Trójwymiarowa rekonstrukcja aparatu żerowego kleszcza Ixodes ricinus (Acari: Ixodidae): nowe spojrzenie na mechanizm odżywiania się krwią

Radiograficzne obrazowanie samicy I. ricinus

W tym miejscu pokazujemy, że zestaw CRYTUR (oparty na mikroognisku X-RayWorx, źródle promieniowania rentgenowskiego i detektorze promieniowania rentgenowskiego CRYCAM) jest wysoce odpowiedni do zapewnienia szybkiej i nieniszczącej obserwacji struktur wewnętrznych samic kleszczy impregnowanych osmem. Rycina 1A przedstawia mięśnie odwodziciela cheliceralnego sięgające do obszaru drugich par odnóży, grubość kutikuli, mięśnie w obrębie odnóży oraz palpy (Ryc. 1A, Movie 1). Model 3D uzyskany z rentgenowskich obrazów projekcyjnych 2D dostarczył dalszych informacji przestrzennych o powierzchownych strukturach kapturki samicy (Ryc. 1B), porównywalnych z obrazowaniem podglądowym za pomocą SEM (Ryc. 1D), z możliwością wizualizacji także niektórych struktur wewnętrznych (np. mięśni, podstaw chelicerae i gardła) w różnych wirtualnych przekrojach (Ryc. 1B). Rozdzielczość tomografii rentgenowskiej wynosiła 8,060 µm i została obliczona na podstawie analizy Fouriera ze zrekonstruowanego wirtualnego wycinka w płaszczyźnie bocznej obecnej w środku rekonstruowanego obiektu. Skonstruowaliśmy wykres uśrednionego promieniście widma mocy i na podstawie kryterium Rayleigha oceniliśmy granicę oddzielenia sygnału od szumu na 8,94% odległości między podłogą szumu a wartością szczytową. Ponieważ model rentgenowski był rekonstruowany z obrazów projekcyjnych w zakresie od 0° do 180° z krokiem 10°, rozdzielczość jest technicznie prawie izotropowa. Jednak rozdzielczość ta nie była wystarczająca do obserwacji aparatu gębowego nimfy (ryc. 1C,D, zobacz porównanie rozmiarów aparatu gębowego samicy i nimfy w tym samym powiększeniu).

Seryjny przekrój SEM

Dwuwymiarowy model aparatu żerowego nimfy I. ricinus, który został zrekonstruowany na podstawie seryjnych ultratinowych przekrojów żywicznych, ujawnił relacje ślinianki i kanału pokarmowego z trzonkami kapturowymi (chelicerae, hypostom) i innymi strukturami towarzyszącymi, głównie mięśniami (Fig. 2, Filmy 2 i 3)14.

Zewnętrznie z capitulum ślina i mączka krwawa są wydalane/wysysysysysane do wąskiej szczeliny, kanału przedoczodołowego, utworzonego między rowkiem hypostomu po stronie brzusznej a chelicerae po stronie grzbietowej (ryc. 2A). U Rhipicephalus (dawniej Boophilus) microplus cienka błona, zwana też rynienką, pokrywa rowek hypostomalny12. Co ciekawe, struktury tej brakowało u Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 i I. ricinus. Wewnątrz capitulum ślina/krew przechodzi dalej do jamy salivarium, a ta wspólna droga kończy się oddzieleniem kanału pokarmowego od salivarium (Ryc. 2A,B). Od strony grzbietowej kleszcza, kanał pokarmowy znajduje się poniżej salivarium. Salivarium nie jest strukturą trwale umocowaną; powstaje raczej w wyniku umieszczenia chelicerae powyżej grzbietowej strony hypostomu. Kanał pokarmowy oddziela się od drogi wspólnej, otwierając się do gardła. Jego dach tworzy początkowo drobna blaszka (ryc. 2B, zielona strzałka), która w głębi capitulum powiększa się do krótkiego pręcika (ryc. 2C,I, zielony) i dalej do większej sklerotyzowanej płytki przypominającej skrzydełko (zwanej też alae) (ryc. 2E,I, zielony). Wszystkie te struktury razem tworzą labrum. W dolnej części błony śluzowej znajduje się wyrostek zębopodobny przylegający do otworu gardłowego (ryc. 2C,E, czarne strzałki). Ta zębopodobna struktura została opisana u I. hexagonus, I. holocyclus i Rhipicephalus microplus9,12,16. Zębopodobny wyrostek wydaje się pasować do rowka otworu gardła, dlatego przypuszcza się, że jest on ważną częścią zastawki gardłowej. Zidentyfikowanie tego zębopodobnego wyrostka jako labrum jest uzasadnione jego podobieństwem do labrum kleszczy argasid, które również rozciąga się od dachu gardła do kanału pokarmowego13,16. Budowa anatomiczna kanału pokarmowego, warg sromowych i zastawki u I. ricinus jest zgodna z powolnym procesem żerowania u tych kleszczy, w którym długie impulsy ssania przeplatają się z impulsami wydzielania śliny podczas długiego okresu żerowania na krwi. U kleszczy miękkich natomiast, labrum rozciąga się dystalnie na całej długości kanału pokarmowego. Jest to zgodne z szybkim procesem żerowania u tych kleszczy, u których szybkie trzepotanie brodawki jest zsynchronizowane z szybkim ssaniem i ślinieniem się w celu zdobycia pokarmu w ciągu zaledwie 1-2 godzin13. W oparciu o nasze obserwacje EM, ta przednia część dachu gardła nie była połączona z mięśniami i prawdopodobnie tworzy nieruchomą (podporową) część zastawki (Ryc. 2B). Dach gardła połączony jest z płytkami podhipostomowymi tworzącymi boki i dno gardła (ryc. 2C białe strzałki). Płyty te połączone są z dużymi pasmami mięśni dylatacyjnych przyczepionych po przeciwnych stronach do kutikuli brzusznej. Przednie mięśnie rozszerzające gardło (ADM, przedstawione na ryc. 2C,E,I jako struktury o jasnoróżowym zabarwieniu) znajdują się tylko w przedniej części gardła, a ich skurcz/rozluźnienie umożliwia otwarcie/zamknięcie zastawki w otworze gardłowym9,12. ADM są przyczepione do górnego rogu i głębokich boków przedniej części gardła. Środkowa część ścian gardła związana jest z inną grupą mięśni rozszerzających, których skurcz rozszerza światło gardła na boki. Te boczne mięśnie rozszerzające gardło (LDM) widoczne są na ryc. 2G, a na ryc. 2I,J jako struktury o głębokim różowym zabarwieniu. LDM umożliwiają masywne rozszerzenie światła gardła, prawdopodobnie również dzięki podwójnej ścianie w kształcie litery Y w części przedniej (ryc. 2G) i potrójnej ścianie w kształcie litery Y w części tylnej gardła w przekroju poprzecznym (ryc. 2H) opisanym przez Arthura i wsp.9 oraz Sonenshine’a i Andersona13. Naprzemienny skurcz i rozkurcz obu grup mięśni rozszerzających powoduje rozszerzenie gardła, zsynchronizowane z otwarciem zastawki przedniej, tworząc silny impuls ssania. Rozluźnienie LDM, po zamknięciu zastawki gardłowej, ściska gardło i kieruje połkniętą krew ku tyłowi do przełyku i jelita środkowego. Synchronizacja czasowa pomiędzy otwarciem/zamknięciem otworu gardłowego, skoordynowana z otwarciem i zamknięciem zastawki gardłowej oraz ściśnięciem/poszerzeniem światła w środkowej części gardła umożliwia ssanie, jak również przemieszczanie pokarmu do przełyku, a także zapobiega regurgitacji krwi z powrotem do żywiciela9,12. Wewnętrzna wyściółka gardła jest sklerotyzowana, podczas gdy ściana przełyku wyścielona jest komórkami nabłonkowymi (ryc. 2A). Przełyk przechodzi przez synganglion i łączy się z jelitem środkowym (dane nie pokazane).

Ślinianka jest dużą jamą znajdującą się pomiędzy gardłem a chelicerae (ryc. 2A-E). Przednia część salivarium jest wspólna dla przejścia krwi i śliny, następnie gardło jest oddzielone od dna salivarium przez maleńką blaszkę (patrz wyżej). Dach i boczne ściany salivarium są wzmocnione przez sklerotyzowaną płytkę cheliceralną (ChP na Rys. 2C,E,F i czerwoną strukturę pokazaną na Rys. 2M), która sięga dalej w głąb ciała kleszcza. W tylnej części ślinianki, boczne strony tej płytki połączone są z mięśniami przymocowanymi na przeciwległych końcach do bocznych stron jamy ciała kleszcza. Te boczne mięśnie salivarium (LMS), widoczne są na Rys. 2E,F,K,L zaznaczone jasnofioletowym kolorem. Skurcz mięśni powoduje spłaszczenie blaszki, która jest ściśle połączona ze ścianą ślinianki, co prowadzi do zwężenia/zamknięcia wewnętrznej przestrzeni ślinianki, jednak tylko w jej tylnej części za oddzieleniem gardła.

Tuż przed końcem jamy ślinianki, sparowane przewody ślinowe wchodzą do jej bocznych rogów12. Oba przewody ślinowe są otoczone arkuszem tkanki (TSD na Rys. 2C,E,F,M,N, ciemnofioletowy), który prawdopodobnie elastycznie mocuje przewody ślinowe do bocznych rogów ślinianki.

Symulacja ślinienia i ssania krwi na podstawie modelu 3D

Podczas procesu żerowania u kleszczy jxodid, ślinienie przebiega na przemian z powolnym lub szybkim ssaniem krwi i może obejmować okres odpoczynku. Procent czasu poświęcanego na każdą z tych czynności podczas zarastania samicy jest zmienny i zależy od pory dnia, wielkości kleszczy, itd.18. W filmie 4, animujemy zarówno kanał pokarmowy jak i kanał dla przechodzenia śliny z powiązanymi strukturami i pokazujemy jak te struktury funkcjonują. Proces żerowania większości kleszczy z rodzaju ixodida rozpoczyna się od wydzielania substancji podobnych do cementu, co pozwala na umocowanie kleszcza w skórze żywiciela i uszczelnia szczelinę pomiędzy zmianą żerową a wprowadzonymi aparatami gębowymi23,24,25. Okres ślinienia może być zakończony krótkim wybuchem śliny16,17,18,19. Wydalanie śliny jest prawdopodobnie ułatwione przez wibracje tylnej części dna salivarium; w grę może wchodzić również ruch podstaw kości policzkowych (Movie 6). Przed rozpoczęciem ssania krwi, otwór tylnej części ślinianki zostaje zwężony przez mięśnie boczne rozciągnięte pomiędzy dnem ślinianki a boczną ścianą ciała kleszcza. Po tej czynności następuje otwarcie zastawki gardłowej i rozszerzenie przedniej części gardła spowodowane skurczem mięśni rozszerzających przednich. Następnie środkowa część gardła zostaje rozciągnięta wzdłuż osi podłużnej i krew zostaje wciągnięta do gardła. Przednia zastawka gardła zostaje zamknięta, po czym ściana gardła ponownie się kurczy i krew zostaje przepchnięta do przełyku. Ta fala perystaltyczna jest powtarzana do momentu rozpoczęcia ślinienia. Na początku ślinienia boczne mięśnie ograniczające śliniankę rozluźniają się, powiększając tym samym jamę ślinianki. Powtarzające się opuszczanie i podnoszenie dachu ślinianki w jej tylnej części prawdopodobnie ułatwia dostarczanie śliny do kanału przedoczodołowego.