7 RAG Binding Genomewide
Zważywszy na bezpośrednie właściwości wiązania DNA przez RAG1, w połączeniu z wyjątkową obfitością RSS obecnych w genach receptorów antygenowych, uzasadnione było założenie, że specyficzność miejsca rekombinacji V(D)J jest po prostu wymuszona przez preferencyjną rekrutację RAG1 do jej preferowanych substratów DNA. RAG2, ze względu na swój PHD i brak wewnętrznej aktywności katalitycznej, nie powinien wykazywać żadnych funkcjonalnych ograniczeń we wzorcach lokalizacyjnych. W związku z tym, RAG2 wiąże się szeroko w całym genomie limfocytów, zajmując główną frakcję (~ 60%) aktywnych TSS, które są wzbogacone w H3K4me3 (Ji i in., 2010; Teng i in., 2015). Jednakże, RAG1 lokalizuje się również w tysiącach miejsc (~ 3500 w mysich tymocytach i komórkach pre-B), które są współzajmowane przez RAG2 i H3K4me3, obejmując znaczną część wysoce aktywnych, specyficznych dla danej linii komórkowej promotorów i enhancerów (Teng i in., 2015). Ta powszechna lokalizacja jest również obserwowana w przypadku katalitycznego mutanta RAG1 (D708A), co wskazuje, że powszechne wiązanie RAG1 nie odzwierciedla akumulacji postcleavage (Teng i in., 2015). Miejsca wiążące RAG1 poza genami receptorów antygenowych nie wykazywały wyraźnej korelacji z obecnością motywów podobnych do RSS (cryptic RSSs, lub cRSSs), co dodatkowo wskazuje, że specyficzne dla sekwencji kontakty i aktywność rozszczepiająca RAG nie mogą wyjaśniać wzorców wiązania RAG1 w całym genomie. Zamiast tego, markery dostępności chromatyny są najlepszymi predyktorami rekrutacji RAG1: H3K4me3, H3K27Ac, podwyższona zawartość GC i podwyższona zawartość CpG (Teng i in., 2015).
W rzeczywistości tylko garstka przykładów demonstruje specyficzną rekrutację RAG1 do genów receptorów antygenowych poprzez trans-faktory, które oddziałują zarówno z RAG1, jak i specyficznymi motywami DNA. W każdym przypadku, specyficzność lokusowa zdarzenia rekrutacyjnego zależy nie od RSS per se, ale od motywu wiążącego czynnik transkrypcyjny, który przypadkowo pokrywa się z RSS. Myszy locus Tcrb ilustruje przypadek, w którym ukierunkowana rekrutacja RAG1 przyczynia się do powstania ograniczeń „poza 12/23”, które pomagają utrzymać prawidłową kolejność rekombinacji (Dβ-Jβ przed Vβ-DJβ). 3′ 23-RSS flankujące Dβ1 i Dβ2 zawierają konserwowane miejsca wiązania dla c-fos, podjednostki czynnika transkrypcyjnego AP-1 (Wang i in., 2008). W sposób niezależny od swoich właściwości aktywujących transkrypcję, c-fos preferencyjnie rekrutuje RAG1 do 3′ Dβ RSSs, sprzyjając w ten sposób rekombinacji Dβ-Jβ (Wang i in., 2008). W linii B analogicznym locus receptora antygenowego jest gen Igh, gdzie bezpośrednia rekombinacja Vh-Dh jest faworyzowana w stosunku do rekombinacji Vh-DJh. W tym przypadku jednak kolejność rekombinacji wydaje się być regulowana przez lokalne przesunięcia w znakach epigenetycznych, które następują po rekombinacji D-Jh i oznaczają produkt DJ do preferencyjnego wiązania RAG1 i rekombinacji w stosunku do segmentów genu Dh linii zarodkowej (Subrahmanyam i in., 2012). Ponadto, bezpośrednia rekombinacja Vh-Dh jest hamowana przez element sekwencji znany jako IGCR1, który znajduje się pomiędzy klastrami genów D i V (Guo i in., 2011). IGCR1 zawiera dwa istotne miejsca CTCF i uważa się, że funkcjonuje jako punkt kotwiczący dla pętli chromatynowych, które oddzielają część DJ locus Igh od części V (Guo i in., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic i in., 2013). Ludzki locus Tcrd dostarcza kolejnego przykładu specyficznego dla locus osadzania RAG1, gdzie zależna od Runx1 rekrutacja RAG1 do Dδ2 sprzyja zdarzeniu rearanżacji Dδ2-Dδ3, które poprzedza klasyczną rekombinację Dδ-Jδ (Cieślak i in., 2014). Skutkuje to specyficznym dla człowieka włączeniem dwóch segmentów genu D w rearanżacje Tcrd. Wreszcie, sugeruje się, że Pax5 oddziałuje z RAG i ułatwia rekrutację RAG do segmentów genu Vh (Zhang i in., 2006), chociaż nie wykazano jeszcze, że mechanizm ten zwiększa endogenne składanie locus Igh.
Poza tymi wyjątkami, wiązanie RAG1 nie wydaje się inicjować przede wszystkim z sekwencyjnie specyficznych zdarzeń rekrutacyjnych. Nawet w obrębie genów Tcr i Ig, wiązanie RAG1 wykracza poza granice RSS, zajmując intronowe regiony, które są wzbogacone w H3K4me3, ale pozbawione RSS (Teng i in., 2015). Nie oznacza to jednak, że RSS nie odgrywają drugorzędnych ról w stabilizacji lub wzmacnianiu wiązania RAG1 po rekruracji. Geny Tcra i Igk są głównymi rekruterami wiązania RAG1 odpowiednio w podwójnie pozytywnych tymocytach i komórkach pre-B, a zdefiniowane szczyty akumulacji RAG1 są wyraźnie obserwowane nad RSS w centrach rekombinacji (Teng i in., 2015). Wyjątkowa gęstość RSS w genach receptorów antygenowych jest prawdopodobnie jedną z ważniejszych cech, która odróżnia je od pozostałej części genomu.
Genom w ogólności wykazuje jednak niezależną od RSS rekrutację RAG1, która prawdopodobnie zachodzi poprzez niespecyficzne interakcje pomiędzy RAG1 a DNA, które są mediowane przez różne domeny w rdzeniu RAG1, w tym NBD (Teng i in., 2015; Yin i in., 2009). Ponadto pośrednia rekrutacja RAG1 do chromatyny może zachodzić poprzez jej interakcję z RAG2, chociaż ta ostatnia nie może w pełni odpowiadać za wzorce wiązania RAG1, które są częściowo utrzymywane w nieobecności RAG2, aczkolwiek ze zmniejszoną intensywnością (Teng i in., 2015).
Genomowy zakres miejsc wiążących RAG1, choć szerszy niż przewidywano, rozszerza się jeszcze bardziej w przypadku braku domen nie-rdzeniowych RAG1 lub RAG2. W przypadku braku C-końcowego regionu RAG2 (który zawiera PHD), RAG1 dyfunduje w kierunku miejsc o niższej gęstości H3K4me3, zamiast kierować się do najbardziej aktywnych TSS (Teng i in., 2015). Jedną z możliwości jest to, że wynika to z demaskowania dodatkowych niespecyficznych aktywności wiązania DNA przez RAG1, biorąc pod uwagę brak autoinhibicyjnej domeny, która znajduje się w C-końcowym regionie RAG2 (Lu i in., 2015). Inną możliwością jest to, że przy braku domeny PHD RAG2 kompleks RAG ma mniejszą skłonność do osiedlania się w regionach o wysokiej zawartości H3K4me3. Istotny dla szerszego wzorca wiązania RAG1 może być również fakt, że delecja C-końcowego regionu RAG2 prowadzi do podwyższenia poziomu białka RAG1 (Teng i in., 2015). Rdzeń RAG1 wiąże się również znacznie bardziej promiskuitycznie niż pełnowartościowy RAG1 i, co intrygujące, wykazuje zwiększoną intensywność wiązania w wielu miejscach poza receptorami antygenowymi, ale zmniejszoną w locus Tcra, w stosunku do pełnowartościowego RAG1 (Teng i in., 2015). Może to odzwierciedlać zmiany w wewnętrznych właściwościach wiązania DNA przez okrojone białko RAG1 lub brak aktywności kodowanych w innych niż rdzeń zakończeniach RAG1 (takich jak ubikwitylacja histonów pośredniczona przez RING lub autoinhibicja pośredniczona przez C-terminus). Istotny może być również fakt, zauważony powyżej, że rdzeń RAG1 ulega ekspresji na znacznie wyższym poziomie niż pełnometrażowy RAG1.
Rekombinaza RAG toleruje zmienność sekwencji nie tylko w swoich substratach, szczególnie w dystansie RSS, ale także w heptamerze i nonamerze (Hesse i in., 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyżyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Nawet interakcja RAG1-nonamer, w której pośredniczy NBD, opiera się na stosunkowo niewielu specyficznych dla sekwencji kontaktach (Yin i in., 2009). RSS, które zasiedlają geny receptorów antygenowych są zróżnicowane pod względem zawartości sekwencji (czasami znacznie odbiegają od konsensusowych motywów heptamerowych i nonamerowych), a rozpoznawanie substratów przez RAG musi być wystarczająco elastyczne, aby umożliwić maksymalną różnorodność repertuaru. Poza genami receptorów antygenowych, miejsca wiążące RAG1 nie wykazują kumulatywnej preferencji dla żadnej konkretnej sygnatury sekwencji (Teng i in., 2015).
Elastyczne rozpoznawanie substratów przez RAG stwarza jednak problem dla pozostałej części genomu. Dość minimalne wymagania sekwencyjne dla funkcjonalnego RSS (przynajmniej według zasad, które obecnie rozumiemy) pozwalają na dość częste występowanie cRSS w genomach kręgowców (Lewis i in., 1997). Niebezpieczeństwo przypadkowych cRSS uwidacznia się poprzez ich udział w zależnych od RAG rearanżacjach genetycznych, które przyczyniają się do limfomagenezy (Larmonie i in., 2013). Ponieważ większość wiązania RAG1 w całym genomie jest regulowana przez niespecyficzną rekrutację do DNA lub dostępnej chromatyny, biologicznie rozsądne wydaje się ograniczenie dostępności silnych cRSS w pobliżu miejsc wiązania RAG1 i zminimalizowanie w ten sposób potencjału aktywności RAG poza celem. Rzeczywiście, miejsca wiążące RAG1 w limfocytach myszy i człowieka są preferencyjnie pozbawione cRSS (Teng i in., 2015), a my proponujemy, że stało się tak z powodu selektywnej presji narzuconej przez rearanżacje genetyczne zachodzące poza genami receptorów antygenowych. W ten sposób repertuar TSS związanych z RAG1 jest chroniony przed aktywnością RAG podczas rekombinacji V(D)J. Spekulujemy, że rzadkie cRSSs, które zachowują aktywność i nadal pośredniczą w rzadkich ektopowych rearanżacjach, zostały utrzymane w genomie z powodu nakładania się na sekwencje regulatorowe lub funkcjonalne w loci gospodarza, lub po prostu nie wywarły wystarczająco silnych negatywnych konsekwencji, by zostać wyselekcjonowane.