I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Reakcja enzymatyczna (image will open in a new window)
Rybonukleaza trzustkowa (RNaza) jest endoribonukleazą. Katalizuje rozszczepienie wiązania fosfodiestrowego między 5′-rybozą nukleotydu a grupą fosforanową przyłączoną do 3′-rybozy sąsiedniego nukleotydu pirymidynowego. To rozszczepienie tworzy 2′,3′-cykliczny fosforan, który jest następnie hydrolizowany do odpowiedniego fosforanu 3′-nukleozydu.
RNaza występuje w największej ilości w trzustce przeżuwaczy (Barnard 1969). Głównym składnikiem krystalicznego enzymu jest RNaza A; mniejszym składnikiem jest RNaza B. RNaza B jest glikozylowaną formą RNazy A (Beintema i wsp. 1976).
Historia:
Praca Jonesa w 1920 roku jest zwykle cytowana jako „początek” rybonukleazy trzustkowej (Richards i Wycoff 1971). RNaza została wyizolowana przez Dubosa i Thompsona w 1938 roku i skrystalizowana przez Kunitza w 1940 roku.
W 1947 roku Worthington był pierwszą firmą, która wyprodukowała wysoko oczyszczoną krystaliczną RNazę. Na początku lat 50-tych, firma Armour przygotowała surowy enzym krystaliczny i zaoferowała go w bardzo przystępnej cenie. W latach 60. i 70. RNaza A była faworytem do badań, przede wszystkim dlatego, że jest niezwykle termostabilna i obecna w dużym stężeniu w dostępnym źródle – trzustce bydlęcej. Badania te doprowadziły do odkrycia struktury krystalicznej (Anfinsen 1959, Groves 1966 i Scheraga 1967), określenia sekwencji aminokwasowej (Smyth et al. 1963), identyfikacji mechanizmu katalitycznego (Beers 1960) i wyjaśnienia dróg składania (Hantgan et al. 1974). RNaza A była pierwszym enzymem i trzecim białkiem, dla którego określono prawidłową sekwencję aminokwasową (Raines 1998).
Cztery nagrody Nobla zostały przyznane za prace związane z badaniami nad RNazą (Anfinsen, Moore, Stein, i Merrifield). Obszerna literatura i liczne badania sprawiły, że RNaza stała się najszerzej badanym enzymem XX wieku (Raines 1998).
Ostatnie prace kontynuują badania nad syntezą i dojrzewaniem RNazy w retikulum endoplazmatycznym żywych komórek (Geiger i wsp. 2010). Wiele pracy poświęca się również badaniom nad składaniem i agregacją RNazy (Benito i wsp. 2008, Iwaoka i wsp. 2008 oraz Arai i wsp. 2010). Badana jest rola enzymu w rozwoju nowotworów i regulacji genów (Shlyakhovenko 2009), a także jest on opracowywany jako środek chemioterapeutyczny dla nowotworów (Chao et al. 2010).
Swoistość:
RNaza A jest specyficzna dla połączeń nukleozydów pirymidynowych (Volkin i Cohn 1953). Uważa się, że reakcja przebiega w dwóch etapach. W pierwszym etapie następuje rozszczepienie wiązania 3′,5′-fosfodiestrowego, z wytworzeniem pośredniego 2′,3′-cyklicznego fosfodiestru. W drugim etapie cykliczny fosfodiester jest hydrolizowany do grupy 3′-monofosforanowej. Pierwszy etap jest niespecyficzny w odniesieniu do zasady azotowej substratu; jednakże drugi etap jest całkowicie specyficzny dla nukleotydów pirymidynowych z terminalnymi 2′,3′-cyklicznymi fosforanami. RNaza B ma taką samą specyficzność jak RNaza A zarówno w stosunku do cyklicznego cytozylanu, jak i drożdżowego RNA (Plummer i Hirs 1963). RNaza A wykazuje preferencję dla większych substratów (Nogués et al. 1995).
Ezym rozszczepia się na resztach cytydynowych dwukrotnie szybciej niż na resztach urydylowych (Richards i Wyckoff 1971). Stwierdzono, że Thr45 jest najważniejszy w pośredniczeniu w specyficzności pirymidynowej, zarówno poprzez tworzenie wiązań wodorowych z zasadami pirymidynowymi, jak i steryczne wykluczanie zasad purynowych (del Cardayré i Raines 1994). Łańcuch boczny Asp83 jest ważny dla stabilizacji stanu przejściowego podczas rozszczepiania substratów zawierających urydynę; reszta ta nie ma wpływu na kinetykę rozszczepiania cytydyny (del Cardayré i Raines 1995).
Kompozycja:
Kształt białka przypomina nerkę, z resztami miejsca aktywnego ułożonymi w szczelinie (Richardson 1981, i Raines 1998). Struktura drugorzędowa zawiera długie czteroniciowe antyrównoległe beta-szety i trzy krótkie alfa-heliksy (Raines 1998). RNaza A zawiera cztery wiązania disulfidowe, które są krytyczne dla stabilności natywnego enzymu. Dwa z tych wiązań disulfidowych znajdują się pomiędzy alfa-helisą a beta-szkieletem i w większym stopniu przyczyniają się do stabilności termicznej niż dwa pozostałe (Klink et al. 2000). RNaza B jest glikoproteiną zawierającą w Asn34 pojedynczy oligosacharyd składający się z sześciu reszt mannozy i dwóch reszt N-acetyloglukozaminy (Tarentino i wsp. 1970).
Charakterystyka molekularna:
RNaza A jest małym białkiem, dojrzały enzym ma tylko 124 reszty aminokwasowe, bez dołączonego węglowodanu. RNaza A zawiera 19 z 20 aminokwasów, brakuje jej tylko tryptofanu (Nogués et al. 1995, and Raines 1998). Trójwymiarowa struktura RNazy A jest w pełni zakodowana przez jej sekwencję aminokwasową (White i Anfinsen 1959, oraz Raines 1998). Wszystkie osiem ludzkich genów RNazy A-like zlokalizowanych jest na chromosomie 14. Każdy z nich koduje sekwencję sygnału wydzielniczego i zawiera niezmienną triadę katalityczną złożoną z dwóch histydyn i jednej lizyny z konserwowanym motywem (CKXXNTF) (Marshall i wsp. 2008).
Zidentyfikowano sekwencje aminokwasowe wielu homologów RNazy A, co czyni RNazę A modelowym systemem dla ewolucji molekularnej kręgowców (Dyer i Rosenberg 2006). Na podstawie sekwencji i ich rozmieszczenia w różnych gatunkach ustalono, że RNaza A jest nowoczesnym białkiem, które szybko ewoluuje (Doolittle 1992, i Raines 1998).
Protein Accession Number: P61823
Klasyfikacja CATH (v. 3.2.0):
- Klasa: Alpha-Beta
- Architektura: Roll
- Topologia: P-30 Protein
Molecular Weight:
- RNase A: 13.7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNase B: 14.700 ± 0.3 (Plummer i Hirs 1963)
Optimal pH: RNase A: 7,0-7,5 (Brown i Todd 1955)
Punkt izoelektryczny:
- RNase A: 9,3 (Ui 1971)
Współczynnik ekstynkcji:
- RNaza A i B: 8,640 cm-1M-1 (Teoretyczny)
- RNaza A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNaza B: E 1%, 280 = 5.77 (Theoretical, RNase B)
Rezydy miejsca aktywnego:
- Histydyna (H12, H119)
- Lizyna (K41)
Aktywatory:
- Chlorek sodu (Weickmann i in. 1981)
- Siarczan (Moosavi-Movahedi i wsp. 2006)
Inhibitory:
- Jony metali ciężkich
- Inhibitor rybonukleazy (RI), białko o masie 50 kDa stanowiące ≤ 0.01% białka w cytozolu komórek ssaków (Takahashi 1967)
- Kompleksy wanadanowo-rydynowe (Lindquist i in. 1973)
Zastosowanie:
- Usuwanie RNA podczas izolacji DNA
- Analiza sekwencji RNA
- Atesty ochrony przed RNazą
- Kwantyfikacja lub mapowanie RNA
- Oczyszczanie plazmidowego DNA
- Izolacja genomowego DNA
- Marker masy cząsteczkowej
.