Znaczniki białek fluorescencyjnych

Wprowadzenie

Białka fluorescencyjne (FPs) są używane jako znaczniki białek od połowy lat 90-tych głównie w biologii komórki i mikroskopii fluorescencyjnej. Znaczniki te nie tylko zrewolucjonizowały biologię komórki poprzez umożliwienie obrazowania prawie każdego białka, ale są również wykorzystywane w zastosowaniach biochemicznych. Ważnym przykładem jest immunoprecypitacja i oczyszczanie powinowactwa białek znakowanych FP, co było możliwe dzięki rozwojowi żywic powinowactwa o wysokiej wydajności, czystości i powinowactwie, takich jak Nano-Traps firmy ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).

W tym blogu przedstawiamy przegląd

• zielonych białek fluorescencyjnych
• czerwonych białek fluorescencyjnych
• białek samoznakujących, które wymagają kowalencyjnego sprzężenia cząsteczki fluorescencyjnej

Typy białek fluorescencyjnych

Większość badaczy stosuje białka fluorescencyjne wewnętrzne GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP lub mCherry. Alternatywnie, wprowadzono zewnątrzpochodne fluorescencyjne lub samoznakujące białka, które wymagają kowalencyjnego sprzężenia cząsteczki fluorescencyjnej z białkiem niefluorescencyjnym, np. znaczniki białkowe SNAP, CLIP i Halo. Te samoznakujące białka fluorescencyjne mają pewne zalety użytkowe w stosunku do samoistnych FP ze względu na właściwości ich barwników fluorescencyjnych.

Rysunek 1: Struktury białek fluorescencyjnych.

(A) Białka fluorescencyjne (FP) takie jak EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP itd. mają tylko niewielką liczbę wspólnych reszt, ale składają się w konserwowaną strukturę β-barrel. Ich fluorescencja powstaje w wyniku cyklizacji szkieletu i utleniania trzech reszt aminokwasowych w centrum tego cylindra (zaznaczone po prawej), co prowadzi do powstania dwupierścieniowego chromoforu. Ten proces chemiczny określany jest jako dojrzewanie chromoforu, jest nieodłącznym elementem fałdu białkowego i zależy jedynie od zmiennych środowiskowych, takich jak temperatura i stężenie tlenu, ale nie od dodatkowych enzymów. Kolor, fotostabilność, wydajność kwantowa i inne właściwości spektralne białek samoistnie fluorescencyjnych są wynikiem mutacji w obrębie aminokwasów tworzących chromofor lub znajdujących się w pobliżu chromoforu.

(B) Białka samoistnie fluorescencyjne, takie jak HaloTag, są niefluorescencyjne w swojej podstawowej apo-formie. Dopiero jeśli do białka HaloTag zostanie dodany odpowiedni aktywowany fluorofor, fluorofor ten zostanie wychwycony i kowalencyjnie związany przez resztę HaloTag D106, zmieniając fluorescencję HaloTag. (Identyfikatory PDB dla struktur: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)

Zielone białko fluorescencyjne meduzy (GFP) i jego pochodne są nadal najczęściej używanymi białkami fluorescencyjnymi w badaniach biomedycznych. Ostatnio wprowadzono dodatkowe zielone białka fluorescencyjne, które pochodzą od innych organizmów. Białka te posiadają ten sam podstawowy skład co GFP, ale różnią się znacznie na poziomie sekwencji. Dlatego wymagają one nowych, dedykowanych narzędzi badawczych, takich jak przeciwciała.

Oryginał: GFP

Zielone białko fluorescencyjne zostało po raz pierwszy wyizolowane z meduzy Aequorea victoria w 1962 roku przez Osamu Shimomurę. Ma długą zieloną fluorescencję z przesunięciem Stokesa (ex 395nm; em 509 nm). 30 lat później Douglasowi Prasherowi udało się w końcu sklonować sekwencję GFP, a Martin Chalfie wyraził ją in vivo. Później laboratorium Rogera Tsien’a rozwinęło GFP w zestaw prawdziwych narzędzi badawczych. Shimomura, Chalfie i Tsien zostali uhonorowani Nagrodą Nobla w 2008 roku. Zobacz wykład Rogera Tsien’a na temat Nagrody Nobla tutaj: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.

Naukowcy opracowali mnogość wariantów GFP o różnych właściwościach. Te FPs mają różne właściwości funkcjonalne i spektralne. Pierwszym znaczącym ulepszeniem GFP była mutacja (S65T), która zwiększyła intensywność i stabilność sygnału fluorescencji. Główny pik wzbudzenia został przesunięty do 488 nm (Heim i in., 1995). Wspólny wariant EGFP jest zmodyfikowaną wersją GFP, co ułatwia praktyczne zastosowanie GFP w wielu różnych organizmach i komórkach.

Zielone białko fluorescencyjne GFP jest również znane jako avGFP, wtGFP i gfp10; EGFP jako wzmocnione GFP i GFPmut1.

https://www.fpbase.org/protein/avgfp/

https://www.fpbase.org/protein/egfp/

TurboGFP

Zgłoszone w 2004 r. TurboGFP jest szybko dojrzewającym i jasnym dimerycznym zielonym białkiem fluorescencyjnym pochodzącym z CopGFP z widłonoga Pontellina plumata. Copepod TurboGFP jest ewolucyjnie odległe od białek fluorescencyjnych pochodzących od meduz, takich jak EGFP i dzieli tylko około 20% sekwencji z powszechnie stosowanymi wariantami GFP. Dlatego większość przeciwciał anty-GFP, w tym GFP-Nanobody używane w GFP-Trap, nie wiąże się z TurboGFP.

https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/

mNeonGreen

mNeonGreen pochodzi z multimerycznego białka żółtej fluorescencji lancetnika Branchiostoma lanceolatum. Stąd mNeonGreen jest ewolucyjnie odległe od FP pochodzącego od meduzy. mNeonGreen i wspólne pochodne GFP mają tylko około 20% identyczności sekwencji. Ze względu na niskie podobieństwo sekwencji, oczekuje się, że narzędzia powinowactwa (tj. przeciwciała) dla wariantów GFP nie będą wiązać się z mNeonGreen. Z pewnością zostało to wykazane dla odczynników powinowactwa firmy ChromoTek (anty-GFP Nanobodies/ VHHs i przeciwciała).

Po raz pierwszy opublikowany w 2013 roku, mNeonGreen jest do trzech razy jaśniejszy niż GFP. Jest to wschodzące, monomeryczne wszechstronne zielone/żółte białko fluorescencyjne do zastosowań obrazowania, w tym mikroskopii superrozdzielczej. Ponadto, mNeonGreen działa jako akceptor dla cyjanowych białek fluorescencyjnych w aplikacjach transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET). Wydaje się, że jest to najjaśniejsze monomeryczne zielone białko fluorescencyjne znane do tej pory i ma szybkie tempo dojrzewania.

https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/

Porównanie GFP, TurboGFP, i mNeonGreen

.

.

Właściwości	EGFP (najczęściej stosowana pochodna GFP)	turboGFP	mNeonGreen
Odkrycie/ pierwsza publikacja
Origin	GFP from Jellyfish Aequorea victoria	CopGFP from copepod Pontellina plumata	multimeryczne żółte białko fluorescencyjne z lancetnika Branchiostoma lanceolatum
Szybkość dojrzewania (w 37°C)	25 min	25 min	10 min
Tożsamość sekwencji z EGFP	(100%)	~20%	~20%
Czy pochodzi od GFP?	Tak	Nie	Nie
Struktura	Słaba dimer	Dimer	Monomer
Wspólne warianty	AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, monomeryczny eGFP A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP	TurboGFP, CopGFP	mNeonGreen
Maksimum ekscytacji/emisji	488 nm/ 509 nm	482 nm/ 502 nm	506 nm/ 517 nm
Długość/ masa cząsteczkowa (MW)	239 aminokwasów, 26.9 kDa	2x 232 aminokwasy, 2x 26 kDa	237 aminokwasów, 26.6 kDa
Narzędzia badawcze oferowane przez ChromoTek	Immunoprecypitacja: GFP-Trap Immunofluorescencja: GFP-Booster, Rabbit anti-GFP antibody PABG1 Western blot: Rat anti-GFP antibody Kontrola: oczyszczone białko EGFP	Immunoprecypitacja: TurboGFP-Trap	Immunoprecypitacja: mNeonGreen-Trap Immunofluorescencja: Mouse anti-mNeonGreen antibody Western blot: Mouse anti-mNeonGreen antibody

Białka czerwonej fluorescencji (RFP) są FP, które emitują czerwono-pomarańczowe światło fluorescencyjne. Pierwszym RFP, który stał się komercyjnie dostępny był DsRed. Został on pozyskany z ukwiałów morskich Discosoma sp. w 1999 roku.

DsRed ma pewne immanentne problemy praktyczne: (i) Jego czas dojrzewania wynosi około 24 godzin, co czyni go nieprzydatnym do eksperymentów krótkoterminowych. (ii) Tetrameryczna forma DsRed może zakłócać działanie białek, do których jest przyłączona. (iii) Jego fotostabilność jest raczej niska.

W konsekwencji, DsRed został poddany mutagenezie ukierunkowanej na miejsce, aby stać się powszechnie stosowanym jako genetycznie zakodowany znacznik fuzyjny. Ostatecznie stworzono monomeryczne pochodne RFP o lepszych parametrach fluorescencyjnych (w zakresie jasności i fotostabilności) oraz wyższej wydajności dojrzewania. Ponadto, wygenerowano pochodne o fluorescencji pomarańczowej, czerwonej i dalekoczerwonej. Te monomeryzowane wersje RFP stały się cennymi narzędziami badawczymi mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (znane również jako „mFruits”), mKO, mRFP (a.k.a. mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2, i DsRed-Express etc.

Dodatkowe RFP zostały zidentyfikowane u innych antozoanów (tj. ukwiałów i koralowców), ale i te białka były w większości tetramerami. Dlatego nie zostały one jeszcze zoptymalizowane do użytku w badaniach.

mRFP (znane również jako mRFP1)

Pierwszy monomeryczny wariant dsRed, genetycznie opracowany w laboratorium Rogera Tsien, został po prostu nazwany mRFP (lub mRFP1), czyli monomeryczne czerwone białko fluorescencyjne. W porównaniu do dsRed, mRFP1 charakteryzuje się nieco niższym poziomem absorpcji, wydajności kwantowej i fotostabilności. Jednak jego szybkość dojrzewania jest około 10 razy szybsza niż DsRed, co skutkuje podobną efektywną jasnością przy ekspresji w żywych komórkach.

https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/

mCherry

mCherry jest prawdopodobnie najczęściej stosowanym wariantem RFP. Jest to monomeryczne czerwone białko fluorescencyjne o szerokim zastosowaniu jako białko fuzyjne w różnych typach komórek. Podobnie jak inne RFP mFruit, mCherry pochodzi z wariantu dsRed mRFP1 w drodze ewolucji kierowanej przez laboratorium Rogera Tsien. W porównaniu do innych mFruitów, mCherry charakteryzuje się najwyższą fotostabilnością, najszybszym tempem dojrzewania i doskonałą odpornością na pH. Ma jednak niższą wydajność kwantową niż mRFP1.

https://www.fpbase.org/protein/mcherry/

mPlum

Laboratorium Rogera Tsien’a wytworzyło również dalekoczerwoną monomeryczną pochodną mRFP1/dsRed, nazwaną mPlum. Dalekoczerwone RFP są korzystne dla zastosowań w obrazowaniu całego ciała, ponieważ główne absorbery tkankowe, takie jak woda, lipidy i hemoglobina są prawie przezroczyste w zakresie emisji 650-900 nm. Jak większość przesuniętych ku czerwieni RFP, mPlum charakteryzuje się wydłużonym przesunięciem Stokesa.

https://www.fpbase.org/protein/mplum/

Porównanie mCherry, mRFP (mRFP1), i mPlum

.

.

.

Właściwości	mCherry	mRFP (mRFP1)	mPlum
Odkrycie/pierwsza publikacja
Origin	DsRed from sea anemone Discosoma sp.	DsRed od sea anemone Discosoma sp.	DsRed od sea anemone Discosoma sp.
Szybkość dojrzewania (w 37°C)	15 min	60 min	100 min
Struktura	Monomer	Monomer	Monomer
Agregacja	nie	nie	nie
Maksimum ekscytacji/emisji	587 nm/ 610 nm	584 nm/ 607 nm	590 nm/ 649 nm
Długość/ masa cząsteczkowa (MW)	236 aminokwasów, 26.7 kDa	228 aminokwasów, 25,4 kDa	229 aminokwasów, 25,6 kDa
Narzędzia badawcze dostarczone przez ChromoTek	Immunoprecypitacja: RFP-Trap Immunofluorescencja: RFP-Booster, Rat anti-RFP antibody Western blotting: Mouse anti-RFP antibody	Immunoprecypitacja: RFP-Trap Immunofluorescencja: RFP-Booster, Rat anti-RFP antibody Western blotting: Mouse anti-RFP antibody	Immunoprecypitacja: RFP-Trap Immunofluorescencja: RFP-Booster, Rat anti-RFP antibody Western blotting: Mouse anti-RFP antibody

Zewnętrznie fluorescencyjne znaczniki białkowe Halo, SNAP i CLIP wymagają kowalencyjnego wychwytu małego liganda fluorescencyjnego, aby przekształcić się w białko fluorescencyjne. W tym celu te samoznakujące znaczniki białkowe pochodzą z enzymów, które katalizują tworzenie wiązań chemicznych: Znaczniki SNAP i CLIP są wariantami alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA, które reagują odpowiednio z pochodnymi benzyloguaniny i benzylocytozyny. HaloTag pochodzi od dehalogenazy haloalkanowej i reaguje z alkilohalogenkami (rysunek 1).

Ogólnie rzecz biorąc, zarówno samoistnie jak i zewnątrzpochodne białka fluorescencyjne są połączone z białkiem zainteresowania, aby umożliwić jego obrazowanie komórkowe i wykrywanie. Jednakże, zewnątrzpochodne białka fluorescencyjne wymagają dodania reaktywnego fluoroforu, co ma kilka zalet:

• Wyższa wydajność kwantowa i fotostabilność
• Silna fluorescencja zarówno w żywych, jak i utrwalonych komórkach
• Większy wybór barwników fluorescencyjnych
• Pojedynczy konstrukt genetyczny umożliwia wybór różnych fluoroforów do wielobarwnego obrazowanie/ multipleksowanie
• Fluorescencja inicjowana tylko po dodaniu etykiety

Dostępność trzech zewnątrzpochodnych białek fluorescencyjnych o różnych specyficznościach substratu/ligandu umożliwia ich ortogonalne wykorzystanie w eksperymentach multipleksowych, również w połączeniu z samoistnymi FP.

W zależności od potrzeb eksperymentalnych, można użyć ligandów przenikających przez komórki opartych na tetrametylodaminie (TMR), zieleni oregońskiej, diAcFAM lub kumarynie, które łatwo przekraczają błonę komórkową w celu znakowania białek wewnątrzkomórkowych. Alternatywnie, ligandy nieprzepuszczalne dla komórek oparte na nieprzepuszczalnych fluoroforach takich jak Alexa Fluor® 488 i 660 mogą być stosowane do szybkiego znakowania powierzchni komórek.

Comparison of HaloTag, SNAP-Tag, i CLIP-Tag

.

Właściwości	HaloTag	SNAP-Tag	CLIP-Tag
Odkrycie/pierwsza publikacja
Origin	Haloalkanowa dehalogenaza z Rhodococcus rhodochrous	ludzka O6-.alkiloguanina-DNA-alkilotransferaza	ludzka O6-alkiloguanina-DNA-alkilotransferaza
Struktura	Monomer	Monomer	.	Monomer
Reaktywność	Pochodne chloroalkanu	O6-…Pochodne benzylguaniny	Pochodne benzylocytozyny
Ligandy	Barwniki przepuszczalne dla komórek lub nie przepuszczalne, fluorofory, biotyna, i kulki	Cell permeable or non-permeable dyes, fluorofores, biotin, and beads	Cell permeable or non-permeable dyes, fluorofores, biotin, i kulki
Maksimum ekscytacji/emisji	Zależy od sprzężonego fluoroforu	Zależy od sprzężonego fluoroforu fluoroforu	Zależy od sprzężonego fluoroforu
Długość/ masa cząsteczkowa (MW)	297 aminokwasów, 33.6 kDa	182 aminokwasy, 19,4 kDa	182 aminokwasy, 19,4 kDa
Narzędzia badawcze oferowane przez ChromoTek	Immunoprecypitacja: Halo-Trap Western blotting: mouse anti-HaloTag antibody	Immunoprecypitacja: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: rat anti-SNAP/CLIP-tag® antibody	Immunoprecipitation: SNAP/CLIP-tag-Trap Western blotting: rat anti-SNAP/CLIP-tag® antibody

HaloTag

Samoznakujący się HaloTag został wyprowadzony z enzymu dehalogenaz haloalkanowych DhaA z Rhodococcus rhodochrous. Jego miejsce aktywne zostało genetycznie zmodyfikowane tak, aby nieodwracalnie wiązało substraty z linkerów chloroalkanowych. Dzięki tego typu samobójczej inhibicji, regeneracja miejsca katalitycznego enzymu w celu dalszej dehalogenacji nie jest już możliwa. W zależności od wybranego substratu, HaloTag przekształca się w znacznik białka fluorescencyjnego lub może być unieruchomiony na przykład na kulkach agarozowych.

Ponieważ dehalogenaza haloalkanowa nie występuje w komórkach eukariotycznych i u większości prokariotów, w tym u E. coli, nie będzie tła znakowania.

SNAP-tag

Samoznakujący znacznik białkowy SNAP-tag pochodzi od ludzkiej O6-alkiloguaniny-DNA-alkilotransferazy (hATG), która jako białko typu dzikiego usuwa uszkodzenia alkilacji z DNA. Powstały w ten sposób wariant hAGT zastosowany jako SNAP-tag reaguje kowalencyjnie z pochodnymi O6-benzyloguaniny (tj. fluorescencyjną etykietą sprzężoną z grupami opuszczającymi guaninę lub chloropirymidynę poprzez linker benzylowy) w sposób nieodwracalny i wysoce specyficzny. W reakcji znakowania podstawiona grupa benzylowa substratu jest kowalencyjnie przyłączona do SNAP-tag.

CLIP-tag

CLIP-tag jest zmodyfikowaną wersją SNAP-tag, zaprojektowaną do reakcji z benzylocytozyną, a nie pochodnymi benzyloguaniny. W połączeniu z SNAP-tag, CLIP-tag umożliwia ortogonalne i komplementarne znakowanie dwóch białek jednocześnie w tej samej komórce.

Przewodnik po wyborze białek fluorescencyjnych
Shaner N.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf

Białka zielonej fluorescencji:
Białko zielonej fluorescencji
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.

Wzmocniona zielona fluorescencja
Heim, R., Cubitt A.B. and Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0

Strukturalne podstawy szybkiego dojrzewania białka zielonej fluorescencji Arthropoda
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A and Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.

Jasne monomeryczne zielone białko fluorescencyjne pochodzące z Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. and Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413

Białka czerwonej fluorescencji:

Ulepszone monomeryczne czerwone, pomarańczowe i żółte białka fluorescencyjne otrzymane z czerwonego białka fluorescencyjnego Discosoma sp.
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. and Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037

Monomeryczne białko czerwonej fluorescencji
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699

Ewolucja nowych białek nieantygenowych poprzez iteracyjną hipermutację somatyczną
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.

Recovery of Red Fluorescent Protein Chromophore Maturation Deficiency through Rational Design
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. and Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463..

Halo, SNAP, and CLIP:

Releasable SNAP-tag Probes for Studying Endocytosis and Recycling
Cole N.B. and Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252

Site-Specific Protein Labeling with SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Current protocols in protein science / redakcja, Coligan J.E. et al., 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73

An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. and Johnsson K. (2008)
Chemia i Biologia 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007

HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. and Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k

Ogólna metoda kowalencyjnego znakowania białek fuzyjnych małymi cząsteczkami in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. and Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging
Provost C.R. and Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876

Wyłącznie do użytku badawczego.

Produkty i technologia firmy ChromoTek są objęte przyznanymi patentami i oczekującymi zgłoszeniami, które są własnością lub są dostępne dla firmy ChromoTek GmbH na podstawie wyłącznej licencji.

ChromoTek, Chromobody, F2H, GFP-Trap, Myc-Trap, RFP-Trap, Spot-Tag, Spot-Label i Spot-Trap są zarejestrowanymi znakami towarowymi firmy ChromoTek GmbH. SNAP-tag jest zastrzeżonym znakiem towarowym, a CLIP-tag jest znakiem towarowym firmy New England Biolabs, Inc. Nanobody jest zastrzeżonym znakiem towarowym Ablynx, firmy Sanofi. Produkty innych dostawców mogą być znakami towarowymi lub zastrzeżonymi znakami towarowymi odpowiednich dostawców. Oświadczenia dotyczące produktów innych dostawców są podane zgodnie z naszą najlepszą wiedzą.