo para hidroxi e duas ligações de carbono longe do grupo imine deram um sinal doublet a 6.38 ppm.

Figura 2

Estrutura química do DBH6 (composto 6) .

DEPT-Q é usado para a diferenciação dos carbonos primários, secundários, terciários e quaternários. No DEPT-Q, os sinais de metilo (CH3) e metano (CH) aparecem para cima na fase positiva, enquanto que os sinais de metileno (CH2) e quaternário aparecem para baixo na fase negativa. O espectro DEPT-Q do DHB6 (informação suplementar) revela a presença de sinais de carbono ascendentes representando apenas seis carbonos methine neste caso ocorrendo em 161,8, 159,1, 148,2, 136,7, 130,1, e 112,0 confirmando os carbonos methine aromáticos e sete carbonos quaternários ocorrendo em 148,2, 130,1, 129,2, 123,6, 116,9, 108,7, e 102,9. O DEPT-Q para os outros compostos pode ser encontrado na informação suplementar.

3.1.4. Espectroscopia de massa

Espectroscopia de massa é usada para a determinação de pesos moleculares precisos e fragmentação de compostos usando técnicas de ionização . O composto SA5 fenilidrazona foi um dos compostos mais ativos após avaliação antimicrobiana. Do espectro de massa de ionização por electrospray (ESI), o pico de íon molecular em modo negativo foi 301,0000 (M-H+), que é a massa real com um intervalo de tolerância de 0,24 (0,41%) a partir da massa teórica de 302,2400. Isto confirmou o peso molecular do composto SA5.

A espectroscopia de massa foi utilizada para confirmar o peso molecular de um dos compostos mais ativos e, portanto, não foi aplicada aos outros.

4. Avaliação Antimicrobiana

4.1. Concentrações Inibitórias Mínimas (MICs)

A concentração inibitória mínima (MIC) é a menor concentração de um agente antimicrobiano que inibiria o crescimento visível do patógeno após 24 h (bactérias) e 48 h (fungos) de incubação . As MICs das fenilidrazonas e dois antibióticos padrão (ciprofloxacina e fluconazol) foram avaliados com o teste de diluição do microbroth contra um painel de seis microorganismos patogênicos: Gram-negativos , Gram-positivos , e C. albicans (fungo, cepa clínica).

Todos os compostos mostraram fraca atividade antimicrobiana contra os organismos testados nas concentrações observadas na Tabela 2. A BP1 mostrou a maior atividade antimicrobiana entre os seis compostos contra os organismos de teste selecionados. BA2, entretanto, teve a menor atividade antimicrobiana com MIC de 699 µM contra todos os organismos do teste. MHB3 teve MIC de 562 µM contra C. albicans e 662 µM e acima contra o resto dos organismos de teste. VL4 registou uma MIC de 602 µM contra todos os organismos de teste excepto S. pneumoniae (MIC = 300 µM). Os MICs de SA5 contra S. pneumoniae e K. pneumoniae foram 165 µM e 331 µM, respectivamente, enquanto para S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, e C. albicans teve um MIC mais alto de 662 µM. DHB6 mostrou atividade contra S. pneumoniae, K. pneumoniae, e C. albicans com MIC de 314 µM, enquanto que para S. aureus, E. coli, e P. aeruginosa teve MIC de 628 µM e acima. A droga antibacteriana de referência usada foi ciprofloxacina, e os MICs registrados foram 2,36 µM contra P. aeruginosa, S. pneumoniae, e K. pneumoniae, enquanto 4,72 µM foi registrado contra S. aureus e E. coli. A droga antifúngica de referência usada foi fluconazol, e o MIC obtido foi 327 µM contra C. albicans. A MIC das fenilidrazonas contra os dois organismos Gram-negativos variou de 552 µM a 699 µM, enquanto a ciprofloxacina padrão foi de 4,72 e 2,36 µM, respectivamente (Tabela 2).

4.2. Atividade de Modulação Resistente

A tendência das fenilidrazonas em sub-MICs para melhorar a atividade de alguns antibióticos comerciais contra cepas resistentes conhecidas foi investigada através do teste de modulação resistente. Das Tabelas 2 e 3, a BP1 (composto 1) com sub-MIC de 50 µM contra S. pneumoniae baixou a MIC de ciprofloxacina de 2,36 para 1.078 µM representando 54,32% de redução no MIC da ciprofloxacina. BP1 também melhorou o desempenho da ciprofloxacina no sub-MIC de 50 µM contra K. pneumoniae de 2,36 µM para 1,078 µM representando 54,32% de redução no MIC dos antibióticos. Novamente, BP1 modulou a atividade do fluconazol contra C. albicans de 327 para 2,156 µM representando 99,34% de redução no MIC do fluconazol. Similarmente, BA2 melhorou a atividade da ciprofloxacina contra S. pneumoniae e reduziu a MIC da ciprofloxacina de 2,36 para 1,36 µM mostrando 42,37% de redução. Além disso, BA2 também modulou a atividade de fluconazol no sub-MIC de 50 µM contra C. albicans e causou uma redução no seu MIC de 327 para 1,23 µM que é indicativo de 99,6% de redução no MIC.

MHB3 modulou a atividade da ciprofloxacina contra S. pneumoniae e Klebsiella pneumoniae causando uma redução no MIC dos antibióticos de 2,36 para 1,29 µM. Esta diminuição na CIV indicou uma redução de 45,33%. O MHB3 também mostrou a modulação da atividade do fluconazol no sub-MIC de 50 µM contra Candida albicans e reduziu o MIC de 327 µM para 5,109 indicando uma redução máxima de 98,43%. VL4 melhorou o desempenho da ciprofloxacina no sub-MIC de 50 µM contra S. pneumoniae e K. pneumoniae. O MIC do antibiótico diminuiu de 2,36 para 1,176 µM. em ambos os casos. Esta diminuição na MIC representou uma redução de 50,17%. VL4 novamente modulou o desempenho do fluconazol no sub-MIC de 50 µM contra C. albicans e reduziu o MIC de 327 µM para 1,176 µM, que mostrou uma redução máxima de 99,64%.

Além disso, o composto 5 (SA5) modulou a atividade da ciprofloxacina no sub-MIC de 50 µM contra S. pneumoniae e K. pneumoniae. O MIC foi reduzido de 2,36 para 1,29 µM em ambos os casos, resultando em 45,34% de redução. SA5 novamente modulou o desempenho do fluconazol no sub-MIC de 50 µM contra C. albicans e suprimiu seu MIC de 327 para 1,29 µM, indicando uma boa redução de 99,61%. DHB6 (composto 6) também modulou a atividade de ciprofloxacina no sub-MIC de 50 µM contra S. pneumoniae e K. pneumoniae e reduziu seu MIC de 2,36 para 1,23 µM em ambos os casos representando 47,88% de redução no MIC. DHB6 também modulou a atividade de fluconazol no sub-MIC de 50 µM contra C. albicans e baixou seu MIC de 327 µM para 1,23 µM representando 99,62% de redução no MIC. SA5 e BP1 foram melhores que as outras quatro fenilidrazonas em atividade modulatória de resistência junto com ciprofloxacina que tinha MIC de 2,58 µM contra P.aeruginosa, seguido por BP1 (17,2 µM). Portanto, a presença de um grupo ortohidroxi em SA5 e grupo de cetonas aromáticas pode ser essencial para atividade modulatória resistente em combinação com ciprofloxacina contra P.aeruginosa Gram-negativa e E. coli. Além disso, a presença do grupo meta-hidroxi (MHB3), um hidroxi e metoxi (VL4), e a ausência de um substituto na porção de benzaldeído do BA2 também melhorou a atividade e pode ser considerada para o desenvolvimento futuro de medicamentos. K. pneumoniae, a outra contraparte Gram-negativa que causa infecções graves, era mais susceptível às fenilidrazonas com 138 a 699 µM. Pela combinação de concentrações sub-inibitórias de fenilidrazonas com ciprofloxacina, a barreira de resistência de K. pneumoniae foi reduzida permitindo uma MIC muito mais baixa de 1,078 de 5,46 µM, uma tendência que é mais impressionante do que a de P. aeruginosa e E.coli.

As fenilidrazonas tiveram atividade similar contra os organismos Gram-positivos variando de 87,3 a 699 µM que também é evidente das propriedades resistentes de Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae.

5. Conclusão

Uma biblioteca de seis novas fenilidrazonas foi sintetizada e caracterizada com sucesso: 1-(2, 4-dinitrofenil)-2-(difenilmetileno) hidrazina , 1-benzilideno-2-(2, 4-dinitrofenil) hidrazina , 3-(2-2-(4-dinitrofenil) hidrazono) metilfenol, 4-(2-(2, 4-dinitrofenil) hidrazono) metil)-2-metoxifenol , (Z)-2-(2, 4-dinitrofenil) hidrazono) metilfenol , e 4-(2-(2, 4-dinitrofenil-hidrazono) metil) benzeno-1, 3-diol.

Como parte do projeto e otimização de futuros medicamentos, as fenilidrazonas podem ser consideradas como backbones estruturais devido à sua viabilidade sintética e bom rendimento. Os compostos apresentaram fraca propriedade antimicrobiana mas demonstraram forte acção moduladora resistente quando combinados com os fármacos padrão. As atividades dos padrões melhoraram significativamente com uma boa redução nos valores de MIC.

A abreviações

Dados disponíveis

Dados da pesquisa estão disponíveis nos arquivos do Departamento de Química Farmacêutica, Faculdade de Farmácia, Universidade de Ciência e Tecnologia de Kwame Nkrumah.

Conflitos de Interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse em relação à publicação deste trabalho.

Contribuições dos autores

A.A, A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A., e B.K.H. conceberam o trabalho de pesquisa e prepararam o manuscrito. C.D. K.A., A.B., e A.A. desenharam e realizaram a síntese dos compostos. C.D.K.A., A.A., e A.I.A. desenvolveram o quadro conceptual e prepararam o manuscrito. C.D.K.A. e B.K.H. interpretaram os resultados espectrais e levaram a cabo a elucidação da estrutura. Y.D.B.A. e A.A. realizaram o ensaio antimicrobiano in vitro e forneceram seus dados experimentais e interpretação dos resultados.

Agradecimentos

Os autores agradecem muito a todo o pessoal e técnicos do Departamento de Química Farmacêutica, Faculdade de Farmácia, KNUST, Kumasi, Gana, pelo apoio. Os autores agradecem muito ao Sr. Francis Amankwah do Departamento de Farmácia (Seção de Microbiologia), KNUST, pelo apoio técnico.

Materiais Suplementares

O arquivo suplementar contém todos os espectros. (Materiais Suplementares)