Test klonogenny był wykorzystywany w licznych badaniach do ilościowej oceny wzrostu klonogennego i jego hamowania przez bodźce cytotoksyczne, w tym promieniowanie, leki chemioterapeutyczne i/lub środki ukierunkowane molekularnie, in vitro. Obecna standardowa procedura określania frakcji przeżycia opiera się na założeniu, że wzrost klonogenny w traktowanych kulturach komórkowych może być znormalizowany do nietraktowanych kontroli poprzez dzielenie przez specyficzną dla linii komórkowej, stałą PE.
Tutaj pokazujemy jednak, że nie jest to powszechnie stosowane. W przeciwieństwie do tego, nasze dane wyraźnie wskazują, że korelacja pomiędzy liczbą komórek wysianych w szalce hodowlanej a liczbą uzyskanych kolonii nie zawsze jest liniowa. W przypadku linii komórkowych o kooperatywnym zachowaniu, analiza danych dotyczących przeżywalności klonogennej oparta na PE dała wyniki obarczone dużym lub ogromnym błędem specyficznym dla testu. Nawet jeśli do analizy użyto tylko naczyń hodowlanych z rozsądną liczbą kolonii (C = 5 do 100), frakcje przeżycia klonogenicznego przy danej dawce różniły się o wiele więcej niż jeden rząd wielkości dla linii komórkowych o wysokim stopniu współpracy komórkowej. Zauważmy, że praktycznie każda krzywa przeżycia (stroma lub płaska, umiarkowanie lub silnie zakrzywiona, liniowa, kwadratowa lub nieregularna) może być wyprowadzona z tego zakresu wyników obliczonych z danego zestawu danych – obserwacja, która może być szczególnie ważna dla biologów promieniowania.
Podsumowując, nasze dane pokazują, że konwencjonalna analiza danych przeżycia klonogennego oparta na PE działa niewłaściwie, gdy tylko współpraca komórkowa występuje w jednym lub więcej warunkach w ramach eksperymentu, a wyekstrahowane wyniki przeżycia będą się różnić w niezadowalająco dużym zakresie. W szczególności, wyniki będą silnie zniekształcone, jeśli tylko jedna lub kilka podobnych gęstości komórek zostanie wyplantowanych. Ta praktyka generuje błędy wewnętrzne testu, które są bezpośrednią konsekwencją wybranych gęstości komórek i dlatego nie nadają się do analizy błędów statystycznych. W przypadku linii komórkowych rosnących wspólnie, nasze obserwacje mogą częściowo wyjaśniać zgłoszone niezgodności między testami, między badaczami i między laboratoriami danych dotyczących odpowiedzi na leczenie. Meta-analiza danych testu tworzenia kolonii A549 dodatkowo wspiera tę hipotezę: W ramach panelu 156 różnych badań, Nuryadi i wsp. podali wartości SF4 dla tej konkretnej linii komórkowej w zakresie od 5 do 90% z zakresem międzykwartylowym SF4 wynoszącym ponad 25%. Chociaż różne inne parametry mogą z pewnością wpływać na dane dotyczące odpowiedzi na leczenie, z naszych danych wnioskujemy, że współpraca komórkowa jest głównym czynnikiem wyjaśniającym zmienność między badaniami. Ponieważ nawet niewielkie różnice w frakcjach przeżycia klonogenicznego mogą zachęcać badaczy do postulowania i badania nowych hipotez naukowych, które ostatecznie mogą być oparte na fałszywej precyzji, opracowaliśmy nowe podejście analityczne, które jest mniej podatne na wpływ gęstości komórek – szczególnie, ale nie tylko dla kooperatywnie rosnących linii komórkowych. Metoda ta uwzględnia nieliniowe zależności pomiędzy liczbą wysianych komórek a liczbą kolonii uzyskanych przez ocenę naczyń hodowlanych z szerokim zakresem liczby komórek wysianych dla wszystkich warunków traktowania.
Matematycznie, nasze podejście wykorzystuje regresję potęgową i interpolację dopasowanych liczb kolonii przy różnych dawkach napromieniowania. Zastosowana do tego samego zbioru danych, który został użyty do obliczeń opartych na PE, dostarczyła wyraźnie bardziej stabilnych, niezależnych od gęstości komórek wyników. Uważni czytelnicy mogli zauważyć, że obliczenia frakcji przeżycia wykonane zgodnie z przedstawioną tu metodą opierają się wyłącznie na współczynniku a i wykładniku b wyodrębnionych przez regresję potęgową. Chociaż w oczywisty sposób kompensuje to efekty współpracy komórek, niesie ze sobą inną jakość błędu, która wynika z niedokładności regresji i która nie może być ilościowo porównana z podobną jakością błędu w obliczeniach frakcji przeżycia opartych na PE. Odpowiednio, ten błąd powinien być zminimalizowany przez zapewnienie starannego projektu eksperymentalnego z wystarczającą liczbą niezależnych replik. Co więcej, obliczenia frakcji przeżycia powinny być wykonywane tylko z wynikami regresji mocy o właściwej wydajności, jak wskazuje współczynnik regresji R.
Nasze podejście matematyczne zasadniczo zastępuje obliczenia przeżycia klonogenicznego oparte na PE pytaniem:
Ile razy więcej komórek musi być wysianych do traktowanej szalki hodowlanej, aby dać identyczną liczbę kolonii jak w szalce kontrolnej?
Wykładnik b ma szczególne znaczenie w tym względzie. Wskazuje on, czy korelacja między liczbą posianych komórek a liczbą policzonych kolonii jest liniowa (b ≈ 1), czy też nie. Wysokie wartości b, takie jak uzyskane dla komórek BT20 i SKLU1, wskazują, że wzrost komórek in vitro ulega spowolnieniu (lub całkowitemu zahamowaniu) w przypadku zwiększenia objętości podłoża hodowlanego przypadającej na jedną komórkę – czy to poprzez zastosowanie dużych objętości hodowlanych, czy też zmniejszenie liczby posianych komórek. Należy podkreślić, że wartości b nie są w żaden sposób specyficzne dla określonej linii komórkowej, ale są raczej konsekwencją wybranego podłoża do hodowli komórkowej, kilku parametrów inkubacji oraz procedury doświadczalnej obejmującej praktycznie każdy aspekt, który może wpływać na klonalne wyrastanie komórek, które znajdują się w sytuacji ekstremalnego stresu, gdy są umieszczane jako pojedyncze komórki, takie jak skład podłoża, uzupełnianie składnikami odżywczymi i czynnikami wzrostu, metody stosowane do rozdzielania komórek, plastikowe naczynia itd. Na przykład, wykorzystanie kondycjonowanej pożywki z komórek BT20 w stanie bliskim stagnacji silnie osłabiało kooperatywne zachowanie pojedynczych komórek BT20, podczas gdy procedura ta nie miała żadnego wpływu na klonogenny wzrost niekooperatywnie rosnących komórek MDA-MB231. Ponadto, czas podwojenia kooperatywnych komórek BT20 był zależny zarówno od czasu inkubacji jak i gęstości komórek w studzience, co daje oczywiste biologiczne wyjaśnienie dla nieprecyzyjnych frakcji przeżycia klonogennego uzyskanych w obliczeniach opartych na PE: Tempo wzrostu proliferującego skupiska komórek może być po prostu zbyt wolne, aby osiągnąć próg 50 komórek na kolonię w czasie inkubacji testu. Stąd, pozorna „nieklonalność” skupiska np. 35 wolno proliferujących komórek w punkcie zatrzymania czasu jest jedynie nieuniknioną konsekwencją czasu inkubacji testu, który jest – przynajmniej do pewnego stopnia – wybierany arbitralnie. W tym kontekście, dodatkowo przeanalizowaliśmy wpływ czasu inkubacji na uzyskane frakcje przeżycia klonogenicznego i zaobserwowaliśmy, że nie jest wystarczające określenie punktu czasowego zatrzymania wyłącznie poprzez inspekcję naczyń kontrolnych, jak sugerowali inni: Przedwczesne zakończenie okresu inkubacji może prowadzić do bardzo niskich frakcji przeżycia na płytkach z bardziej agresywnym traktowaniem, gdzie naprawa uszkodzeń przed kontynuacją wzrostu komórek wymaga dodatkowego czasu.
Co ważne, nasze dane są w pełni zgodne z ustaleniami pionierskich badaczy hodowli komórkowych w latach czterdziestych i pięćdziesiątych i po prostu odzwierciedlają zjawisko, które było przedmiotem szeroko zakrojonych badań w tym czasie. Puck i współpracownicy byli pierwszymi, którzy opublikowali krzywą przeżycia napromieniowanych pojedynczych komórek w 1956 roku. Jednak największym naukowym wyzwaniem dla tego fundamentalnego osiągnięcia był nierozwiązany w tamtym czasie problem hodowli komórek ssaków: Linie komórkowe przestawały rosnąć in vitro, gdy tylko komórki były umieszczane w małych zagęszczeniach. Próbę przezwyciężenia tego problemu podjęli w 1948 roku Sanford i wsp., którym udało się wyhodować jednokomórkowe kolonie fibroblastów w małych kapilarach, gdzie dyfuzja czynników pochodzących z komórek do medium była silnie ograniczona, co pozwalało na wystarczającą autokrynną stymulację wzrostu. Określili oni znaczenie wstępnego kondycjonowania podłoża hodowlanego przez hodowane komórki i doszli do wniosku, że podłoże hodowlane wystarczające do nieskończonego wzrostu hodowli komórkowej o dużej gęstości jest w rzeczywistości „dalekie od optymalnego dla wzrostu pojedynczej komórki”. Zgodnie z tym Earle i wsp. opisali, że hodowla danego typu komórek przy bardzo niskiej gęstości powoduje śmierć komórek, a praca ta stała się podstawą pierwszej publikacji na temat klonogennego wzrostu komórek ssaków in vitro autorstwa Pucka i Marcusa w 1955 roku. Zainspirowani potrzebą kondycjonowanego podłoża hodowlanego w celu ułatwienia wzrostu pojedynczych komórek, użyli oni systemu współkultury pojedynczych komórek HeLa i warstwy silnie napromieniowanych komórek zasilających tego samego typu. Zgodnie z poprzednimi badaniami, doszli oni do wniosku, że zahamowanie wzrostu pojedynczych komórek w dużych objętościach testów było spowodowane „utratą krótkotrwałego, dyfuzyjnego czynnika”. W późniejszych publikacjach, takich jak ta z pierwszą krzywą przeżycia napromieniowanych komórek ssaków, Puck i współpracownicy często pomijali użycie warstw zasilających, ponieważ opracowali zaawansowane techniki hodowlane pozwalające na wzrost jednokomórkowy przy 100% PE bez uzupełniania czynnika wzrostu przez komórki zasilające. Stwierdzili, że staranne mycie i protokoły trypsynacji były niezbędne w tym względzie i ukuli termin „działanie kooperatywne”, aby opisać, że komórki w naczyniu hodowlanym mogą różnić się pod względem genotypu, jak również stanu fizjologicznego. Nasze wyniki potwierdzają te obserwacje: W obrębie panelu 50 nowotworowych linii komórkowych zaobserwowaliśmy, że suboptymalny wzrost pojedynczych komórek w nowoczesnych, standaryzowanych podłożach hodowlanych uzupełnionych FCS jest nadal bardzo powszechnym zjawiskiem, co można wywnioskować ze stwierdzenia, że ponad połowa linii komórkowych wykazywała kooperatywne zachowanie wzrostowe. W związku z tym, jeśli dla danej linii komórkowej znaleziono suboptymalne PE, badanie klonogeniczne może jednocześnie wykryć zarówno wpływ interesującego traktowania, jak i wpływ współpracy komórek. Nie było w zakresie tego badania zidentyfikowanie specyficznych czynników wspomagających wzrost, które mogą wpływać na PE analizowanych linii komórkowych. Jednakże stawiamy hipotezę, że suboptymalne warunki wzrostu pojedynczych komórek danej linii komórkowej mogą wynikać z bardzo różnych parametrów, takich jak niskie stężenia klasycznych czynników wzrostu i/lub hormonów (np. naskórkowego czynnika wzrostu lub estrogenów), ale także różnych metabolitów o niskiej i wysokiej masie cząsteczkowej, dla których przynajmniej część pojedynczych komórek wykazuje auksotrofię. Co więcej, na suplementację odżywczą pojedynczych komórek w naczyniu hodowlanym będą prawdopodobnie miały wpływ parametry fizykochemiczne otaczającej je pożywki i plastikowych naczyń, w tym stopień wiązania białek odpowiednich czynników auksotroficznych lub ich adsorpcja na powierzchni plastiku. Teoretycznie problem ten można rozwiązać poprzez podjęcie działań przywracających maksymalne wartości PE w warunkach niskiej gęstości, tak aby (ponownie) ustalić liniową korelację pomiędzy S i C (b = 1). Zalecenia Pucka dotyczące stosowania komórek zasilających, pożywek kondycjonowanych i/lub osadzania pojedynczych komórek w miękkim agarze mogą być wystarczające do osiągnięcia tego celu dla wybranych linii komórkowych i powinny odpowiednio zwiększyć solidność obliczeń opartych na PE. Jednakże oczywistym jest, że dopracowanie i standaryzacja warunków oznaczania tak, aby przeżywalność pojedynczych komórek i wskaźniki wzrostu były optymalne dla każdego pojedynczego typu komórek, może być więcej niż wyzwaniem. Zdecydowaliśmy się zaakceptować suboptymalne warunki testowe dla wzrostu pojedynczych komórek i zamiast tego opracowaliśmy metodę obliczeniową dla analizy danych przeżycia klonogenów, która uwzględnia to dobrze opisane zjawisko. Oczywiście, nasze podejście wykorzystujące regresję potęgową i interpolację było poza możliwościami technicznymi lat 50-tych, kiedy dane przeżycia były dopasowywane na oko. Jednak w jakiś sposób znaczenie współpracy komórkowej zniknęło z pola widzenia w ciągu następnych dziesięcioleci. Chociaż kilka raportów na temat nieliniowości w testach tworzenia kolonii zostało zgłoszonych w czasie, nie zajęto się ograniczoną wydajnością analiz opartych na PE .
Co ciekawe, badania te zgłosiły mniej niż liniowy wzrost liczby kolonii ze zwiększającą się liczbą posianych komórek dla niektórych typów komórek w określonych warunkach. Zgodnie z tym, dla kilku linii komórkowych w naszym panelu również uzyskaliśmy wartości b nieco poniżej 1,0. Trzy różne scenariusze mogą tłumaczyć tę obserwację, z których dwa wynikają z artefaktów metodologicznych: Po pierwsze, wartości b nieco poniżej 1,0 mogą wynikać z liczenia studzienek z dużą liczbą przerośniętych kolonii, gdzie małe kolonie są przeoczone przez badacza (patrz studzienki oznaczone „nd” na Rys. 1a). Po drugie, wzrost komórek w studzienkach z dużą liczbą komórek może być zahamowany w dość wczesnych stadiach z powodu szybkiego spadku stężenia substancji odżywczych, co prowadzi do powstawania kolonii poronnych. Trzecią – biologicznie mniej intuicyjną – opcją jest konkurencyjne zachowanie wzrostu komórek, na przykład z powodu wydzielania czynników hamujących wzrost. Co ważne, każde z tych zjawisk jest uwzględniane przez podejście regresji i interpolacji, ponieważ uwzględnia ono wszelkie odchylenia od liniowości odzwierciedlone przez wartość b.
Co więcej, godne uwagi jest to, że wartości b różnych linii komórkowych dla warunków nietraktowanych w porównaniu z napromieniowanymi nie są identyczne. W większości tych przypadków, b-wartości napromieniowanych komórek wykazują tendencję do bycia wyższymi niż odpowiednie b-wartości nienapromieniowanych kontroli, wskazując, że współpraca komórkowa wzrasta po napromieniowaniu. W konsekwencji, zakres wartości frakcji przeżycia uzyskanych dla C = 5 do 100 kolonii staje się szerszy niż w przypadku prawie identycznych wartości b (patrz linie komórkowe HCC1806 i A549). Sugeruje to, że nie jest technicznie możliwe wyodrębnienie bardziej precyzyjnych wartości przeżycia za pomocą procedury testu klonogenicznego – chyba, że do analizy wybrano by jedną, stałą liczbę kolonii (C). Ponadto, linie komórkowe o bardzo wysokich wartościach b dla komórek poddanych działaniu promieniowania mogą być szczególnie interesujące w odniesieniu do badań nad opornością na terapię. Na przykład, indukowany promieniowaniem czynnik(i) przeżycia wydzielany przez określony typ komórek może zostać zidentyfikowany dzięki odpowiednio wysokiej wartości b.
Podsumowując, nasze dane wskazują na potrzebę starannej analizy danych z eksperymentów tworzenia kolonii i uwzględnienia niedocenianego wpływu współpracy komórek na obliczenia frakcji przeżycia. Może to znacznie zwiększyć wiarygodność testu klonogenicznego – i odporność każdej hipotezy opartej na nim.
.