Abstract
Um paciente urêmico desenvolveu hipercalcemia após infecção por tuberculose, e seus níveis de cálcio ionizados correlacionados com os níveis de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3). Realizamos mais estudos para determinar se os monócitos são locais alternativos de conversão de 1,25(OH)2D3 além das células tubulares renais. Usando um bioensaio ex vivo, neste estudo, descobrimos que a atividade de 1-α hidroxilase (CYP27B1) em monócitos é significativamente maior em pacientes com tuberculose ativa (TB) do que naqueles com contato frequente com TB. Entretanto, quando monócitos de pacientes com TB ativa foram reestimulados com antígeno derivado de Mycobacterium tuberculosis, menos 1,25(OH)2D3 foi observado. Em contraste, o nível de 1,25(OH)2D3 permaneceu inalterado naqueles com contato frequente com a TB. Concluímos que os monócitos podem ser uma fonte alternativa de 1-α hidroxilase que poderia converter 25-hidroxivitamina D3 para a mais ativa 1,25(OH)2D3.
1. Introdução
Tuberculose tem atormentado o mundo desde os tempos pré-históricos. De acordo com um relatório recente, um milhão de pacientes sucumbe à tuberculose e comorbidades relacionadas anualmente . Nas últimas décadas, um tremendo esforço tem sido feito para compreender o processo fisiopatológico da doença. Modelos animais e estudos humanos prepararam o caminho para o esclarecimento das respostas imunológicas individuais à Mycobacterium tuberculosis (MTB) . Estes estudos fornecem evidências de que a vitamina D desempenha um papel importante na resistência humana à tuberculose. A vitamina D tem sido usada para combater a tuberculose há mais de 200 anos. O óleo de fígado de bacalhau e o calciferol, principais fontes de vitamina D, têm sido usados desde o século 17 para tratar pacientes com tuberculose . Em fisiologia normal, após exposição solar, o colesterol 7-de-hidrocolesterol armazenado na pele foi convertido em previtamina D3 seguida de isomerização térmica para vitamina D3 . Em seguida, a vitamina D3 é hidroxilada no fígado para 25-hidroxivitamina D3 (25(OH)D3). Em seguida, 25(OH)D3 é ainda hidroxilada à forma mais ativa da vitamina D3, 1,25(OH)2D3, por 1-hidroxilase (CYP27B1) . As células epiteliais tubulares renais são uma importante fonte de 1- hidroxilase e desempenham um papel fundamental na determinação da concentração de 1,25(OH)2D3 no soro. A presença de CYP27B1 nos tecidos extrarrenais é reconhecida há décadas . O impacto do CYP27B1 extrarrenal na concentração sérica de 1,25(OH)2D3 ainda não foi determinado.
Encontramos um paciente de 34 anos com uremia que tinha recebido hemodiálise regular por 2 anos. O paciente experimentou fraqueza muscular com fadiga durante 2 dias antes de visitar um médico de família. A química do sangue revelou níveis elevados de cálcio ionizado (5,44 mg/dL). Apesar da hipercalcemia, os sintomas do paciente foram aliviados pelo tratamento convencional. Quatro meses depois, o paciente apresentou fraqueza muscular progressiva acompanhada de febre. Nas Urgências, os níveis elevados de cálcio ionizado foram novamente observados (6,88 mg/dL). Além disso, um eletrocardiograma revelou um ritmo cardíaco anormal e um intervalo QT curto com onda T ampliada. Uma radiografia de tórax mostrou infiltração pulmonar no lobo superior direito que posteriormente foi determinada como sendo tuberculose pulmonar. O paciente recebeu então 9 meses de tratamento de antituberculose. Quatro meses após o tratamento, os níveis de cálcio ionizado do paciente normalizados (5,2 mg/dL), com uma resolução completa dos sintomas. Para elucidar a patogênese da hipercalcemia deste paciente, medimos 1,25(OH)2D3 níveis, além dos níveis de cálcio ionizados. Como mostrado na Figura 1, os níveis de 1,25(OH)2D3 foram altamente correlacionados com os de cálcio ionizado.
Alterações no cálcio ionizado e 1,25(OH)2D3 no soro de um paciente com TB e uremia ativa.
Além da expressão renal de CYP27B1, macrófagos e monócitos são considerados sítios extrarrenais importantes da expressão de CYP27B1. Neste estudo, avaliamos o papel dos monócitos no metabolismo da vitamina D3 usando um bioensaio ex vivo. Além disso, estimulamos monócitos com antígeno derivado do MTB para obter mais informações sobre como os monócitos modulam o metabolismo da vitamina D3 em resposta ao desafio bacteriano.
2. Materiais e Métodos
2.1. População do sujeito
Este estudo foi realizado na Kaohsiung Medical University. Os participantes foram estratificados em dois grupos: (1) TB activa e (2) contacto frequente com a TB. Aqueles com tuberculose pulmonar ativa confirmada por uma cultura de escarro e filme torácico foram designados para o grupo da tuberculose ativa (). Os contactos frequentes com tuberculose () incluíram o seguinte: (1) pessoal médico que trabalhou no centro de tuberculose durante pelo menos 10 anos e nunca foi infectado e (2) familiares, clínicos e enfermeiros de pacientes com tuberculose que tiveram contacto a longo prazo com pacientes com tuberculose e nunca foram infectados. Todos os contactos frequentes com TB tinham sido vacinados com BCG e submetidos a uma radiografia torácica anual; quando as radiografias torácicas eram anormais, era realizado um teste Mantoux. Excluímos indivíduos com diabetes, malignidade ou qualquer outra doença que pudesse causar imunodeficiência. Os dois grupos foram de acordo com o sexo e a idade (Tabela 1).
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| A duração da doença foi definida como o intervalo entre o diagnóstico e a coleta de sangue. Duração da exposição foi definida como o intervalo desde o início do trabalho em um centro de tuberculose até a coleta de sangue. |
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2.2. Preparação celular
Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram isoladas do sangue tratado com heparina coletado dos 2 grupos de doadores usando um gradiente padrão Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suécia). As PBMCs (células/mL) foram ressuspendidas em meio RPMI 1640 suplementado com L-glutamina e soro fetal de bezerro a 10%. Após incubação por 1 hora em um frasco de 75 cm2 em uma incubadora umidificada a 37°C com 5% de CO2, o meio contendo células não aderentes foi decantado em um tubo cônico, e o frasco foi lavado duas vezes com meio livre de soro para remover quaisquer células não aderentes residuais. Os monócitos aderentes foram removidos através de raspagem suave com um raspador de células plásticas. As células foram transferidas para um tubo cônico, centrifugadas para remover a solução de lavagem e ressuspendidas às células/mL em meio suplementado. A população celular aderente continha mais de 85% de células CD14+.
2.3. Antígeno
MTB isolado de pacientes com tuberculose foi ressuspenso em solução fisiológica tampão fosfato e eliminado por calor em um banho de água a 70°C por 70 minutos. As bactérias foram então sonicadas usando um sonicador New Highway (Farmingdale, NY, EUA). A concentração proteica do homogeneizado bacteriano foi determinada usando o kit de ensaio de proteína Pierce BCA (IL, EUA) e armazenada a -20°C.
2.4. Análise Citofluorométrica
A análise citométrica foi realizada utilizando um citómetro FACS (Becton Dickinson). Um total de células foi incubado com cada anticorpo monoclonal em quantidades saturantes em 50 μL de tampão de coloração (solução salina balanceada de Hank: 1% BSA e azida de sódio 0,1%) durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavado três vezes com PBS. As células foram preparadas para análise por suspensão em 500 μL de paraformaldeído a 1% em PBS. A população de monócitos foi fechada para análise com base em um gráfico de dispersão lateral e ponto de dispersão para frente. Um total de 5.000 células fechadas foram usadas para cada análise. As células fechadas foram ainda analisadas por coloração fluorescente usando fluoresceina-isotiocianato – (FITC-) conjugado com anti-CD14 (Ancell).
2.5. Quantificação de 1,25(OH)2D3
Monócitos purificados foram cultivados a uma densidade de células/mL em 100 μL em cada poço de uma placa de cultura de 96 poços com 200 nM 25(OH)D3 dissolvidos em uma concentração final de 1% de etanol. Após 3 horas de incubação, foi adicionado 1 mL de acetonitrilo para parar a reação. As células e o meio foram colhidos e combinados com um volume igual de metanol para remover os lípidos. A quantidade de 1,25(OH)2D3 foi determinada utilizando o kit 1,25-dihidroxi-vitamina D 125I RIA (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). Em resumo, 2 mL de água e 5 mL de metanol/água (70 : 30) foram adicionados a um cartucho C18OH para remover sais, lipídios polares e pigmentos sob vácuo. Em seguida, 5 mL de hexano/ cloreto de etileno (90 : 10) foram adicionados ao cartucho C18OH para remover 25(OH)D3, e 5 mL de hexano/isopropanol (99 : 1) foram adicionados para remover 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Cada cartucho de C18OH foi firmemente encaixado dentro de um cartucho de sílica. Depois de adicionar hexano/isopropanol (92 : 8) sob vácuo, o cartucho C18OH foi removido. Finalmente, 1,25(OH)2D3 purificado foi eluido do cartucho de sílica em 5 mL de hexano/isopropanol (80 : 20). Os níveis de 1,25(OH)2D3 foram quantificados por radioimunoensaio (RIA) competitivo utilizando anticorpos anti-1,25(OH)2D3 e anti-1,25(OH)2D3 marcados com 125I.
2,6. Tratamento com antigénios MTB
Monócitos (células/mL) foram incubados com 10 μg/mL MTB e 200 ng/mL 25(OH)D3. Após 3 horas de incubação, foi adicionado 1 mL de acetonitrilo para parar a reacção. O 1,25(OH)2D3 resultante foi purificado a partir das células e do meio e quantificado por RIA. O restante do procedimento foi o mesmo do ensaio anterior.
2,7. Análise estatística
Todos os dados foram analisados usando o teste de Student.
3. Resultados
3,1. Cálcio ionizado e 1,25 Di-hidroxivitamina D3 Concentrações em um paciente com TB e Uremia Ativa
Cálcio ionizado sérico e 1,25(OH)2D3 foram determinados em diferentes pontos de tempo desde a primeira visita até um ano após a conclusão do tratamento de antituberculose. Como mostrado na Figura 1, os níveis de cálcio ionizado correlacionaram-se com a concentração de 1,25(OH)2D3 (Figura 1).
3,2. População do Estudo
Vinte e cinco indivíduos foram recrutados para o grupo de contato frequente com TB e 25 pacientes para o grupo de TB ativo. A média de idade e proporção de sexo não diferiu significativamente entre os grupos. As características do conjunto de dados são apresentadas na Tabela 1.
3.3. 1,25(OH)2D3 Quantificação
Monócitos foram cultivados com 25(OH)D3 durante 3 horas. Então, 1,25(OH)2D3 foi purificado das células e do meio e medido por RIA. Como mostrado na Figura 2, a quantidade de 1,25(OH)2D3 no grupo da TB ativa foi pg/mL (média ± DP), que foi significativamente maior que a do grupo de contato frequente com TB () (). Quando os monócitos foram incubados simultaneamente com MTB e 25(OH)D3 durante 3 horas, a quantidade de 1,25(OH)2D3 no grupo da tuberculose activa diminuiu significativamente em comparação com a quantidade sem MTB ( e , resp.) () (ver Figura 3). Não houve diferença entre monócitos com ou sem exposição à MTB no grupo com TB frequente ( e , resp.).
Quantificação de 1,25(OH)2D3 em pacientes com TB ativa e contatos frequentes com ou sem antígeno de M. tuberculosis (MTB). Os monócitos foram pulsados com 25(OH)D3 com ou sem MTB. A quantidade de 1,25(OH)2D3 com exposição ao MTB diminuiu significativamente em comparação com aquela sem MTB no grupo da tuberculose ativa. Cada coluna representa a média da quantificação de 1,25(OH)2D3. As barras de erro representam o desvio padrão. *Discussão
Observamos que 1,25(OH)2D3 níveis correlacionados com os níveis de cálcio ionizado em um paciente urêmico com tuberculose pulmonar. Na tuberculose pulmonar ativa, os níveis séricos de 1,25(OH)2D3 neste paciente eram altos, o que por sua vez induziu altos níveis de cálcio ionizado. Após o tratamento, tanto os níveis de 1,25(OH)2D3 como os de cálcio ionizado diminuíram. Teoricamente, em um paciente urêmico, a atividade renal de CYP27B1 é trivial. Baixos níveis séricos de 1,25(OH)2D3 são frequentemente observados em pacientes urêmicos. Consistente com o que tem sido observado em humanos, em um modelo anefróico de camundongo, níveis baixos de 1,25(OH)2D3 também são observados. Entretanto, uma fonte extrarrenal de CYP27B1 tem sido descrita há mais de 6 décadas. Harrell e Fisher foram dos primeiros a encontrar a síntese extrarrenal de 1,25(OH)2D3 em condições patológicas . Estes autores estabeleceram a associação entre homeostase de cálcio desregulada e sarcoidose. Posteriormente, os macrófagos teciduais foram mostrados como uma fonte extrarrenal de produção de 1,25(OH)2D3 nesses grupos de pacientes. Foi encontrado um número crescente de tecidos para expressar CYP27B1 por diferentes grupos de estudo, tais como melanócitos cutâneos, macrófagos teciduais e células residuais da placenta. Surpreendentemente, nem todas as células que expressam CYP27B1 possuem atividade enzimática . Para esclarecer o potencial dos monócitos circulantes em contribuir para níveis elevados de 1,25(OH)2D3, utilizamos um bioensaio ex vivo usando 25(OH)D3 como substrato para determinar a actividade do CYP27B1. Nossos resultados demonstram que a atividade do CYP27B1 em monócitos de pacientes com TB ativa é significativamente maior do que a de monócitos de indivíduos com contato frequente com TB. Os monócitos circulantes contribuem para a conversão de 25(OH)D3 para os mais activos 1,25(OH)2D3. Intrigantemente, a vitamina D3 era tradicionalmente considerada como um fator endócrino; 1,25(OH)2D3 produzida em locais locais (túbulos renais) é transportada pelo sangue para afetar outros tecidos ou órgãos, por exemplo, o osso. Entretanto, nas últimas décadas, a vitamina D3 demonstrou desempenhar outros papéis além das funções endócrinas. O 1,25(OH)2D3 produzido pelas células inflamatórias pode estimular a expressão do receptor de vitamina D tanto nas células vizinhas quanto nas próprias células inflamatórias. Ao ligar-se ao receptor de vitamina D e ao receptor de retinóides, o complexo liga-receptor pode ligar-se aos promotores de muitos genes inflamatórios. Devido a estes efeitos, a vitamina D3 foi considerada como tendo funções parácrinas e autócrinas. Em contraste com a função endócrina da vitamina D3 como regulador de cálcio, suas funções parácrinas e autócrinas induzem as células inflamatórias a produzir peptídeos antibacterianos e aumentam o processo de autofagia. Como 1,25(OH)2D3 é produzido localmente e não é transportado para locais alvo para a regulação da homeostase de cálcio, sua produção não afeta os níveis séricos de cálcio. Curiosamente, neste estudo, descobrimos que 1,25(OH)2D3 produzido por monócitos foi um caso especial. Embora 1,25(OH)2D3 produzidos por monócitos possam agir localmente, estas células são transportadas pelo sangue para os tecidos em todo o corpo. O 1,25(OH)2D3 produzido por monócitos também se comporta como um fator endócrino. Os monócitos podem ser as únicas células do nosso corpo que podem orquestrar as funções endócrinas, parácrinas e autócrinas da vitamina D3. Uma questão interessante é qual é a contribuição relativa da fonte monocyte de 1,25(OH)2D3 para o nível total de 1,25(OH)2D3. Dusso et al. observaram que a produção máxima de 1,25(OH)2D3 de monócitos é trivial (em fmole/hora/micrograma de DNA) em comparação com 1,25(OH)2D3 em concentração normal (em pmol/mL) . Mas os dados são de um experimento ex vivo, não sabemos quantos monócitos no corpo são estimulados a produzir 1,25(OH)2D3. Especulamos que a contribuição relativa da fonte monocitária de 1,25(OH)2D3 para o nível total de 1,25(OH)2D3 é pequena na maioria das circunstâncias. Mesmo em pacientes com doença granulomatosa, apenas alguns deles apresentam sintomas clínicos de hipercalcemia resultante do alto nível de 1,25(OH)2D3. Nosso caso indicador é um deles.
Também descobrimos que quando monócitos de pacientes com TB ativa são cultivados com antígeno MTB, a conversão de 1,25(OH)2D3 é significativamente menor do que quando nenhum antígeno é adicionado. No grupo de contato frequente com TB, não houve diferença entre estar com ou sem antígeno MTB. Há duas explicações possíveis para esta observação. Em primeiro lugar, monócitos iniciados de pacientes com TB ativa podem induzir mais atividade de 24(OH)hidroxilase (CPY24) do que suas contrapartes, que ativamente hidroxila 1,25(OH)2D3 ao ácido calcitróico, quando são mais estimulados com antígeno MTB. A vitamina D3 induz não apenas produtos gênicos inflamatórios, mas também a expressão de CPY24 . O CPY24 é uma das principais enzimas catabólicas da vitamina D3. As atividades de CYP27B1 e CYP24 são moduladas de forma diametralmente oposta para controlar os níveis séricos de 1,25(OH)2D3 . Devido a esta acção concertada, a hipercalcemia é raramente observada nos pacientes. O grupo de contato frequente com TB demonstrou uma ação concertada ainda melhor, razão pela qual não houve alteração na conversão de 1,25(OH)2D3 após estimulação com antígeno MTB. Uma segunda explicação é que a atividade do CPY27B1 se esgota quando os monócitos são estimulados pelo antígeno MTB.
mRNA expressão não foi determinada neste estudo pelas seguintes razões. Primeiro, um grande número de monócitos dos participantes foi necessário para o bioensaio ex vivo. Se tivéssemos realizado tanto a expressão quantitativa do mRNA quanto o bioensaio ex vivo, teríamos precisado coletar mais de 30 ml de sangue de cada participante. A coleta desse volume de sangue foi rejeitada pelo nosso comitê de ética. Segundo, como indicado anteriormente, alguns tecidos podem expressar CYP27B1 sem atividade enzimática detectável. os níveis de mRNA nem sempre estão correlacionados com a atividade enzimática. Apesar da expressão de CYP27B1 em alguns tecidos, nenhuma atividade enzimática foi detectada. Em estudos futuros, os níveis de CYP27B1 e CYP24 e os metabolitos da vitamina D3, como ácido calcitróico e 24,25(OH)2D3, devem ser quantificados para esclarecer o metabolismo da vitamina D3 no processo fisiopatológico da tuberculose.
5. Conclusão
Em conclusão, os níveis de cálcio correlacionados com 1,25(OH)2D3 em um paciente urêmico infectado com tuberculose. Além disso, descobrimos que a atividade de CYP27B1 em monócitos é maior entre pacientes com tuberculose ativa do que entre aqueles com contato frequente com TB.
Aprovação Ética
Este projeto de estudo foi aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional do Hospital Kaohsiung Medical University. O número de aprovação é KMUH-IRB-20130103.
Coflito de interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses para este trabalho.
Contribuição dos autores
Yi-Ching Tung e Wen-Chan Tsai realizaram os experimentos e escreveram o trabalho. Tsan-Teng Ou e Wen-Chan Tsai conceberam o estudo e recolheram os espécimes. Todos os autores leram e aprovaram o artigo final.