Circadian zegary biologiczne są biochemiczne oscylatory, które cykl około co 24 godziny i które mogą być resetowane (entrained) przez ekspozycję na światło i inne sygnały środowiskowe. U zwierząt istnieje centralny oscylator w mózgu, który kontroluje zachowanie circadian całego organizmu, jak również obwodowych oscylatorów w niektórych tkankach. Oscylacja wynika z pętli sprzężenia zwrotnego transkrypcji z udziałem zestawu czynników transkrypcyjnych zegara, w tym bezczasowy (Tim), okres (Per), zegar (Clk) i Bmal1, jak również kryptochromów. Kryptochromy ulegaj± wszechobecnej ekspresji w organach i tkankach wszystkich organizmów i s± to na ogół białka j±drowe reguluj±ce ekspresję genów. Najlepiej zbadane kryptochromy zwierzęce to kryptochrom Drosophila Cry i kryptochromy myszy Cry1 i Cry2 , a dwa kryptochromy Arabidopsis CRY1 i CRY2 zostały również szeroko zbadane.
Drosophilacryptochromes
Drosophila Cry jest białkiem głównie jądrowym, które pośredniczy w regulacji zegara okołodobowego przez światło, chociaż można go również znaleźć w cytosolu . Reguluje on zegar okołodobowy poprzez bezpośrednie oddziaływanie z białkiem Tim w celu tłumienia pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego zegara (Rysunek 3a). Światło stymuluje interakcję Cry-Tim, która promuje ubikwitynację i zależną od proteosomów degradację Tima oraz hamuje tworzenie heterodimeru Per-Tim. Zahamowanie heterodimeru białek Clock i Cycle przez heterodimer Per-Tim zostaje w ten sposób zwolnione i faza oscylacji okołodobowej zostaje zresetowana (Rysunek 3a). Kryptochrom nie jest jednak jedynym fotoreceptorem, który reguluje zegar okołodobowy u Drosophila. Rytmiczność behawioralna muchy crybmutant, która nie posiada funkcji Cry, może jednak być regulowana w odpowiedzi na światło, chyba że transdukcja sygnału przez pigment wzrokowy jest również wyeliminowana. Oprócz swojej roli jako fotoreceptora w regulacji centralnego oscylatora Drosophila, Cry ma również niezależną od światła rolę w funkcji peryferyjnego oscylatora okołodobowego .
Regulacja zegara okołodobowego przez kryptochromy zwierzęce. (a) U Drosophila, Cry tłumi pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego zegara okołodobowego przez wiązanie się z Timem w sposób zależny od światła; powoduje to zależną od proteosomu ubikwitynową degradację Tima (Ubq, ubikwitynacja), a tym samym zahamowanie działania heterodimeru Per-Tim. Bez Cry heterodimer Per-Tim przedostawałby się do jądra i hamował wiązanie białek cyklu zegarowego (Per, Clk i Bmal1) z E-box w promotorach genów zegarowych, uniemożliwiając ich ekspresję. (b) U ssaków, kryptochromy są integralną częścią pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego. Białko Cry oddziałuje z Per w celu zahamowania aktywności czynników transkrypcyjnych Clk i Bmal1, a tym samym zahamowania transkrypcji. Kryptochromy mogą być również zaangażowane w fotostymulację zegara okołodobowego ssaków; wiadomo, że geny zegarowe są regulowane w odpowiedzi na sygnały neuronalne z siatkówki w odpowiedzi na światło, ale nie jest jeszcze jasne, czy dotyczy to kryptochromów.
Kryptochromy ssaków
Dwie funkcje kryptochromów Drosophila Cry – jako fotoreceptor do nakręcania zegara okołodobowego wraz z pigmentami wizualnymi oraz jako integralny składnik kompleksu białkowego oscylatora okołodobowego – są również cechami kryptochromów ssaków. Kryptochromy ssaków są głównie białkami jądrowymi, ale można je również znaleźć w cytozolu . Podobnie jak kryptochromy Drosophila Cry, kryptochromy ssaków pełnią zarówno funkcje zależne, jak i niezależne od światła w regulacji zegara okołodobowego. Kilka obserwacji wskazuje na zależn± od ¶wiatła rolę białek Cry ssaków. Knockout myszy pozbawione jednego lub obu genów Cry mają zmniejszoną lub zniesioną zdolność do indukowania ekspresji genów takich jak per i protoonkogenu c-fos w odpowiedzi na światło. Ponadto źrenice myszy zmutowanych, którym brakuje zarówno Cry1, jak i Cry2, mają zmniejszone reakcje odruchowe na światło.
Z drugiej strony, podwójnie zmutowana mysz cry1 cry2 wykazuje pozornie normalną rytmiczność w warunkach cyklu światło-ciemność, ale traci rytmiczność natychmiast i całkowicie w warunkach swobodnego biegu (zawsze ciemnych). Obserwacje te wskazują, że białka Cry pełnią istotną i niezależną od światła funkcję w centralnym oscylatorze okołodobowym ssaków, oraz że kryptochromy nie są jedynymi fotoreceptorami pośredniczącymi w świetlnej kontroli zegara. Fakt, że kryptochromy s± integraln± czę¶ci± centralnego oscylatora myszy, praktycznie uniemożliwia bezpo¶rednie badanie ich roli w regulacji zegara przez ¶wiatło. Niemniej jednak stwierdzono, że, nieco analogicznie do sytuacji u Drosophili, mysi mutant cry zachowuje zdolność do pośredniczenia w przekazywaniu światła, chyba że jednocześnie zaburzona jest funkcja pigmentów wzrokowych. Myszy z potrójną mutacją niosące mutacje obu kryptochromów wraz z mutacją degenerującą siatkówkę są prawie arytmiczne w warunkach cyklu światło-ciemność. Wyniki te pokazują, że białka Cry ssaków są rzeczywiście zaangażowane w regulację zegara okołodobowego przez światło, ale ich rola w regulacji zegara okołodobowego przez światło jest wykonywana redundantnie przez inne fotoreceptory. Obecnie wydaje się jasne, że dodatkowymi fotoreceptorami działającymi razem z kryptochromami w regulacji zegara okołodobowego u ssaków są opsyny pręcikowo-stożkowe i pokrewne białko melanopsina .
Podobnie jak Drosophila Cry, kryptochromy ssaków oddziałują fizycznie z białkami zegarowymi, w tym z regulatorami transkrypcji wiążącymi promotor Per, Clk i Bmal1 (rysunek 3b). W przeciwieństwie do kryptochromów Drosophila, białka Cry ssaków są składnikami pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego zegara okołodobowego (Rysunek 3b). Fizyczna interakcja kryptochromu z innymi składnikami zegara wpływa na ich aktywność, interakcję, degradację lub handel jądrowy, a w konsekwencji zmienia regulację transkrypcyjną genów zegara. Jednak interakcje między kryptochromami a innymi białkami zegarowymi, takimi jak Per, Clk i Bmal1, nie wydają się być zaburzone przez światło, co sugeruje, że takie interakcje mogą nie być mechanizmem fotostymulacji zegara okołodobowego, jak to ma miejsce w Drosophila. Oprócz bezpośredniej regulacji transkrypcji poprzez fizyczną interakcję z regulatorami transkrypcji wiążącymi się z promotorem, kryptochromy mogą również wpływać na zegar okołodobowy poprzez udział w regulacji modyfikacji histonów, ale jak to działa, pozostaje do wyjaśnienia.
Arabidopsiscryptochromes
Arabidopsis CRY1 i CRY2 są białkami głównie jądrowymi, które pośredniczą w regulacji ekspresji genów i przestrajaniu zegara okołodobowego w odpowiedzi na światło. CRY1 i CRY2 odgrywają główne role w fotomorfogenezie roślin, takie jak hamowanie wydłużania łodygi przez światło niebieskie, stymulowanie ekspansji liści przez światło niebieskie i regulacja inicjacji kwiatów przez długość dnia. Wydaje się, że kryptochromy kontrolują zmiany rozwojowe u roślin poprzez zmiany ekspresji genów w odpowiedzi na światło. CRY1 i CRY2 razem są odpowiedzialne za zależne od światła niebieskiego zmiany w ekspresji genów do 10-20% genomu Arabidopsis .
Istnieją co najmniej dwa mechanizmy, przez które kryptochromy mogą wpływać na zmiany ekspresji genów jądrowych w odpowiedzi na światło. Po pierwsze, cząsteczka kryptochromu może oddziaływać z białkami związanymi z maszynerią transkrypcyjną, aby bezpośrednio wpływać na transkrypcję. Arabidopsis CRY2 wi±że się do chromatyny w sposób niezależny od sekwencji DNA (oraz M. Maymon i C.L., obserwacje niepublikowane), ale nie jest jasne, w jaki sposób niezależne od sekwencji białko oddziałuj±ce z chromatyn± może regulować ekspresję genów. W przeciwieństwie do kryptochromów zwierzęcych, w przypadku których wykazano, że reguluj± transkrypcję poprzez fizyczne interakcje z regulatorami transkrypcji wi±ż±cymi się z promotorem, w przypadku kryptochromów ro¶linnych nie odnotowano takich interakcji. Alternatywny model zakłada, że kryptochromy roślinne mogą oddziaływać z białkami pełniącymi inne funkcje komórkowe w celu regulacji stabilności, modyfikacji i handlu komórkowego regulatorów transkrypcji. Na przykład, stwierdzono, że kryptochromy roślinne oddziałują z ligazą ubikwitynową E3, COP1, co sugeruje, że kryptochromy roślinne mogą działać w sposób dotychczas nie odkryty dla kryptochromów zwierzęcych. Zgodnie z tym poglądem, ostatnio stwierdzono również, że kryptochromy Arabidopsis pośredniczą w tłumieniu przez niebieskie światło zależnej od proteasomu degradacji ważnego regulatora kwitnienia, CONSTANS. Dokładny sposób, w jaki kryptochromy to robią, wymaga dalszych badań.
Mechanizm
Mechanizm katalityczny kryptochromów nie został w pełni wyjaśniony, ale pewne wskazówki można znaleźć w mechanizmie fotolizy CPD, gdzie FAD odgrywa główną rolę katalityczną. W reakcji naprawy DNA fotoliza CPD wiąże się z dimerem pirymidynowym DNA i „przerzuca” go z wnętrza dupleksu DNA do wnęki enzymu z dostępem FAD, tworząc stabilny kompleks. Drugi chromofor (pteryn lub deazaflawina), który nazywany jest również chromoforem „antenowym”, absorbuje fotony światła niebieskiego lub UV-A i przekazuje energię wzbudzenia flawinie FAD. Flawina w stanie wzbudzonym oddaje elektron do dimeru pirymidynowego w celu rozszczepienia pierścienia cyklobutanowego. W tym procesie elektron jest przenoszony z powrotem do flawiny, co prowadzi do regeneracji flawiny w stanie podstawowym. Naprawiony dinukleotyd nie mieści się już w zagłębieniu dostępowym FAD, więc odłącza się od fotolizy. Dokładna rola FAD i wnęki dostępowej FAD w funkcji kryptochromów pozostaje niejasna, ale można sobie wyobrazić, że może być również zaangażowana w reakcje przenoszenia elektronów.
Ale chociaż region PHR, który zawiera chromofor(y) jest najbardziej konserwowaną częścią białek, domena karboksy-końcowa okazała się mieć rolę w funkcji lub regulacji zarówno zwierzęcych, jak i roślinnych kryptochromów. Ekspresja karboksy-końcowych domen kryptochromów Arabidopsis sprzężonych z enzymem markerowym b-glukuronidazą powoduje konstytutywną odpowiedź wzrostu na światło, nawet w ciemności, przy braku regionu PHR. W przeciwieństwie do tego, regiony PHR kryptochromów Drosophila i Xenopus są fizjologicznie aktywne przy braku domeny karboksy-końcowej. Karboksy-końcowa domena Drosophila Cry jest ważna dla stabilności białka, interakcji z Timem i wrażliwości fotoreceptora na cyrkadialne sygnały świetlne, podczas gdy karboksy-końcowa domena Xenopus Cry jest wymagana do jego lokalizacji jądrowej .
Kryptochromy są regulowane przez fosforylację. Wykazano, że kryptochromy Arabidopsis są fosforylowane w odpowiedzi na światło niebieskie i że jest to związane z funkcją i regulacją fotoreceptorów. Ponadto, gdy CRY1 Arabidopsis był wyrażany w komórkach owadów, stwierdzono, że ulega on zależnej od ATP i zależnej od światła niebieskiego autofosforylacji. Nie wiadomo, czy zwierzęce kryptochromy również wiążą się z ATP, chociaż wykazano, że mysie kryptochromy są fosforylowane.
Interakcja między regionem PHR Arabidopsis CRY1 a ATP ma kilka interesujących cech przypominających interakcję między dimerem pirymidynowym a fotoliazą: grupy fosforanowe ATP są wystawione na działanie rozpuszczalnika; cząsteczki adeniny i rybozy są głęboko zakopane w zagłębieniu dostępowym FAD; a ATP może mieć kontakt z FAD za pośrednictwem wody. Oddziaływanie regionu Arabidopsis CRY1 pHR z ATP również pozbawione jest kilku cech powszechnie występujących w interakcjach białko-ATP, takich jak interakcja białko-fosforan, kontakt białko-Mg2+ oraz pobliska reszta serynowa do fosfotransferu. Badanie topologii struktury regionu CRY1 PHR pokazuje jednak, że wszystkie te cechy mogą być potencjalnie zapewnione przez karboksy-końcową domenę kryptochromu (Rysunek 4). Obserwacja, że bogate w serynę domeny karboksy-końcowe kryptochromów Arabidopsis sprzężone z β-glukuronidazą są konstytutywnie fosforylowane in vivo (, sugeruje, że może zachodzić fosfotransfer z ATP związanego z wnęką dostępową FAD do pobliskiej domeny karboksy-końcowej (Rysunek 4a). Można sobie również wyobrazić, że wzbudzony fotonem FAD może wywołać przeniesienie elektronu na nukleotyd i fosfotransfer z ATP do reszt serynowych na karboksy-końcowej domenie. Ponieważ powierzchnia regionu PHR jest przeważnie ujemnie naładowana, zwłaszcza w miejscu, gdzie prawdopodobnie oddziałuje z nią domena karboksy-końcowa, fosforylowana domena karboksy-końcowa byłaby odpychana od powierzchni regionu PHR, co prowadziłoby do zmiany konformacji kryptochromu. Ta zmiana konformacyjna umożliwiłaby mu oddziaływanie z innymi białkami sygnalizacyjnymi i rozprzestrzenianie sygnału świetlnego (Rysunek 4a). Alternatywnie, inna cząsteczka kryptochromu wiążąca się z wnęką dostępową FAD może również zapewnić brakujące cechy potrzebne do produktywnej interakcji ATP-kryptochrom. Rzeczywiście, zarówno interakcje CRY2-CRY2, jak i CRY1-CRY2 mogą być wykryte w Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu i C.L., niepublikowane obserwacje). Powstanie homo-oligomeru lub hetero-oligomeru kryptochromów dostarczyłoby mechanizmu dla międzycz±steczkowej fosfotransfery, która może zmienić strukturę kryptochromów (Rysunek 4b, c).
Prawdopodobne modele zależnych od fosforylacji zmian strukturalnych kryptochromów roślinnych w odpowiedzi na światło niebieskie. Region PHR jest przeważnie ujemnie naładowany (-), a domena karboksy-końcowa (C) może być ujemnie naładowana przez fosforylację (która wymaga ATP i uwalnia nieorganiczny fosforan, Pi). We wszystkich modelach fosforylacja prowadzi do zwi±zania nieznanych partnerów sygnalizacyjnych (X, Y, Z) i do regulacji rozwoju ro¶liny. (a) Jeden z modeli zakłada, że fosforylacja domeny karboksy-końcowej w odpowiedzi na światło jest wykonywana przez ATP związany z regionem PHR; prowadzi to do dysocjacji obu domen. (b) Druga możliwość jest taka, że fosfotransfer w odpowiedzi na światło wiąże się z interakcją dwóch kryptochromów kodowanych przez ten sam gen. (c) Alternatywnie, międzycząsteczkowe fosfotransfery mogą wiązać się z oddziaływaniem różnych kryptochromów. Wszystkie trzy scenariusze mogą występować w komórkach roślinnych, a aktywność kryptochromu może być określona przez kinetykę różnych reakcji.
.