Kliniczne, genetyczne i strukturalne podstawy pozornego nadmiaru mineralokortykoidów spowodowanego niedoborem dehydrogenazy 11β-hydroksysteroidowej typu 2

Wyniki

Przedstawiamy dane demograficzne i fenotyp kliniczny 36 genetycznie potwierdzonych pacjentów z AME z International Consortium of Rare Steroid Disorders. Większość pacjentów była pochodzenia omańskiego (22 z 36) i perskiego (6 z 36), przy czym 75% pochodziło z małżeństw spokrewnionych, głównie w obrębie Omanu (ryc. 1B i tabela S1). Mediana wieku w momencie rozpoznania AME wynosiła 4,6 roku (zakres: 0,1-15), a kohorta była równomiernie rozłożona dla obu płci. Większość pacjentów (86%) urodziła się w terminie, a 76% urodziło się jako małe w stosunku do wieku ciążowego. Ryc. 1A pokazuje, że w naszej kohorcie było sześć mutacji typu missense, jedna insercja, dwie delecje i trzy mutacje typu frameshift oraz dwa indele. Zgodnie z oczekiwaniami patofizjologii AME, prezentowane średnie ciśnienie tętnicze było podwyższone powyżej 90. percentyla dla wszystkich badanych (ryc. 1C). Średni poziom potasu w surowicy podczas diagnozy był niski i wynosił 2,72 mmol/L (zakres: 1,5-4,1 mmol/L), podczas gdy stężenie wodorowęglanów w surowicy było wysokie i wynosiło 29,5 mmol/L (zakres: 20-38 mmol/L) (ryc. 1 D i E). Stężenie aldosteronu w surowicy było spodziewanie niskie (ryc. 1F), przy czym u dwóch pacjentów było ono podwyższone z niejasnych przyczyn. Dodatkowo poziomy reniny były niskie, z wyjątkiem dwóch pacjentów (10,4 i 14 ng/mL/h), którzy byli na terapii (Tabela S1). W podgrupie 29 pacjentów, średni stosunek (THF + alloTHF)/THE, reprezentujący główne metabolity kortyzolu i kortyzonu w moczu, był znacząco podwyższony na poziomie 19 (zakres: 3-55, norma: 1,0) (ryc. 1G). Na uwagę zasługuje fakt, że u 27 z 36 (75%) pacjentów stwierdzono również nefrokalcynozę. Nefrokalcynoza może wynikać z przewlekłej długotrwałej hipokaliemii, jak zauważono, na przykład, w zespole Barttera typu III (14).

Aby zrozumieć, czy fenotyp kliniczny niedoboru HSD11B2 można przewidzieć, badając zmiany w strukturze enzymu wywołane przez daną mutację HSD11B2, przeprowadziliśmy analizę in silico przy użyciu trzech estrogenowych HSD17B1, które wykazywały 27% podobieństwo sekwencji z HSD11B2 na 284 aminokwasach (ryc. S1A). Ludzki model HSD11B2 wykazywał charakterystyczny konserwowany motyw fałdowy Rossmanna wiążący NAD (Rys. S1B) z przyległym miejscem wiązania substratu (Rys. S1 C i D). Symulacje MD w czasie 500ns dla monomeru i dimeru HSD11B2 wykazały stabilny model ze stabilnie sfałdowanym białkiem (Rys. S1 E-H). Użyliśmy oprogramowania Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18) do określenia ΔΔG mutacji missense znalezionych u pacjentów z AME lub mutacji zaprojektowanych eksperymentalnie. Wszystkie mutacje (Ryc. 2A) wykazały wzrost wartości ΔΔG, sugerując utratę stabilności i funkcji białka (Ryc. 2B).

HSD11B2 istnieje jako homodimer w stanie nieaktywnym (13). Cztery reszty – R186, E190, A237 i R336 – leżą w interfejsie dimeru i dlatego mogą przeszkadzać w tworzeniu dimeru (Rys. 2C). Rezydy R186 i E190 znajdują się w interfejsie dimeru na helisie α4. Międzypodjednostkowa interakcja pary jonowej (R186-E190) powstaje w wyniku podwójnej odwróconej symetrii sąsiedniej podjednostki (Rys. 2D), podobnie jak para jonowa R112-E120 w HSD17B1 (15⇓-17). Co ważne, oddziaływanie to okazało się stabilne i było utrzymywane przez cały czas trwania 500-ns symulacji MD (Rys. 2 E-G). Ponadto stwierdzono, że oddziaływanie to stabilizuje helisę α4 i utrzymuje elastyczność wokół miejsca wiążącego koenzym. Tak więc, mutacja R186C powoduje utratę międzypodjednostkowej pary jonowej i przesuwa równowagę w kierunku tworzenia aktywnego monomerycznego enzymu (Rys. 2H). Zapobiega również tworzeniu się wewnątrzhelikalnej interakcji jon-para i w ten sposób pozwala na destabilizację elementów strukturalnych wokół miejsca wiązania koenzymu.

Istnieje kilka innych mutacji zakłócających w tym interfejsie dimeru obejmujących reszty A237, D244, L251 i D176. Reszta A237 jest otoczona przez L241 i V239 z obu podjednostek HSD11B2. Jej mutacja na Val zwiększa hydrofobowość tego skupiska i wzmacnia nieaktywny stan dimeryczny enzymu (ryc. 2I). Reszta D244 nie tylko tworzy wewnątrzpodjednostkowy mostek solny z R336, który utrzymuje razem helisę α5 i arkusze β7, ale również oddziałuje wiązaniem wodorowym z R360 z sąsiedniej podjednostki (Rys. 2J). Jego mutacja na Asn zmniejsza siłę oddziaływania z R360, prowadząc do utraty mostka solnego z R366, a to z kolei upośledza stabilność białka. Podobnie, mutacja hydrofobowego łańcucha bocznego L251 na grupę hydroksylową Ser zwiększa polarność i tworzy wiązanie wodorowe z dodatnio naładowanymi grupami łańcucha bocznego R361, co poprawia wiązanie dimeru (Rys. 2K). Wreszcie, mutacja D176 do Asn tworzy wiązanie wodorowe między asparaginą i T200, wzmacniając w ten sposób nieaktywny stan dimeru (ryc. 2L).

Mutacje reszt HSD11B2, które tworzą kieszeń wiążącą substrat lub koenzym (NAD+) wykazano w badaniach in vitro, aby wyeliminować aktywność enzymu (19) i spowodować ciężkie AME. Na przykład, Y226 znajduje się w kieszeni wiążącej substrat (Fig. 3A). Aromatyczny fenolowy łańcuch boczny tworzy hydrofobowe interakcje z pierścieniem aromatycznym substratu. Mutacja Y226N zastępuje tę resztę resztą niearomatyczną, powodując utratę hydrofobowego ułożenia, co zakłóca wiązanie substratu (ryc. 3A). Ponadto, mutacja ta zmienia łańcuch boczny z hydrofobowego na hydrofilowy, co jest niekorzystne dla wiązania hydrofobowego substratu. Mutacja A221V zastępuje krótki łańcuch boczny nieco bardziej wybrzuszonym łańcuchem bocznym Val, zakłócając w ten sposób wiązanie substratu poprzez zmniejszenie objętości kieszeni, podczas gdy mutacja A221G zmniejsza hydrofobowość i wprowadza elastyczność wokół sztywnej kieszeni wiążącej (ryc. 3B).

Nasz model pokazuje, że polarna grupa 17-OH w kortyzolu jest schowana w hydrofobowym regionie otoczonym przez Y226, P227 i L229. Ta grupa hydroksylowa jest nieobecna w kortykosteronie, co skutkuje wzmocnionymi interakcjami hydrofobowymi i ∼ 10-krotnie wyższym powinowactwem wiązania do HSD11B2 w porównaniu z kortyzolem (Fig. S2A). Poza nerkami, HSD11B2 ulega ekspresji również w łożysku. Chociaż receptor mineralokortykoidowy nie ulega ekspresji w tej tkance, HSD11B2 inaktywuje kortyzol, aby wyeliminować jego działanie hamujące wzrost i proapoptotyczne podczas rozwoju embrionalnego. W czasie ciąży wysoki poziom progesteronu w krążeniu matczynym może wiązać się z HSD11B2 i modulować jego aktywność. Może to przekładać się na wpływ mutacji typu loss-of-function, które zaburzają wiązanie progesteronu, na masę urodzeniową. Na przykład, mutacja A221V poważnie wpływa na wiązanie progesteronu bardziej niż kortyzolu z powodu sterycznych zderzeń między Val i wystającymi grupami metylowymi w progesteronie (Fig. S2B). Co bardzo interesujące, stwierdzamy, że dwie pacjentki z mutacją A221V były małe dla wieku ciążowego (Tabela S1). Podobnie, mutacja A221G wpływa na wiązanie progesteronu pośrednio poprzez zmianę struktury miejsca wiązania. Podobnie, mutacja Y226N jest bardziej szkodliwa dla wiązania progesteronu, ponieważ zmniejsza hydrofobowe interakcje między szkieletem progesteronu a pierścieniem hydroksyfenylowym tyrozyny (Figura S2B). W przeciwieństwie do tego, P227 zapewnia pośrednie wsparcie strukturalne dla miejsca wiązania, a mutacja do Leu ma podobny wpływ zarówno na kortyzol, jak i progesteron (Fig. S2B).

Istnieją cztery mutacje, które rezydują w miejscu wiązania koenzymu i zakłócają je, a tym samym poważnie upośledzają aktywność HSD11B2. Łańcuch boczny reszty L179 jest normalnie umieszczony przestrzennie w krótkim skręcie pomiędzy arkuszem β4 a helisą α4 (Rys. 3C). Umożliwiając oddziaływania z hydrofobowymi łańcuchami bocznymi V174 i L282, interakcje te czynią miejsce wiązania koenzymu bardziej elastycznym. Mutacja do Arg wprowadza łańcuch boczny guanidyny, który umożliwia interakcje z łańcuchem bocznym grupy karboksylowej E172 i łańcuchem bocznym grupy hydroksylowej T184 (Ryc. 3C), wprowadzając tym samym sztywność skrętu i zmniejszając elastyczność wymaganą do optymalnej funkcji enzymu (7). Usytuowany w kieszeni wiążącej koenzym, Y232 jest wysoce konserwowaną resztą w motywie fałdu Rossmanna (20), co sugeruje, że jego mutacja będzie szkodliwa dla aktywności enzymu (21). Boczny łańcuch hydroksylo-fenylowy Y232 tworzy ważne wiązania wodorowe z N171 i NAD+, utrzymując koenzym w prawidłowej pozycji dla jego funkcji katalitycznej (Rys. 3D). Ta interakcja jest zaburzona w mutacji Y232C powodującej ciężką postać AME. Znaczenie tej reszty w aktywności enzymu zostało niezależnie potwierdzone przez kilka mutacji inżynieryjnych (21) (Ryc. 3D). W mutacji G89D, karboksylowy łańcuch boczny Asp wykazuje poważne starcia steryczne z cząsteczką cukru rybozy adenozyny, co wpływa na wiązanie NAD+ (Rys. 3E). Inna mutacja K236R prowadzi do przerwania wiązania NAD (Rys. 3F). Zachowując zdolność do interakcji z NAD+ poprzez wiązanie wodorowe, mutacja ta znosi aktywność enzymu (21).

Uszkodzenia stabilności strukturalnej HSD11B2 zaburzają jego strukturę trzeciorzędową, powodując wyraźne osłabienie aktywności enzymu i ciężkie AME. Reszta L250 jest umieszczona w helisie α5, a jej łańcuchy boczne znajdują się w ciasnej kieszeni hydrofobowej otoczonej łańcuchami bocznymi L204, F246, W253, V255 i V257 (Rys. 4A). Reszty kieszeni hydrofobowej są zablokowane przez oddziaływanie jon-para pomiędzy R208 i E249. Wprowadzenie łańcucha bocznego Pro rozbija helisę α5, wprowadzając sztywność. Kieszeń ta jest również zbyt ciasna, aby pomieścić duży, nieporęczny guanidynowy łańcuch boczny Arg (Rys. 4A). Późniejsza utrata hydrofobowości w tym regionie wpływa na stabilność struktury. Kolejne stabilne wewnątrzhelikalne oddziaływanie typu jon-para tworzy się pomiędzy D144 i R147 (Rys. 4B). Oddziaływanie to umożliwia ciasne upakowanie helisy α3 z sąsiednimi arkuszami β w pobliżu miejsca wiązania NAD+. Mutacja D144V powoduje utratę tej interakcji i destabilizuje układ upakowania (Rys. 4B). Hydrofobowe upakowanie jest również zaburzone w mutacji F185S, kiedy aromatyczny łańcuch boczny fenyloalaniny, otoczony hydrofobowymi resztami V182, C188 i M189, zostaje zastąpiony polarnym łańcuchem bocznym seryny (Rys. 4C). Podobnie, hydrofobowy łańcuch boczny L363, otoczony resztami M347, I350 i F362, jest ułożony w helisę-turn-helix (ryc. 4D). Mutacja L363P zaburza tę helisę i lokalne środowisko strukturalne.

Ponadto kilka mutacji może zakłócić pakowanie białka HSD11B2, aby pogorszyć stabilność poprzez wprowadzenie bardziej wybrzuszonej reszty. Rezydencja A328 tworzy hydrofobowe interakcje z V215, I260, I325 i Y338 (Rys. 4E). Poprzez zastąpienie alaniny bardziej wybrzuszoną resztą Val, mutacja A328V powoduje zderzenia steryczne z łańcuchem bocznym I260 i Y338 z otaczających β-szkieletów (Rys. 4E). Rezydencja S180 jest umieszczona na pętli, a jej łańcuch boczny z grupą hydroksylową oddziałuje z łańcuchem bocznym i azotem szkieletu T184 (Rys. 4F). Ten łańcuch boczny leży w bardzo zwężonej przestrzeni i ogranicza możliwość przyłączenia jakiejkolwiek reszty o większej objętości, co powoduje kolizje steryczne, w rzeczywistości nie zmieniając struktury białka. Dlatego łańcuch boczny Phe z nieporęcznym pierścieniem aromatycznym, jak w mutacji S180F, nie jest tolerowany w tej pozycji (ryc. 4F).

Wielokrotne wiązania wodorowe i mostki solne między polarnymi resztami stabilizują strukturę trzeciorzędową enzymu HSD11B2. Niektóre mutacje powodują utratę tych interakcji, co skutkuje nieaktywnością enzymu i ciężkim AME. Na przykład, mostek solny pomiędzy R208 i E249 jest krytyczny (Rys. 4G). Jego utrata, jak w przypadku mutacji R208C i R208H, destabilizuje białko i skutkuje ciężką chorobą (Ryc. 4G). Podobnie, D223 tworzy mostek solny z R337 (ryc. 4H). Poprzez zastąpienie tego mostka solnego mniej silnym wiązaniem, wiązaniem wodorowym, mutacja D223N zmienia ujemnie naładowaną resztę na nienaładowaną resztę polarną, powodując znaczne osłabienie aktywności in vitro (22). To również sugeruje, że mostek solny odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilności i aktywności HSD11B2. Łańcuchy boczne R213 tworzą wiązania wodorowe z atomami szkieletowymi reszt A331 i L329 (Rys. 4I). Poprzez zmniejszenie tych wiązań wodorowych, które pomagają utrzymać strukturę trzeciorzędową białka, mutacja R213C upośledza stabilność enzymu (ryc. 4I).

Klaster Arg/Tyr z reszt 335-339 został wcześniej zaangażowany w utrzymanie stabilności białka, chociaż dokładny mechanizm pozostał niejasny (23). Mutacje obejmujące te reszty zgłoszono u pacjentów z AME, w tym R337C i Y338H. Symulacje modeli monomerycznego i dimerycznego HSD11B2 sugerują, że reszty R337 tworzą interakcję mostka solnego z D223 i wiązania wodorowe z grupą OH Y339 (ryc. 4J). Interakcje te wydają się być istotne w utrzymaniu prawidłowego fałdowania i stabilności białka. Tak więc, jego mutacja na Cys znosi zarówno mostek solny, jak i wiązanie wodorowe, aby zdestabilizować enzym i spowodować poważne AME. Genetycznie opracowane mutacje tej reszty pokazują, że R337K, która utrzymuje polarność i ładunek dodatni, zmniejsza aktywność enzymu o 70%, podczas gdy R337A, która jest podobna do R337C w posiadaniu nienaładowanych i krótkich łańcuchów bocznych, całkowicie inaktywuje HSD11B2 (23) (ryc. 4J). W tym samym klastrze Arg/Tyr, mutacja Y338 na His inaktywuje enzym, powodując ciężkie AME. Nasz model sugeruje, że ta reszta Tyr tworzy hydrofobowe interakcje z A328 i wiązania wodorowe z D327 (Fig. 4K). Obie interakcje pomagają utrzymać stabilność białka, tak że substytucja Tyr przez His, na przykład, inaktywuje HSD11B2. Dzieje się tak dlatego, że chociaż Y338H zachowuje zdolność wiązania wodorowego, to ma krótsze łańcuchy boczne, które destabilizują enzym. Podobnie, substytucja Tyr przez Phe w konstrukcie Y338F nie jest tolerowana. Tutaj interakcje hydrofobowe są zachowane, ale wiązanie wodorowe jest zniesione (23). Wreszcie, R337 i Y338 w klastrze Arg/Tyr są również wysoce konserwowane u wielu gatunków; zatem wszelkie zmiany w tych resztach prawdopodobnie nie będą tolerowane (23).

Zgłoszono, że kilka mutacji powoduje łagodniejszą formę AME z mniej poważnymi klinicznymi i biochemicznymi manifestacjami. Wykazano, że odpowiednie zmutowane konstrukty utrzymują aktywność HSD11B2 in vitro (4, 19, 24), co jest zgodne z mniej poważnym fenotypem klinicznym. Strukturalnie, mutacje te mogą albo pośrednio zaburzać wiązanie substratu (takie jak mutacja P227L u jednego z naszych pacjentów) lub zmieniać strukturę białka (takie jak mutacje R279C i R359W), aby osłabić, ale nie znieść aktywność enzymu (ryc. 5). Warto zauważyć, że podczas gdy reszta P227 nie leży w pozycji, która bezpośrednio oddziałuje z substratem, jej sąsiednie położenie do reszty Y226 sugeruje, że może ona odgrywać rolę w wiązaniu substratu (Fig. 5A). W rzeczywistości, reszta ta tworzy „załamanie” w regionie pętli, utrzymując konformację miejsca aktywnego, a także utrzymuje Y226 we właściwej pozycji, aby optymalnie oddziaływać z substratem. Mutacja tej reszty do Leu (P227L) przerywa załamanie i zmienia położenie Y226 (Rys. 5A).

Dwie niekonserwatywne mutacje uważane za zaburzające strukturę trzeciorzędową HSD11B2 zostały zidentyfikowane u pacjentów z AME typu 2. R279 tworzy wiązanie wodorowe ze szkieletem N171, co pomaga utrzymać i ustabilizować lokalne środowisko białka (ryc. 5B). Zastąpienie R279 resztą, która nie tworzy wiązania wodorowego, jak w mutacji R279C, prowadzi do łagodnego osłabienia, ale nie całkowitego wyeliminowania aktywności HSD11B2 (24), co jest zgodne z łagodnym fenotypem klinicznym (ryc. 5B). Inna niekonserwatywna mutacja, R359W, zmienia właściwości łańcucha bocznego z naładowanego na hydrofobowy. Zmienia to lokalne oddziaływanie w strukturze białka, w którym dodatnio naładowany łańcuch boczny R359 tworzy wiązanie wodorowe z tlenem karbonylowym szkieletu I350 (ryc. 5C). Utrata tej interakcji przyczynia się do zwiększenia elastyczności strukturalnej, powodując osłabienie aktywności enzymu. Warto zauważyć, że zarówno R279C jak i R359W powodują minimalne zakłócenia w oddziaływaniach wewnątrzcząsteczkowych i występują w pobliżu powierzchni białka.

.