Antimicrobiano catiónico de grau alimentar ε-polylysine altera transitoriamente a comunidade microbiana intestinal e a função metagenómica prevista nos ratos CD-1 | npj Ciência dos Alimentos

Um biopolímero catiónico antimicrobiano influencia a diversidade da comunidade intestinal murina

40 ratos CD-1 de 6 semanas de idade, do sexo feminino e 40 homens, foram divididos aleatoriamente em quatro grupos e segregados por sexo (i.e. 10 ratos femininos e 10 masculinos por grupo) e alimentados com uma dieta 20% rica em gordura suplementada com (i) maltodextrina isoladamente (MD) que serviu como controle, (ii) maltodextrina + ε-polylysine (PL), (iii) maltodextrina + pectina (P), e (iv) maltodextrina + ε-polylysine + pectina (PL-P). Estudos anteriores mostraram que ratos co-housados juntos exibem comunidades microbianas intestinais semelhantes.38, 39 Assim, pelotas fecais combinadas de cada gaiola foram coletadas em gaiolas metabólicas 24-h e analisadas em três pontos: semana 1 (linha de base), semana 5 (fase intermediária) e semana 9 (fase final) (Fig. 1). O peso corporal e o consumo alimentar não variaram independentemente do grupo de tratamento e durante todo o período experimental.

Para caracterizar a diversidade filogenética, o fragmento do gene 16S rRNA V3/V4 foi sequenciado para produzir 15.739.734 leituras de qualidade após a filtragem.40 Isto forneceu uma profundidade média da amostra de 327.911 leituras sequenciais por comunidade bacteriana. Para avaliar a diversidade α dentro de uma determinada comunidade, o número de unidades taxonômicas operacionais (OTUs) observadas foi calculado usando o UniFrac ponderado.41 As curvas de rarefação para as UTRs observadas (Fig. S1) aproximaram-se de uma assímptota independente da dieta, ponto de amostragem e sexo para indicar a profundidade de sequenciamento suficientemente coberta pela diversidade de UTRs presentes nas comunidades extraídas das amostras fecais.

Ao nível do filo, a soma de Actinobactérias, Bacteroidetes, Deferribactérias, Firmicutes, Proteobactérias, Verrucomicrobia constituiu mais de 99% das UTRs identificadas em todas as amostras analisadas. Como anteriormente relatado,42, 43 o microbioma intestinal murino consiste em contribuições relativamente grandes fornecidas pelos phyla Bacteroidetes e Firmicutes (Fig. 2). Isto é consistente com outras comunidades intestinais de mamíferos, incluindo humanos e primatas não humanos.44, 45 No entanto, as abundâncias relativas de Bacteriodetos (p < 0,05) e Firmicutes (p < 0,05) foram alteradas em resposta ao biopolímero dietético particular (ANOVA multidirecional) (Fig. 2). Curiosamente, ratos alimentados com o complexo ε-polylysine-pectina apresentaram um aumento de Bacteriodetos em 8,82% (p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) com uma redução correspondente de OTUs atribuídas a Firmicutes em 11,13% (p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc). Isto é relativo à estrutura da comunidade determinada no grupo de controle alimentado com maltodextrina (Tabela S1). Além disso, os ratos alimentados com maltodextrina (ou seja, sem complexo de pectina) do grupo ε apresentaram uma comunidade relativamente deficiente para Firmicutes na fase intermediária (ou seja, 5 semanas) do estudo. Notavelmente, as UTRs Firmicute recuperaram a sua concentração inicial no ponto de amostragem de 9 semanas (linha de base: 55,24%, intermediário: 34,71%, final: 59,01%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, intermediário vs. final: p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 e Tabela S3). Exibindo a mesma resposta adaptativa, a fração relativa das OTUs de Bacteriodetos aumentou transitoriamente às 5 semanas de alimentação e convergiu para as concentrações iniciais no ponto de tempo final (linha de base: 35,40%, intermediário: 51,18%, final: 28,82%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, intermediário vs. final: p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 e Tabela S3). Um surto transitório semelhante em Verrucomicrobia ocorreu em ratos alimentados apenas com pectina, para cair para níveis originais no ponto de amostragem final (linha de base: 0,59%, intermediário: 5,46%, final: 1,01%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, intermediário vs. final: p < 0,05, ANOVA Tukey HSD multidirecional post-hoc) (Fig. 2 e Tabela S4). Em agregado, estes resultados indicam que biopolímeros específicos de grau alimentício dirigem transitoriamente a representação fístula dentro do intestino murino. Isto foi observado quando tanto ε-polylysine como pectina foram incorporados individualmente. Entretanto, quando a ε-polilisina foi complexada com a pectina aniônica, este fenômeno não foi observado. É importante notar que fluxos populacionais significativos dentro das Actinobactérias, Deferribactérias e Proteobactérias não foram observados independentemente da dieta (Tabela S5).

Além da perturbação da comunidade ao nível do filo, vários gêneros bacterianos mudaram em resposta aos biopolímeros dietéticos. Isto inclui membros do gênero Bacteroides que foram os taxa mais frequentemente encontrados dentro do intestino do rato (14,32 ± 9,58% em todas as amostras). No total (em ambos os sexos e pontos de amostragem), a representação de Bacteroides variou em relação ao grupo de alimentação dos biopolímeros. Espelhando a resposta do phylum Bacteroidetes, ε-polylysine (p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) e ε-polylysine-pectin complexed treatment (p < 0,05, multi-way ANOVA Tukey HSD post-hoc) aumentou as populações de Bacteroides spp. em 7,95 e 7,46%, respectivamente, em comparação com o grupo controle da maltodextrina (Fig. 3 e Tabela S6). Outras populações bacterianas que foram moduladas por regimes alimentares incluem, Adlercreutzia, Lactobacillus, Turicibacter, e Ruminococcus (ANOVA multidirecional, p < 0,05). Especificamente, a abundância de Adlercreutzia diminuiu independentemente do biopolímero em relação ao grupo alimentado com maltodextrina. Suas populações relativas diminuíram 0,18%, 0,22%, 0,24% em ratos alimentados com ε-polylysine, pectina, e complexos de ε-polylysine-pectina, respectivamente. Além disso, o gênero Ruminococcus diminuiu significativamente em 1,39% em resposta à ε-polylysine e diminuiu em 1,44% no grupo da pectina. Além disso, a dieta com complexo de ε-polylysine-pectina diminuiu significativamente o conteúdo de Lactobacillus em 4,95%, refletindo a diminuição geral de Firmicutes neste grupo. Isto em contraste com a dieta de pectina que enriqueceu para Turicibacter em relação às outras três dietas. Um catálogo completo dos gêneros que diferem em resposta às condições dos biopolímeros é fornecido na Tabela S6.

Maltodextrina é comumente empregada como agente espessante ou envasador em várias aplicações nutricionais. Este polissacarídeo foi utilizado na formulação de todas as dietas de tratamento, e assim serviu como controle para determinar se a maltodextrina por si só enriqueceria para bactérias capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas α-1-4 entre os resíduos de d-glucose. Como tal, a relativa abundância de Coprococcus no intestino do rato foi enriquecida durante o consumo da maltodextrina incorporada nos seus alimentos. A trajetória de resposta incluiu um aumento significativo entre a linha de base e os pontos de amostragem intermediários e entre a linha de base e o ponto de tempo final (linha de base: 0,56%, intermediário: 0,98%, final: 0,91%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, linha de base vs. final: p < 0,05) (Fig. 3 e Tabela S7).

No grupo de tratamento ε-polylysine, a abundância relativa de Bacteroides aumentou transitoriamente, consistente com a oscilação ao nível do filo (linha de base: 8,85%, intermediário: 34,40%, final: 8,74%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, intermediário vs. final: p < 0,05). Uma resposta similar foi observada para Oscillospira (linha de base: 4,96%, intermediário: 2,51%, final: 6,13%, linha de base vs. intermediária: p < 0,05, intermediária vs. final: p < 0,05). Isto é contrastado com uma diminuição transitória das OTUs atribuídas a Ruminococcus (linha de base: 2,17%, intermediário: 0,97%, final: 2,10%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, intermediário vs. final: p < 0,05), e Adlercreutzia (linha de base: 0,49%, intermediário: 0,24%, final: 0,34%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05) (Fig. 3 e Tabela S8). Além disso, Coprococcus spp. exibiu um enriquecimento sustentado durante a alimentação, com aumentos significativos entre a linha de base e o ponto final (linha de base: 0,47%, intermediário: 0,71%, final: 0,91%, linha de base vs. final: p < 0,05) (Fig. 3 e Tabela S8). Isto é consistente com a mesma tendência observada dentro do grupo controle da maltodextrina. Entretanto, as populações de Coprococcus permanecem relativamente estáticas nos complexos de pectina alimentada por micróbios e pectina ε-polylysine-pectina.

Pectina enriquecida transitoriamente para o gênero Akkermansia (linha de base: 0,59%, intermediário: 5,46%, final: 1,01%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, intermediário vs. final: p < 0,05) contribuindo para o aumento intermediário observado da Verrucomicrobia. Em contraste, as populações de Adlercreutzia foram diminuídas no ponto de amostragem intermediário e permaneceram deprimidas na observação final (linha de base de Adlercreutzia: 0,48%, intermediário: 0,23%, final: 0,26%, linha de base vs. intermediária: p < 0,05). A representação do gênero candidato rc4-4 OTU diminuiu proporcionalmente, embora exibisse uma recuperação incompleta para os estados iniciais (linha de base rc4-4: 1,94%, intermediário: 1,04%, final: 1,62%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05) (Fig. 3 e Tabela S9). Curiosamente, Ruminococcus spp. manteve uma trajetória decrescente ao longo do estudo de alimentação com diferenças significativas entre a linha de base e o ponto final (linha de base: 2,32%, intermediário: 1,63%, final: 1,14%: linha de base vs. final: p < 0,05) (Fig. 3 e Tabela S9).

Embora a maioria dos gêneros não tenha mudado em resposta aos complexos de polilisina-pectina ε, Ocscillospira aumentou transitoriamente antes de cair abaixo dos níveis iniciais (linha de base: 3,56%, intermediário: 4,70%, final: 2,44%, intermediário vs. final: p < 0,05). Em contraste, as populações de Parabacteróides foram geralmente inibidas por qualquer um dos tratamentos dietéticos (linha de base: 3,44%, intermediário: 0,79%, final: 0,55%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, linha de base vs. final: p < 0,05). Isto é similar a rc4-4 (linha de base: 2,82%, intermediária: 0,77%, final: 0,48%, linha de base vs. intermediário: p < 0,05, linha de base vs. final: p < 0,05). Na totalidade, os gêneros de microbiota intestinal respondem a aditivos de grau alimentar a nível do gênero, em particular ε-polylysine (Fig. 3 e Tabela S10).

Além de biopolímeros dietéticos influenciando taxas específicas, a composição estrutural da comunidade teve mudanças discerníveis e não aleatórias no agregado. ANOSIM46 com 999 permutações foi utilizado para testar diferenças significativas entre os grupos da amostra com base no UniFrac ponderado.41 Como esperado, a maltodextrina não alterou significativamente a comunidade microbiana intestinal murina alimentada com este controle em camundongos fêmeas ou machos (Fig. 4a, ANOSIM com 999 permutações, p > 0,05). Assim, a pectina (Fig. 4c, ANOSIM com 999 permutações, p > 0,05) e ε-polylysine-pectin complexes (Fig. 4d, ANOSIM com 999 permutações, p > 0,05) não promoveram mudanças significativas dentro da comunidade. Isto está em notável contraste com os microbiomas intestinais que foram alterados transitoriamente apenas pelo ε-polylysine. Como observado com grupos taxonômicos específicos a nível de filo e gênero, a estrutura da comunidade foi perturbada no ponto de 5 semanas para ser posteriormente resolvida no momento final da amostragem. Isto sugere que a composição da população foi corrigida para seu estado inicial através da adaptação ao biopolímero continuamente alimentado (Fig. 4b, ANOSIM com 999 permutações, p < 0,05). Isto não foi observado nos ratos tratados com o complexo de polilisina-pectina ε, indicativo de uma interação de blindagem com a comunidade microbiana.

ε-polylysine transiently shifts predicted metagenome function

O potencial metagenômico inerente aos microbiomas intestinais foi inferido pela Investigação Filogenética de Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt) com base em 16S rRNA dados filogenéticos. Um total de 6.854.103.780 observações foram previstas em 6909 Enciclopédia de Genes e Genomas de Quioto (KEGG) dentro das 48 comunidades triviais que foram perfiladas pelo PICRUSt. Os dados resultantes foram categorizados em 254 vias funcionais que englobam todas as 48 comunidades.

No total, havia 44 vias que foram previstas para mudar significativamente transientemente enquanto ratos consumiam ε-polylysine (ANOVA com correção Bonferroni, p < 0,05) (Fig. 5). Assim como nas alterações da estrutura taxonômica, as amostras intermediárias colhidas em 5 semanas apresentaram um perfil significativamente diferente em relação aos pontos de amostragem inicial e final. Entre essas 44 vias ou redes, 42 vias estão envolvidas no metabolismo bacteriano ou estão previstas para mediar as interações hospedeiro-microbianas, com 18 vias presentes a 0,5% de abundância relativa, com base na média dos três pontos de amostragem (Fig. 5). Destes, oito vias foram previstas para diminuir em 5 semanas e retornar aos níveis basais na amostragem final. Por outro lado, 10 vias previstas apresentaram a tendência oposta e aumentaram temporariamente em abundância. Assim, genes e suas vias relacionadas ao transporte de soluto geral (linha de base: 7,53%, intermediário: 5,88%, final: 7,68%, p < 0,05) e transportadores ABC (linha de base: 3,35%, intermediário: 2,76%, final: 3,44%, p < 0,05) foram suprimidos no estado da comunidade intermediária e finalmente recuperados para os níveis da linha de base. Isto sugere que as necessidades metabólicas, e/ou concentrações ambientais de solutos desejáveis, podem ser brevemente diminuídas antes da restauração da estrutura microbiana. Além disso, os processos metabólicos centrais previstos envolvidos na transição dos metabolismos de carboidratos e proteínas para um estado reversível, enquanto o hospedeiro consome a dieta enriquecida com polilisina ε. Isto se reflete em vias glicolíticas/fermentativas (linha de base: 1,05%, intermediário: 1,13%, final: 1,08%, p < 0,05), metabolismo piruvado (linha de base: 1,01%, intermediário: 1,07%, final: 1,02%, p < 0.05), metabolismo da frutose e manose (linha de base: 0,085%, intermediário: 0,099%, final: 0,089%, p < 0,05), e genes associados à fosforilação oxidativa (linha de base: 1,12%, intermediário: 1,23%, final: 1,08%, p < 0,05). Este último KO provavelmente envolvido na respiração anaeróbica e enriquecido de forma transitória no ponto de tempo intermediário. Além do catabolismo dos carboidratos, as vias associadas ao fluxo de nitrogênio foram deslocadas às 5 semanas, incluindo os metabolismos de aminoácidos e nucleotídeos (linha de base: 1,47%, intermediário: 1,60%, final: 1,50%, p < 0,05), e o metabolismo da histidina (linha de base: 0,062%, intermediário: 0,067%, final: 0,061%, p < 0,05). Inicialmente, tínhamos inicialmente a hipótese de que as marcas registradas do catabolismo da lisina seriam enriquecidas nos metagenomas previstos do mice-fed ε-polylysine, seja na dieta PL ou PL-P. Entretanto, este sinal não foi observado na análise PICRUSt, sugerindo que a ε-polylysine não selecionou populações bacterianas que aumentaram o potencial catabólico da lisina.

Quando os metagenomas previstos responderam à dieta ε-polylysine, não foram detectadas diferenças significativas nos outros três grupos de alimentação. Isto inclui o mice-fed ε-polylysine complexado com pectina, fornecendo suporte adicional para a proteção eletrostática para mitigar a influência antimicrobiana da ε-polylysine. A pectina sozinha não altera a estrutura da comunidade ou a função prevista.

O sexo do hospedeiro influencia o micróbio basal mas não a trajetória de resposta

Correatos masculinos e femininos foram observados para determinar se a atividade do biopolímero dentro do micróbio é dependente do sexo. Assim, vários táxons bacterianos colonizaram machos e fêmeas assimetricamente e de forma não aleatória. Isto inclui o filo Verrucomicrobia encontrado em concentrações mais elevadas em ratos fêmeas do que machos no agregado (fêmeas: 4,96% de 24 amostras, machos: 2,63% de 24 amostras, p < 0,05, ANOVA multidirecional) (Tabela S11). Muito disto pode ser contabilizado por diferenças nas populações Akkermansia (fêmeas: 4,50%, machos: 2,63% de 24 amostras, p < 0,05). Além disso, ratos fêmeas abrigaram populações significativamente maiores de gêneros bacterianos Parabacteroides (fêmea: 2,47%, macho: 0,5%, p < 0,05) e Bilophila (fêmea: 2,13%, macho: 0,01%, p < 0,05). Em contraste, ratos machos foram colonizados por maiores concentrações de Odoribacter (fêmea: 0%, macho: 0,92%, p < 0,05), Turicibacter (fêmea: 0,02%, macho: 0,21%, p < 0,05), Clostridium (fêmea: 0,01%, macho: 0,10%, p < 0,05), e o gênero candidato rc4-4 (fêmea: 0.16%, macho: 2,46%, p < 0,05) (Tabela S12).

Além das diferenças taxonômicas, existem diferenças estruturais para a comunidade atribuíveis ao sexo animal evidentes na distância UniFrac visualizada pela análise coordenada principal (PCoA) na Fig. 6a. Assim, a microbiota intestinal observada em ratos fêmeas e machos agrupados por sexo, e de forma mais similar dentro do respectivo sexo do que um ao outro (Fig. 6a, ANOSIM com 999 permutações, p < 0,05). Além disso, a agregação hierárquica de microbiomas e gêneros bacterianos com base em sua relativa abundância exibiu um padrão similar, pois as comunidades bacterianas dentro do mesmo sexo tendem a se agregar (Figs. S2 e S3). A diversidade filogenética média dentro do grupo de ratos do sexo feminino masculino é menor do que a dos homens (Fig. 6b, teste t, p < 0,05), enquanto não foram observadas diferenças entre ratos do sexo feminino e masculino no número total de OTUs observadas e no índice Chao 1 (Fig. S4).

Em contraste com as diferenças estruturais entre microbiomas alojados por fêmeas e machos, apenas três vias metagenómicas previstas variaram significativamente. Isto inclui operações relacionadas à transcrição (feminino: 0,0092%, masculino: 0,0051%, p < 0,05), biossíntese de antibióticos aminoglicosídeos (feminino: 0,087%, masculino: 0,080%, p < 0,05) e metabolismo de glicerofosfolípidos (feminino: 0,55%, masculino: 0,52%, p < 0,05). Não está claro se estes estão subjacentes às diferenças metabólicas expressas entre os dois sexos hospedeiros. A conservação da função apesar da variação taxonômica é consistente com a redundância do potencial genético previamente observada em outras comunidades microbianas.46, 47

Embora as características dependentes do sexo, o efeito específico dos tratamentos com biopolímeros permanece independente do sexo, como indicado pela análise PCoA (Fig. 3). Especificamente, ε-polylysine altera transitoriamente o microbioma murino no ponto de amostragem intermediário, independentemente do sexo. Enquanto que a pectina ou pectina complexada com ε-polylysine não altera os ratos fêmeas e machos que abrigam a microbiota. Um caminho de resposta semelhante é evidente nos fluxos a nível do filo, uma vez que a representação de bactérias e Firmictues é temporariamente deslocada em resposta a ε-polylysine em ambos os sexos (Fig. S5). Além disso, os microbiomas intestinais derivados de ambos os sexos apresentam a mesma alteração na Verrucomicrobia quando alimentados com pectina (Fig. S5). Além disso, em relação ao grupo alimentado com maltodextrina, a dieta complexa de ε-polylysine-pectina aumentou os Bacteriodetes e diminuiu os Firmicutes independentemente do sexo. Estes resultados indicam que as características dependentes do sexo (por exemplo, hormônios) não agiram sinergicamente ou antagonisticamente com os biopolímeros da dieta para alterar a estrutura da comunidade em geral, e dentro dos principais phyla.

Interessantemente, os biopolímeros da dieta podem alterar a representação do gênero que é um pouco dependente do sexo. A relativa abundância de Parabacteróides (sexo*tratamento p < 0,05, ANOVA multidirecional), Clostridium (sexo*tratamento p < 0,05, ANOVA multidirecional), Coprococcus (sexo*tratamento, p < 0,05, ANOVA multidirecional), e Bilophila (sexo*tratamento p < 0,05, ANOVA multidirecional) exibiram modesta dependência do sexo hospedeiro (Fig. S6). Em ratos fêmeas, o conteúdo de Coprococcus foi maior no grupo pectina em relação aos outros três grupos em ratos fêmeas (MD: 0,69%, PL: 0,63%, P: 0,98%, PL+P: 0,65%, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). No entanto, em ratos machos, as OTUs de Coprococcus do grupo pectina foram reduzidas nos microbiomas em comparação com os outros três grupos (MD: 0,94%, PL: 0,77%, P: 0,45%, PL+P: 0,78%, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Além disso, a bilófila foi reduzida na dieta feminina de mico-alimentos ε-polylysine em relação à dieta complexa de pectina ε-polylysine (MD: 0,51%, PL+P: 1,63%, p < 0,05), enquanto que o microbioma dos ratos machos não exibia este fluxo populacional ligado ao sexo. Além disso, as interações de sexo, pontos de amostragem e biopolímero influenciaram a abundância relativa observada do gênero Turicibacter (p < 0,05), Clostridium (p < 0,05), Coprococcus (p < 0,05), e do gênero candidato rc4-4 (p < 0,05).