Linhas celulares
As linhas celulares e suas fontes são as seguintes: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932), e HK-2 (ATCC CRL-2190). As células THP-1 foram gentilmente cedidas pelo Stem Cell Bank, Academia Chinesa de Ciências. As células foram cultivadas em meio DMEM (para 293T e 786-O), MEM (para HK-2) ou RPMI 1640 (THP-1) com 10% de soro fetal bovino e 2 mM l-glutamina, a 37 °C na presença de 5% de CO2. Antes da infecção por bactérias, tratadas por proteínas ou quimiotaxia, o meio foi trocado por meio livre de soro.
Estirpes bacterianas e plasmídeos
As estirpes bacterianas e plasmídeos utilizados neste estudo estão listados na Tabela Suplementar S3. As cepas de E. coli foram cultivadas a 37 °C em meio Luria-Bertani (LB) sob condições estáticas durante 12 h com antibióticos apropriados quando necessário, nas seguintes concentrações: Kanamicina a 50 μg/ml, ampicilina a 100 μg/ml, e cloranfenicol a 15 μg/ml. A cepa ΔhlyA foi gerada pela substituição do hlyA por um gene de gato usando λ-Red recombinase. Para gerar a estirpe ∆hlyA p-hlyA, o gene hlyA foi amplificado por PCR a partir do cromossoma da estirpe UPEC CFT073 e ligado ao pTRC99A nos sítios das enzimas KpnI e XbaI, e o plasmídeo foi transformado em ∆hlyA por electroporação. Os genes hlyC e hlyA da CFT073 ou a codificação do ADN complementar (cDNA) para Nectin-2 foram amplificados por PCR e clonados em pET-28a ( + ) para produzir proteínas recombinantes activas FLAG ou HlyA ou Nectin-2 marcadas com HlyA. Para produzir FLAG-tagged HlyA (pro-HlyA) inactivo, o gene hlyA sem hlyC do CFT073 foi clonado em pET-28a ( + ) nos sítios das enzimas XbaI e XhoI. A Myc-tagged Nectin-2 foi integrada ao vetor pLenti-Hygro para transfecção.
HlyA, pro-HlyA, e a expressão e purificação da proteína recombinante Nectin-2 humana
Expressão da HlyA recombinante ou pro-HlyA foi realizada em E. coli BL21 (DE3), e a expressão da Nectin-2 foi realizada em Roseta (DE3). Antes da indução com 100 μM IPTG, as bactérias foram cultivadas a 37 °C até atingirem uma OD600 de 0,6 a 0,8. As bactérias cultivadas foram recolhidas por centrifugação (8000 × g durante 5 min a 4 °C) após 12 h de indução a 16 °C em LB com IPTG. As bactérias foram lisadas com lisozima e ultra-som e o sobrenadante foi centrifugado para remover partículas (18.000 × g durante 30 min a 4 °C). As proteínas foram então purificadas utilizando o Sistema de Purificação Ni-NTA (GenScript, Nanjing, China). As proteínas foram eluídas com 250 mM de imidazol. Frações com os fragmentos de HlyA foram agrupadas, dialisadas em 150 mM imidazol, 50 mM imidazol e duas vezes com PBS. Posteriormente, as frações contendo a proteína desejada foram concentradas a 500 μl usando Unidades Filtrantes Centrífugas Amicon Ultra-15 (Millipore, Burlington, MA, EUA). O último tampão de diálise que tinha um ambiente iônico similar ao da proteína HlyA purificada foi usado como controle para a proteína purificada em experimentos. A concentração final da proteína foi determinada espectrofotometricamente (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) usando o BCA Protein Assay Kit (23225, Thermo Scientific).
Mouse pyelonephritis model
Todos os estudos com animais foram revistos e aprovados pelo Animal Care and Use Committee da Tianjin Medical University, Tianjin, China. Fizemos todos os esforços para minimizar o sofrimento animal e para reduzir o número de animais utilizados. As fêmeas C57BL/6J, com 6-8 semanas de idade, foram adquiridas da Academia de Ciências Médicas Militares (Pequim, China). O modelo de rato com pielonefrite aguda foi estabelecido como descrito anteriormente.53 As bactérias foram cultivadas durante a noite em meio LB estático a 37 °C. As bactérias cultivadas foram peletizadas por centrifugação (5000 × g durante 5 min a 4 °C) e ressuspendidas em PBS para obter uma densidade de 2 × 1010 UFC/ml. Em um intervalo de 3 h, ratos anestesiados C57BL/6J fêmeas foram inoculados intrauretraalmente com 50 μl cepas UPEC (109 UFC) duas vezes.54,55 Em 12, 24 e 48 hpi, os ratos foram sacrificados e seus rins foram retirados assepticamente e homogeneizados em 1 ml de PBS contendo 0,025% de Triton X-100, e depois diluídos em série para enumeração das bactérias. Às 24 hpi, os tecidos renais também foram utilizados para citometria de fluxo, histologia e análise pró-inflamatória de citocinas.
Análise de citometria de fluxo
Suspensão de células únicas foram geradas por digestão com 1,5 mg/ml de colagenase IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 100 ng/ml de DNase I em PBS durante 30 min a 37 °C sob agitação leve. As suspensões celulares digeridas foram então filtradas através de um filtro de 70-μm (352350, BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) para obter suspensões unicelulares. Os receptores Fc foram bloqueados usando CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, EUA) e as suspensões unicelulares foram então incubadas com os seguintes anticorpos: anti-CD11b conjugado ao APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G conjugado ao PE (127608, Biolegend), anti-F4/80 conjugado ao FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c conjugado ao PE (127608, Biolegend), anti-CD206 conjugado ao PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). As células foram analisadas em um FACSCanto II Flow Cytometer (BD Biosciences) usando o software Flow Jo (FlowJo, Ashland, OR, USA).
H&E coloração e imunohistoquímica
Kidneys foram fixados em formalina tampão fosfato a 10% por pelo menos 24 h. O tecido fixado foi então embutido em parafina e cortado em cortes de 5-μm. As lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina. As alterações histopatológicas renais foram avaliadas usando uma escala de 6 pontos, na qual 0, 1, 2 e 3 indicavam lesões histológicas normais, leves, moderadas e graves (danos patológicos localizavam-se principalmente dentro da medula e da junção cortical-medular); enquanto 4, 5 e 6 indicavam lesões histológicas leves, moderadas e graves (danos patológicos localizavam-se principalmente em mais partes do rim). Os exames histológicos foram analisados por duas pessoas que estavam cegas aos grupos experimentais.56,57 Para análise imunohistoquímica, os cortes foram corados com anticorpos anti-Nectina-2 (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, EUA). As imagens foram adquiridas sob um microscópio (BX46, Olympus, Tokyo, Japão).
Análise de imunofluorescência de tecidos e células
Os rins foram embutidos no composto OCT com nitrogênio líquido. Os blocos congelados foram cortados em secções de 5µm, e secos ao ar à temperatura ambiente durante 1 h, e fixados com acetona fria durante 10 min. As secções congeladas foram então imediatamente submersas em metanol durante 20 min e depois metanol com peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min. Os tecidos foram bloqueados com albumina de soro bovino (BSA) a 5% durante 1 h, incubados com anticorpo anti-F4/80 (ab6640, Abcam, 1:200), anticorpo anti-Ly6G (ab210402, Abcam, 1:200), anticorpo Nectin-2, (ab135246, Abcam, 1:200) em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C quando necessário. As lâminas foram então lavadas cinco vezes com PBS, e incubadas com o anticorpo secundário Alexa Fluor 488/549 (Proteintech, 1:200) durante 1 h à temperatura ambiente. Para a visualização dos núcleos, os cortes de tecido foram contra-manchados com DAPI. As imagens foram adquiridas sob microscópio fluorescente (IX73, Olympus). As 293 células de 293T transfectadas com pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 foram cultivadas em um vidro de cobertura em câmara Lab-Tek e tratadas com 75 nM HlyA durante 6 h, fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 min e submetidas a coloração de imunofluorescência com anticorpo anti-MYC-Tag (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) e anticorpo HA-Tag (2367S, 1:200, CST) a 4 °C durante a noite. O Alexa Fluor 488/594 com segundo anticorpo (Proteintech) foi utilizado incubando à temperatura ambiente durante 1 h. As células foram imersas num microscópio de fluorescência confocal (FV1000-D, Olympus).
Infecção de células epiteliais renais com estirpes UPEC
Células epiteliais renais humanas (786-O ou HK-2) foram semeadas em placas de 24 poços, 24 h antes das infecções UPEC. Para a inibição da ADAM10, as células foram pré-incubadas com o inibidor ADAM10 GI254023X (Sigma-Aldrich) durante 20 h antes das infecções. As células foram infectadas com bactérias na multiplicidade indicada de infecção (MOI) durante 6 h ou estimuladas com as concentrações indicadas de HlyA purificado ou pró-HlyA durante 12 h. Em algumas experiências, as células foram tratadas com ∆hlyA (MOI 0.01) com HlyA purificada (75 nM) durante 6 h. Para o ensaio de invasão, após 6 h de infecção, as células foram lavadas cinco vezes com PBS e tratadas com 200 μg/ml de gentamicina durante 1 h para matar bactérias extracelulares. As células foram então lavadas duas vezes com PBS e lisadas com 500 μl de 0,2% de triton X-100 em PBS e banhadas em placas de ágar LB para enumerar as bactérias intracelulares.
Ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA)
Níveis deGM-CSF no sobrenadante de células 786-O infectadas, células 786-O tratadas com HlyA/pro-HlyA, ou rins homogeneizados pós-infecção foram medidos usando um kit de desenvolvimento ELISA (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China) de acordo com as instruções do fabricante. Os rins dos ratos foram removidos e homogeneizados em PBS contendo 1% de Triton X-100 e comprimidos completos de inibidores de protease livres de mini-EDTA (11697498001, Roche, Indianapolis, IN). Os homogeneizados foram então incubados em gelo durante 30 min e centrifugados a 10.000 × g durante 10 min a 4 °C; os sobrenadantes foram coletados e utilizados para o ensaio ELISA de GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 e MIP-2 de acordo com as instruções do fabricante (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China).
Ensaio de citotoxicidade
Supernatantes de cultura de células de 786-O tratadas por proteínas purificadas ou tampão de diálise durante 12 h, e detectados para desidrogenase láctica (LDH) usando um kit de ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox-96 (G1780, Promega, Madison, WI, EUA).
Amostras de urina de pacientes
Amostras de urina foram coletadas de pacientes infectados por cepas UPEC submetidos a tratamento no Segundo Hospital da Universidade Médica de Tianjin, e a presença do gene hlyA na cepa UPEC isolada da urina de paciente individual foi determinada por PCR (Tabelas Suplementares S2 e S4). A urina foi concentrada a 200 μl usando Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units (UFC901024, Millipore), e então o líquido concentrado foi detectado pelo kit de desenvolvimento ELISA (Neobioscience Technology Company). Os estudos associados às amostras de pacientes foram aprovados pelo Comitê de Ética da Tianjin Medical University, e o consentimento livre e esclarecido por escrito foi obtido de todos os pacientes.
RNA extração e qRT-PCR
786-O células foram infectadas com CFT073, ∆hlyA ou ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) durante 4 h. O RNA foi extraído utilizando um Kit de Extracção de RNA Total (Solarbio, Pequim, China) de acordo com o protocolo do fabricante e transcrito inversamente utilizando o Kit de Síntese de cDNA RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific). qRT-PCR foi realizado utilizando uma mistura de Master Masterização Verde SYBR Universal FastStart (Roche, Basileia, Suíça) num sistema de PCR em Tempo Real Rápido 7900 (Roche). As condições de ciclo de PCR foram de 95 °C durante 5 min, seguidas de 40 ciclos de 95 °C durante 20 s, 60 °C durante 20 s, e 72 °C durante 20 s. β-actin foi utilizado como controlo endógeno e os dados foram normalizados com base no nível de transcrição de β-actin no tipo selvagem e quantificados utilizando o método comparativo do limiar crítico 2-∆∆Ct. Os primers utilizados estão listados na Tabela Complementar S4.
ensaios de quimiotaxia
Realizaram-se ensaios de migração celular utilizando câmaras Transwell (tamanho do poro 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA). As células de THP-1 (2 × 106 em 200 μl) foram ressuspendidas em meio RPMI 1640 sem soro e adicionadas à câmara superior. O sobrenadante de células infectadas 786-O foi misturado com 1 μg/ml de anticorpo neutralizante contra GM-CSF humano (502203, BVD2-23B6, Biolegend) ou IgG2a de controle (400515, Rat IgG2a, Biolegend) e incubado por 30 min. Em seguida, 600 μl do meio contendo o sobrenadante foi adicionado à câmara inferior como quimiotractor. Após 3 h ou 6 h de incubação a 37 °C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2, as células migradas na câmara inferior foram contadas.
Lipossomas de clodronato e tratamento de anticorpos anti-MG-CSF
Para eliminar macrófagos, 200 µl de PBS ou lipossomas de clodronato foram administrados a ratos por via intravenosa 24 h antes da infecção.32,33 Para neutralizar GM-CSF, o anticorpo neutralizante contra GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) ou controle IgG2a (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) foi injetado intravenoso em ratos 1 h antes da infecção.33,58
Anti-corpos e western blotting
Anti-corpos foram obtidos das seguintes empresas: anticorpo monoclonal anti-FLAG (F1804, Sigma-Aldrich), anticorpo anti-MYC-Tag (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, EUA), e anticorpo anti-Nectin-2 (ab135246, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Os lisados de células inteiras foram preparados usando tampão de lise RIPA (Millipore), com inibidores de protease completos (Roche, Basiléia, Suíça). O Kit de Ensaio de Proteínas BCA (Thermo Fisher) foi utilizado para determinar a concentração de proteínas. Para revelar a ligação de anticorpos foram utilizadas as IgG conjugadas com HRP (1:10000, Sigma-Aldrich) ou IgG anti-rato (1:10000, Sigma-Aldrich). Complexos imunoativos foram detectados usando Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore) e expostos a uma máquina GE Amersham Imager 600.
Far-western blotting e análise LC-MS/MS
O protocolo far-western blotting foi realizado como descrito anteriormente.59 786-O células foram lavadas duas vezes com PBS gelada, e as proteínas da membrana celular foram isoladas usando um Kit de Extração de Membrana e Proteína de Citosol (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) de acordo com o protocolo do fabricante. As proteínas solúveis associadas à membrana foram analisadas usando eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida em 10% géis. As proteínas foram então transferidas para a membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha). As proteínas transferidas foram renaturadas utilizando tampão AC, reduzindo gradualmente a concentração de guanidina HCl.59 Em seguida, a membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado no tampão TBST durante 1 h. Posteriormente, a membrana foi incubada com 30 μg/ml de HlyA purificado com FLAG ou tampão de diálise durante a noite a 4 °C. Após a lavagem, a membrana foi incubada com 1:1000 anticorpos anti-FLAG diluídos (Sigma-Aldrich) durante a noite a 4 °C em 5% de leite desnatado no tampão TBST. Em seguida, a membrana foi cuidadosamente lavada e incubada com anticorpo anti-rato conjugado com HRP IgG (1:10000, Sigma-Aldrich)
As bandas diferenciais entre o grupo tampão de diálise e o grupo FLAG-tagged HlyA foram identificadas usando LC-MS/MS, realizado usando um espectrômetro de massa nanoLC-LTQ-Orbitrap XL (Thermo, San Jose, CA, EUA) acoplado a um sistema Eksigent nano LC 1D mais HPLC em Majorbio (Xangai, China). Os peptídeos Tryptic foram totalmente digeridos enzimaticamente e ionizados usando a ionização por nano electrospray.33 Os dados foram analisados usando um espectro de massa de varredura completa (300 a 1800 m/z). Finalmente, Proteome Discoverer (versão 1.4.0.288, Thermo Scientific) foi usado para analisar os dados de EM.
Interferência de RNA e superexpressão de Nectin-2
RNAs (siRNAs) de interferência maligna para os genes alvo e um siRNA de controle codificado (siScr) foram sintetizados pela GenePharma (Shanghai, China). Os siRNAs foram transfectados em células 786-O ou HK-2 usando Lipofectamina 3000 (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 foi transfectado em células 786-O ou HK-2 usando Lipofectamina 3000 (Invitrogen) para sobreexpressar a Nectin-2. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram analisadas para expressão de proteínas usando o western blotting. As sequências dos siRNAs estão listadas na Tabela Suplementar S4.
Immunoprecipitação
293T células foram transfectadas com o vector pLenti-Hygro ou pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2, e depois cultivadas durante 48 h. As células foram então incubadas com FLAG-tagged HlyA (75 nM) durante 6 h após a transfecção e foram recentemente lisadas em tampão de lise (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 % NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) para ensaios de western blotting ou imunoprecipitação (IP). 786-O células foram incubadas com FLAG-tagged HlyA (75 nM) ou tampão de diálise durante 6 h e depois lisadas utilizando tampão de lise para o ensaio de proteína IP. Os sobrenadantes celulares foram incubados com contas anti-FLAG M2 (A2220, Sigma-Aldrich) ou contas anti-Myc M2 (A7470, Sigma-Aldrich) durante 12 h a 4 °C para a proteína IP marcada com FLAG ou Myc-tagged. Para a proteína Nectin-2 IP, os sobrenadantes celulares foram incubados com anticorpos anti-Nectin-2 (ab135246, Abcam) durante 12 h a 4 °C, e depois incubados com a proteína A/G agarose (20241, Thermo Fisher) durante 2 h a 4 °C. Como controle foi utilizada a IgG de coelho normal (2729S, CST). Após a incubação, os precipitados foram coletados por centrifugação, lavados cinco vezes com o tampão de lise e analisados por immunoblotting usando anticorpo monoclonal anti-FLAG, anticorpo anti-MYC-Tag, ou anticorpo anti-Nectin-2.
Bactericida expressa, recombinante purificada FLAG-tagged HlyA (1 µg) foi incubada com 1 μg de Nectin-2 recombinante purificado expresso em bactérias em tampão de ligação (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1% Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20% glicerina,1% BSA) durante 12 h. Os complexos foram então submetidos à proteína FLAG-tagged IP ou à proteína Nectin-2 IP. Finalmente, as proteínas complexadas foram analisadas usando immunoblotting.
Análise estatística
A significância estatística das diferenças entre os grupos foi testada usando a análise de variância (ANOVA). O teste não-paramétrico Mann-Whitney foi usado para calcular a significância estatística nos experimentos in vivo.