Microbiology & Experimentation

W tym badaniu podjęto izolację i charakterystykę szczepów bakteryjnych z gminy Barrackpore i wysypiska śmieci Dhapa. Wzrost bakterii zależy od różnych warunków fizykochemicznych, takich jak pożywka, pH, temperatura, okres inkubacji, źródło węgla itp. Tak więc różne warunki, na których bakterie rosły w naturalnym środowisku powinny być badane przed przejściem do masowego namnażania w celu wykorzystania ich jako rozkładających. Dlatego też wzięto pod uwagę następujące parametry:

Właściwości fizyczne i chemiczne stałych odpadów komunalnych

Bakterie mogą rosnąć w szerokim zakresie poziomu wilgotności. W tym badaniu stwierdzono, że zawartość wilgoci w próbce zebranej z gminy Barrackpore i składowiska odpadów Dhapa wynosiła odpowiednio 65,32% i 66,45%. Populacja bakterii w różnych glebach jest ściśle skorelowana z ich wilgotnością. Maksymalne zagęszczenie bakterii występuje w regionach o dość wysokiej wilgotności, a optymalny poziom aktywności bakterii tlenowych często wynosi 50%-75% zdolności zatrzymywania wilgoci przez glebę.1 Liczebność bakterii z rodzajów Pseudomonas, Achromobacter i Bacillus występuje w większości gleb tlenowych; tam gdzie panują warunki beztlenowe i wilgotne występują bakterie z rodzaju Clostridium. Actinomycetes wykazały podobny wzrost ilościowy w takich warunkach.15

W tym badaniu pH dwóch wybranych podłoży (BCDA i NA) zostało zoptymalizowane do hodowli szczepów bakterii. W obu próbkach ph pobranej próbki wynosiło 7,79. Odczyn pH jest kluczowym czynnikiem w hodowli bakterii w sztucznych podłożach. Optymalizacja pH została przeprowadzona na dwóch wybranych podłożach: Nutrient Agar (NA) i Basic czapek dox agar (BCDA). NA i BCDA o pH 7,2 i 7,6 okazały się odpowiednie dla maksymalnego wzrostu szczepów bakterii. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że pH próbki wynosiło około 7,79 i prawdopodobnie z tego powodu szczepy te dobrze rosły również w warunkach in vitro przy pH 7-8 w BCDA i NA. Bakterie mogą tolerować odczyn gleby w zakresie pH od 4 do 10, ale najbardziej korzystnym pH dla większości z nich jest właśnie odczyn zasadowy do obojętnego. Bakterie takie jak Thiobacillus thiooxidans i Acetobacter sp. są zdolne do wzrostu przy bardzo niskich wartościach pH pomiędzy poziomem pH 0 i 2, a niektóre Bacillus sp. mogą rosnąć przy pH 11.15 Optymalny wzrost Thermoactinomycetes zachodzi przy pH 8 lub 9 i jest znacznie osłabiony przez odczyn około pH 516 Vibrio, Streptococcus faecalis i Escherichia coli również tolerują odczyn alkaliczny (pH 8-9).16

Wstępnie zbadano zawartość NPK w próbce. Stwierdzono, że zawartość materii organicznej wynosiła 27,84% (gmina Barrackpore) i 29,32% (Dhapa), zawartość azotu w % wynosiła 0,165 (gmina Barrackpore) i 0,179 (Dhapa), zawartość fosforu w % wynosiła 0,502 (gmina Barrackpore) i 0,545 (Dhapa), a zawartość potasu w % wynosiła 18,29 (gmina Barrackpore) i 19,21 (Dhapa). Wszystkie te analizy dały jasne zrozumienie rodzimego środowiska bakterii, a tym samym były czynnikami decydującymi w izolacji i hodowli szczepów.

Charakterystyka kulturowa izolatów bakteryjnych

W naszym badaniu, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 i C3 – te 9 szczepów bakteryjnych zostało wyizolowanych w podłożach hodowlanych. Agar Czapek dox i agar odżywczy zostały wybrane w celu określenia najlepszych podłoży zapewniających masywny wzrost wyizolowanych szczepów. agar Czapek dox (BCDA) był odpowiedni do masywnego wzrostu BM3, D1,C2, a agar odżywczy (NA) był odpowiedni do masywnego wzrostu BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. Stwierdzono, że podłoże zawierające ekstrakt drożdżowy i ksylan było odpowiednie dla maksymalnego wzrostu bakterii, ale Pseudomonas sp., Bacillus spp. i Aeromonas sp. rosły dobrze na podłożu agarowym. Do charakterystyki wybranych szczepów wykorzystano obserwacje wizualne i mikroskopowe. Szczegóły dotyczące cech kolonii bakterii zostały zanotowane (Tabela 1). Barwienie metodą Grama jest starą i niezawodną metodą obserwacji bakterii. Bakterie Gram ujemne ulegały dekoloryzacji pod wpływem alkoholu, tracąc purpurowe zabarwienie fioletu krystalicznego. Bakterie Gram dodatnie nie ulegały dekoloryzacji i pozostawały purpurowe.

W obecnym badaniu, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 i C3 – te 9 szczepów bakterii zostało wyizolowanych i przeprowadzono ich charakterystykę mikrobiologiczną. Uzyskane wyniki wykazały, że BM1, BM3, D1 to gram dodatnie pałeczki, BM2 to gram dodatnie pałeczki krótkie, D2 to gram dodatnie diplobacillus, D3, C2 to gram ujemne pałeczki, D4 to gram ujemne pałeczki krótkie, a C3 to gram dodatni coccus. Przeprowadzono również różne testy biochemiczne dla 9 izolatów, aby poznać ich charakterystykę biochemiczną. Szczegóły dotyczące cech biochemicznych bakterii podano w (Tabela 2).

Powyższe wyniki dały pogląd na morfologię, charakterystykę kolonii i charakterystykę biochemiczną wyizolowanych szczepów, co pomogłoby w przyszłości w identyfikacji i charakterystyce wyizolowanych szczepów bakterii.

Optymalizacja warunków wzrostu

W obecnym badaniu wzrost wyizolowanych szczepów był obserwowany w różnych podłożach, takich jak NA, ACDA i BCDA. Stwierdzono, że podłoże basic czapek dox agar (BCDA) było odpowiednie do masywnego wzrostu BM3, D1, C2, a podłoże Nutrient agar (NA) było odpowiednie do masywnego wzrostu BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

W tym eksperymencie, kultury bakteryjne 9 szczepów były inkubowane w różnych temperaturach, takich jak 25, 29, 34, 37 i 40 °C. Optymalny wzrost wszystkich szczepów stwierdzono w temperaturze 37°C. Optymalny zakres temperatur dla bakterii wynosi od około 25-36°C. Duża liczba bakterii może rosnąć całkiem dobrze w temperaturze 10-4°C.6 Sultana17 zaobserwowała, że temperatura 33± 4°C jest idealna dla wzrostu bakterii.17 Niektóre bakterie rozwijają się najsilniej w temperaturze poniżej 20°C. Termofile rosną dobrze w temperaturach 45-65°C, a niektóre termofile nie są zdolne do namnażania się poniżej 40°C.1

Szczepy uzyskane w tym badaniu były inkubowane przez różne okresy inkubacji (6, 12, 24, 36, 48 i 72h). Okres inkubacji 24h był odpowiedni dla BM1, BM2, D2, D3, D4, C3, podczas gdy BM3, D1 i C2 okazały się odpowiednie przy okresie inkubacji 36h. Bakterie z grupy coli rosną w okresie inkubacji 24± 2h i w temperaturze 32°C oraz wykazują dobry wzrost w temperaturze 37°C przez 48h inkubacji. W obserwacji wizualnej stwierdzono, że po 24h inkubacji w preferowanym przez nie podłożu (BCDA i NA) barwa BM2 była jasnopomarańczowa, BM1 – biała, a BM3 – kremowobiała. Po 48-72 h inkubacji kolor BM2 był pomarańczowy, BM1, D1 były żółte, C2 czerwone, a BM3, D2, D3, D4, C3 kremowobiałe. Kolonie szczepów BM1, BM2, D2 i D4 były wilgotne, a pozostałe kremowe. Staphylococci i Micrococci wytwarzają złoto-brązowe, żółte lub białe kolonie na zwykłych podłożach. Niektóre Enterokoki, Coryneformy i Enterobakterie mogą wytwarzać czarne kolonie na zwykłym podłożu.8

Antagonizm

Metoda krzyżowa została zastosowana w celu określenia antagonizmu pomiędzy szczepami bakteryjnymi dla ich przyszłego zastosowania w różnych aspektach. Szczegóły dotyczące antagonizmu pomiędzy izolatami bakteryjnymi zostały opisane w tabeli 3.

BM2 wykazuje antagonizm ze wszystkimi innymi szczepami, więc nie jest możliwe stworzenie konsorcjum z wykorzystaniem tego szczepu jako jednego z izolatów. D1, D3 również wykazują antagonizm z większością pozostałych szczepów. BM1 jest najsilniejszym szczepem, ponieważ nie wykazuje antagonizmu z żadnym z pozostałych izolatów. BM3, D2, D4, D5 i D6 wykazują antagonizm z kilkoma izolatami i te szczepy wraz z BM1 mogą być testowane w różnych kombinacjach w celu przygotowania konsorcjum.

Tolerancja metali ciężkich

Pięć metali ciężkich (As, Zn, Pb, Hg, Cd) wybrano do określenia zdolności tolerancji metali przez wyizolowane szczepy bakteryjne (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3). Test tolerancji wykazał, że spośród pięciu badanych metali ciężkich, maksymalną tolerancję wykazano dla Pb wykazując wzrost mikroorganizmów do 4000ppm, a minimalną dla Cd wykazując brak wzrostu powyżej 30ppm. MIC odnotowywano, gdy izolaty nie rosły na płytkach nawet po 10 dniach inkubacji. Wyniki pokazują, że dla wszystkich trzech bakterii MIC wahało się od 250ppm do 350ppm dla As, Cd (10-30ppm), Zn (200-300ppm), Hg (200-300ppm) i Pb (3000-4000ppm) (Tabela 4). W niniejszych badaniach najwyższą tolerancję As i Cd stwierdzono w BM1, natomiast najwyższą tolerancję Zn zaobserwowano w BM2, a BM3 wykazało maksymalną akumulację Hg i Pb. W naszych badaniach najbardziej toksycznym metalem (z najniższym MIC) jest cd, natomiast najmniej toksycznym badanym metalem jest Pb (tab. 4).

MIC odnotowano, gdy izolaty nie rosły na płytkach nawet po 10 dniach inkubacji.18 Mergeay i wsp.19 badali minimalne stężenia hamujące (MIC) kilku różnych metali i stwierdzili, że najbardziej toksycznym metalem (z najniższym MIC) była rtęć, podczas gdy najmniej toksycznym metalem był mangan.19 Tolerancję drobnoustrojów na każde stężenie metalu ciężkiego przedstawiono za pomocą testu kubkowego. Średnica strefy zahamowania wzrostu wokół każdego kubka zwiększała się wraz ze wzrostem stężenia metali ciężkich, wskazując na toksyczny wpływ metali ciężkich na wzrost mikroorganizmów. Gmina Barrackpore i wysypisko śmieci Dhapa zbierają wszystkie domowe i przemysłowe odpady stałe odpowiednio z miasta Barrackpore, miasta Kolkata i jego okolic. Odpady pochodzące ze źródeł domowych i przemysłowych stanowią odpowiednie środowisko, w którym mikroorganizmy mogą rozwinąć odporność na metale ciężkie. Obecność niewielkich ilości metali ciężkich w odpadach stałych może indukować pojawienie się mikroorganizmów odpornych na metale ciężkie. Odporność drobnoustrojów na metale ciężkie przypisuje się różnorodnym mechanizmom detoksykacyjnym rozwijanym przez odporne mikroorganizmy, takim jak kompleksowanie przez egzopolisacharydy, wiązanie się z otoczkami komórek bakteryjnych, redukcja metali, odpływ metali itp. Mechanizmy te są niekiedy kodowane w genach plazmidowych ułatwiających przenoszenie oporności na metale toksyczne z jednej komórki do drugiej.20 Organizm oporny na metale ciężkie może być potencjalnym czynnikiem bioremediacji zanieczyszczeń metalami ciężkimi. Ponieważ wszystkie metale ciężkie są podobne w swoim mechanizmie toksycznym, tolerancja na wiele metali jest powszechnym zjawiskiem wśród bakterii opornych na metale ciężkie.21

Test wrażliwości na antybiotyki

Test wrażliwości na antybiotyki pomaga określić, jak skuteczny jest antybiotyk przeciwko badanemu organizmowi. 9 izolatów zostało przebadanych pod kątem ich wrażliwości na cztery antybiotyki, a wynik został odnotowany (Tabela 5). Większość izolatów wytwarza związki przeciwdrobnoustrojowe, które mogą służyć medycynie. D1, D3 i D5 nie wykazały aktywności przeciwdrobnoustrojowej.

Antimicrobial activity assay

Produkcja związków przeciwdrobnoustrojowych wydaje się być zjawiskiem powszechnym dla większości bakterii. W obecnym badaniu 3 izolaty wykazały aktywność przeciwbakteryjną i 5 izolatów wykazało aktywność przeciwgrzybiczą, ale 3 izolaty nie wykazały ani aktywności przeciwbakteryjnej, ani przeciwgrzybiczej wobec patogenów. Wynik ten został przedstawiony w tabeli 6. Podobne badania przeprowadzili Subramaniam i wsp.22 Członkowie rodzaju Bacillus wytwarzają różnorodne związki przeciwdrobnoustrojowe, z których wiele zidentyfikowano jako peptydy, lipopeptydy i pochodne fenolowe. W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się poszukiwaniu nowych metabolitów wtórnych o zróżnicowanej aktywności biologicznej w różnych środowiskach.

Produkcja enzymów zewnątrzkomórkowych

Wraz z rosnącą świadomością w zakresie ochrony środowiska, zastosowanie enzymów, szczególnie pochodzących od ekstremofili, zyskało znaczną uwagę w wielu procesach przemysłowych. W ostatnich latach, enzymy mikrobiologiczne zastępują katalizatory chemiczne w produkcji chemikaliów, tekstyliów, farmaceutyków, papieru i chemikaliów spożywczych. Bioprocesy przemysłowe oparte na enzymach obecnie bezpośrednio konkurują z procesami chemicznymi. Jednakże w tym badaniu, 9 izolatów zostało poddanych testom jakościowym na produkcję ośmiu różnych enzymów, takich jak proteaza, lecytynaza, DNaza, lipaza, celulaza, amylaza, katalaza i oksydaza. Podobne badania przeprowadzili Subramani i Narayanasamy.23 Co ciekawe, w naszym badaniu 6 z nich wykazało produkcję enzymu proteazy, który ma wysoką wartość rynkową. Wszystkie 9 szczepów produkowało katalazę i oksydazę. Wynik jest odnotowany (Tabela 7).

Atest proteaz

6 szczepów (BM1, BM3, D1, D3, C2 i C3) spośród 9 izolatów wykazywało produkcję proteaz. Proteazy mają szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym, detergentowym, farmaceutycznym, jak również w degradacji odpadów stałych, dlatego też przeprowadzono ilościowe oznaczenie produkowanej proteazy. Określono aktywność wytworzonego enzymu proteazowego, a wynik wyrażono w IU/ml. Wynik przedstawiono w tabeli 8. Ilościowe oznaczenie proteazy niezmiennie dowodzi, że spośród 6 szczepów, BM1 produkuje proteazę z wysoką wartością miana, a Gupta i wsp.,24 Podobnie Gupta i wsp.,24 donoszą o produkcji proteazy alkalicznej z gatunków bakterii i jej przemysłowym zastosowaniu.

Potencjał degradacji odpadów przez wyizolowane bakterie

Enzym proteaza ma szerokie zastosowanie w degradacji odpadów. Dlatego też 6 szczepów zdolnych do produkcji enzymu proteazowego poddano testowi wydajności degradacji odpadów. W naszych badaniach można zaobserwować, że BM1 ma najwyższy potencjał degradacyjny, a następnie BM3. BM1 jest również silnym producentem enzymu proteazowego, a więc posiada również lepszą zdolność do degradacji (Rysunek 1). W miarę rozkładu odpadów przez mikroorganizmy (bakterie), masa ściółki maleje. W obecnym badaniu rozkładu zaobserwowano, że masa przetworzonej ściółki zmniejszyła się, ponieważ bakterie rozłożyły ją i przekształciły w proste cząsteczki. Procentowy ubytek masy próbek odpadów wzrastał wraz z postępem procesu rozkładu, co można zaobserwować na rysunku 1. Podobne obserwacje poczynił Zaved i wsp.,25 badając utratę masy śmieci przez specyficzne bakterie w Bangladeszu. W naszym badaniu można zaobserwować, że BM1 ma najwyższy potencjał degradacji, a następnie. Tak więc BM1 może być skutecznie wykorzystany do bioremediacji odpadów stałych.