Micronucleus
MN pochodzą z fragmentów chromosomów lub całych chromosomów, które pozostają w tyle za anafazą podczas podziału jądra i nie są włączone do jąder głównych.13,18,19 MN są małymi ciałkami pozajądrowymi, które powstają w dzielących się komórkach z acentrycznych fragmentów chromosomów/chromatyd lub całych chromosomów/chromatyd, które pozostają w tyle w anafazie i nie są włączone do jąder potomnych w telofazie.20 W telofazie wokół opóźnionych chromosomów i fragmentów tworzy się otoczka jądrowa, która następnie rozwija się i stopniowo przyjmuje morfologię jądra interfazowego, z tą różnicą, że są one mniejsze niż jądra główne w komórce (stąd termin „mikrojądro”).19 MN zawierające fragmenty chromosomalne mogą powstać w wyniku bezpośredniego przerwania podwójnej nici DNA, przekształcenia przerwania pojedynczej nici w przerwanie podwójnej nici po replikacji komórki lub zahamowania syntezy DNA.20
MN może powstawać różnymi drogami: mianowicie z acentrycznych fragmentów chromosomów lub chromatyd. Niewielka część acentrycznych fragmentów chromosomów może po prostu powstać z nienaprawionych dwuniciowych pęknięć DNA. Inne mechanizmy, które mogą prowadzić do powstania MN z fragmentów acentrycznych, obejmują jednoczesną naprawę przez wycięcie uszkodzonych (np. 8-okso-deoksyguanozyny) lub niewłaściwych zasad wbudowanych w DNA (np. uracylu), które znajdują się w pobliżu i na przeciwległych komplementarnych niciach DNA21. Innym mechanizmem, który może prowadzić do MN w wyniku utraty chromosomów jest hipometylacja cytozyny w centromerowych i perycentromerowych sekwencjach powtarzających się, takich jak klasyczne powtórzenia satelitarne w regionach perycentromerowych i powtórzenia wyższego rzędu satelitarnego DNA w centromerowym DNA.21 Ze względu na centralną rolę białek kinetochorowych w łączeniu chromosomów z wrzecionem, prawdopodobne jest, że mutacje prowadzące do defektów w dynamice interakcji kinetochorowych i mikrotubul mogą być przyczyną powstawania MN w wyniku utraty chromosomów w anafazie. Inne zmienne, które mogą zwiększać MN z powodu utraty chromosomów to defekty w montażu wrzeciona mitotycznego, defekty punktów kontrolnych mitozy i nieprawidłowa amplifikacja centrosomów.21
Los MN po ich utworzeniu w komórce mikrojądrowej jest słabo poznany. Ich losy postmitotyczne obejmują: (1) eliminację z komórki mikrojądrowej w wyniku apoptozy; (2) wydalenie z komórki (gdy nie oczekuje się, że DNA wewnątrz MN będzie funkcjonalne lub zdolne do replikacji ze względu na brak niezbędnych składników cytoplazmatycznych); (3) ponowne włączenie do głównego jądra (gdy ponownie włączony chromosom może być nieodróżnialny od tych z głównego jądra i może wznowić normalną aktywność biologiczną); oraz (4) zatrzymanie w cytoplazmie komórki jako jednostka pozajądrowa (gdy MN może zakończyć jedną lub więcej rund replikacji DNA/chromosomu).20,22
Kluczowa zaleta badania CBMN polega na jego zdolności do wykrywania zarówno zdarzeń klastogennych, jak i aneugenicznych, prowadzących odpowiednio do strukturalnych i liczbowych aberracji chromosomowych.20 Klastogeny indukują MN poprzez przerwanie podwójnej helisy DNA, tworząc acentryczne fragmenty, które nie są zdolne do przylegania do włókien wrzeciona i integrowania się w jądrach potomnych, a zatem są opuszczane podczas mitozy. To samo dotyczy całych chromosomów z uszkodzonymi kinetochorami; nie mogą one przyłączyć się do mikrotubul, które ciągną chromatydy w kierunku komórek potomnych podczas mitozy i dlatego pozostają poza nowymi jądrami. Uszkodzenia te mogą być generowane przez substancje chemiczne reagujące z białkami tworzącymi kinetochores.23,24
Aneugeny są substancjami chemicznymi, które zapobiegają tworzeniu się aparatu wrzecionowego podczas mitozy. Środki te powodują nie tylko powstawanie całych chromatyd, które są opuszczane z jąder, tworząc w ten sposób MN, ale także powstawanie komórek wielojądrowych, w których każde jądro zawierałoby inną liczbę chromosomów. Czynniki te mogą również wywoływać wzrost figur mitotycznych, które są wyraźnie widoczne na tych samych szkiełkach mikroskopowych. Z badaniem CBMN możliwe jest rozróżnienie między MN pochodzącymi z całych chromosomów oraz tymi pochodzącymi z acentrycznych fragmentów, jak również ustalenie, czy malsegregacja chromosomów występuje między jądrami w komórce dwujądrzastej, która może nie zawierać MN, poprzez wykorzystanie sond centromerycznych.8,10,19
Pancentromeryczne sondy DNA są wykorzystywane do rozróżnienia między MN pochodzącymi z jakiegokolwiek zdarzenia utraty całego chromosomu oraz MN zawierającymi acentryczne fragmenty chromosomów. Zastosowanie chromosomowo-swoistych sond centromerowych DNA pozwala zarówno na określenie specyficznych zdarzeń utraty chromosomów skutkujących MN, jak i nierównej segregacji określonych chromosomów wśród jąder potomnych nawet przy braku powstawania MN.21 Sondy pancentromerowe powinny być stosowane wyłącznie w celu odróżnienia MN pochodzących z przerw chromosomowych (centromer negatywny) od utraty chromosomów (centromer pozytywny). Specyficzne dla chromosomów sondy centromerowe powinny być używane tylko do pomiaru malsegregacji (z powodu nondysjunkcji lub utraty chromosomów) obejmującej unikalne chromosomy.8,10,19,21,25 Ocena mechanistycznego pochodzenia poszczególnych MN przez identyfikację centromerów i kinetochorów przyczynia się do wysokiej czułości i specyficzności metody.20
Ważne czynniki wpływają na podstawową częstość MN w ludzkich limfocytach. Wiek i płeć są najważniejszymi zmiennymi demograficznymi wpływającymi na indeks MN; częstości u kobiet są większe niż u mężczyzn o współczynnik 1,2-1,6, w zależności od grupy wiekowej.26 Częstość MN była istotnie i dodatnio skorelowana z wiekiem u mężczyzn i kobiet, a także wpływa na nią czynniki dietetyczne, takie jak niedobór folianów i stężenie witaminy B12 i homocysteiny w osoczu. Zaproponowano również, że na wskaźnik MN może wpływać skłonność komórek danej osoby do ulegania apoptozie oraz czynniki genetyczne, takie jak polimorfizmy genetyczne.10,20,27
W ogólnym ujęciu powstawanie MN przypisuje się różnym uszkodzeniom materiału genetycznego, które można podzielić na czynniki egzogenne i endogenne. Do czynników egzogennych zalicza się promieniowanie, czynniki chemiczne, inwazję mikroorganizmów. Czynniki endogenne obejmują defekty genetyczne, zmiany patologiczne, niedobór niezbędnych składników odżywczych (np. kwasu foliowego) oraz uszkodzenia wywołane szkodliwymi produktami przemiany materii (takimi jak reaktywne formy tlenu).28
Hipotezę predykcyjnego związku między częstością MN w teście CBMN w limfocytach a rozwojem nowotworu wspiera szereg ustaleń: (1) związek między częstością MN a ryzykiem raka został wywnioskowany z mechanistycznych podobieństw z aberracjami chromosomalnymi, które okazały się być predykcyjne dla raka; (2) in vitro obserwuje się wysoką zgodność między aberracjami chromosomalnymi a MN; (3) wzrost częstości MN obserwuje się w limfocytach pacjentów z rakiem i u pacjentów z zespołami, które czynią je podatnymi na raka, takimi jak zespół Blooma i ataksja telangiektazja; (4) częstotliwość MN jest istotnie związana ze stężeniem we krwi witamin takich jak foliany, których niedobory związane są ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia niektórych nowotworów; (5) istnieje bezpośredni związek pomiędzy częstotliwością MN a wczesnymi etapami kancerogenezy: mianowicie, istotny związek pomiędzy zwiększonymi częstotliwościami MN a niskimi i wysokimi kategoriami diagnostycznymi raka szyjki macicy u kobiet.20
Formowanie anomalii jądrowych, takich jak MN, rearanżacje chromosomalne i mostki anafazowe (prowadzące do cykli pęknięcie-fuzja-mostek i generowania większej ilości MN) są zdarzeniami powszechnie obserwowanymi we wczesnych etapach kancerogenezy. Podwyższone poziomy MN wskazują na defekty w naprawie DNA i segregacji chromosomów, które mogą skutkować generowaniem komórek potomnych ze zmienionym dawkowaniem genów lub deregulacją ekspresji genów, która może prowadzić do ewolucji fenotypu niestabilności chromosomowej często spotykanej w raku. Te względy dają mechanistyczne wsparcie dla możliwego związku przyczynowego między częstotliwością MN a ryzykiem raka. W badaniu Bonassi i wsp.29 zaobserwowano związek między częstością MN a ryzykiem nowotworu w niehematologicznych nowotworach złośliwych, co sugeruje, że zdarzenia związane z uszkodzeniem genomu w limfocytach mogą być skorelowane ze zdarzeniami inicjującymi nowotwory w innych tkankach za pośrednictwem wspólnego czynnika genetycznego, dietetycznego lub środowiskowego.
.