Inhibition of MDM2 via Nutlin-3A: A Potential Therapeutic Approach for Pleural Mesotheliomas with MDM2-Induced Inactivation of Wild-Type P53

Abstract

Previously, our group demonstrated that nuclear expression of E3 ubiquitin ligase (MDM2) in malignant pleural mesothelioma (MPM) is significantly associated with decreased overall survival. Możliwym wytłumaczeniem może być fakt, że nadekspresja MDM2 prowadzi do proteasomalnej degradacji TP53, co ostatecznie skutkuje utratą apoptozy i senescencji indukowanej przez TP53. Na przykładzie innych jednostek nowotworowych wiadomo, że przywrócenie aktywności TP53, np. poprzez inhibicję MDM2, skutkuje natychmiastową odpowiedzią komórek nowotworowych na stres i/lub uszkodzenia DNA indukowane przez TP53. Nutlina-3A (analog cis-imidazoliny) została opisana jako silny i selektywny inhibitor MDM2, zapobiegający interakcji MDM2-TP53 poprzez specyficzne wiązanie się do hydrofobowej kieszeni TP53 w MDM2. W obecnym badaniu efekty hamowania MDM2 w MPM przez Nutlin-3A i standardowe chemioterapeutyki oparte na platynie były testowane porównawczo na trzech liniach komórkowych MPM (NCI-H2052, MSTO-211H i NCI-H2452) wykazujących różne profile ekspresji TP53, MDM2 i jego fizjologicznego inhibitora MDM2-P14/ARF. Nasze eksperymenty in vitro na liniach komórkowych MPM wykazały, że Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną powodował do 9,75 razy większą indukcję senescencji (p=0,0050) i do 5 razy wyższy wskaźnik apoptozy (p=0,0067) w porównaniu z powszechnie stosowanymi schematami cisplatyny i pemetreksedu. Tak więc Nutlin-3A, silny inhibitor MDM2, wiąże się z istotną indukcją senescencji i apoptozy w liniach komórkowych MPM, co czyni Nutlin-3A obiecującą substancją dla terapii celowanej w podgrupie MPM wykazującej nadekspresję MDM2.

1. Wstęp

Złośliwy międzybłoniak opłucnej jest wysoce agresywnym nowotworem powstającym z powierzchni wyścielonych mezotelium, głównie z jam opłucnej (malignant pleural mesothelioma, MPM). Jeśli nie jest leczony, mediana przeżycia pacjentów wynosi dziewięć miesięcy. Na pacjentów z MPM negatywny wpływ mają głównie niewystarczające obecnie stosowane metody leczenia, polegające na stosowaniu schematów zawierających platynę, w których pierwszym wyborem jest cisplatyna lub karboplatyna. Leczenie cisplatyną skutkuje odsetkiem odpowiedzi wynoszącym zaledwie 14% i medianą przeżycia wynoszącą mniej niż siedem miesięcy. Karboplatyna daje podobne odsetki odpowiedzi, wahające się od 6 do 16%. W praktyce klinicznej antyfolian pemetreksed, jako jedyny zatwierdzony przez FDA lek w leczeniu MPM, jest stosowany w skojarzeniu ze związkami platyny.

Kilka badań wykazało skuteczność oceny wewnątrzkomórkowej ekspresji członków metabolizmu kwasu foliowego w przewidywaniu odpowiedzi na wielokierunkową terapię antyfolianową u pacjentów z różnymi jednostkami nowotworowymi, ale są one omawiane kontrowersyjnie. Ponieważ analogi platyny są związkami genotoksycznymi, które indukują uszkodzenia DNA prowadzące do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy TP53, można przypuszczać, że mechanizm naprawy DNA może być jednym z kluczy związanych z upośledzeniem odpowiedzi na terapię. Ponieważ identyfikacja właściwości molekularnych wspólnych dla MPM może pomóc w przezwyciężeniu obserwowanej słabej odpowiedzi na leczenie, w kilku badaniach zajęto się tym zagadnieniem. Jednak przyczyny raczej słabej skuteczności związków platyny pozostają w dużej mierze nieznane.

Podsumowując, do chwili obecnej nie istnieją ani wiarygodne biomarkery predykcyjne, ani zindywidualizowane koncepcje terapeutyczne dla MPM. Dlatego aktualne wytyczne podkreślają potrzebę innowacyjnych i nowatorskich terapii.

Ponieważ mutacje genu TP53 są niezwykle rzadkie w MPM, inne mechanizmy, takie jak delecja locus lub zmiany epigenetyczne mogą przyczyniać się do inaktywacji TP53. Nadekspresja MDM2 w niektórych typach nowotworów może prowadzić do utraty funkcji regulacyjnej TP53 w komórkach nowotworowych poprzez jego zwiększoną degradację proteasomalną. P14/ARF, fizjologiczny inhibitor MDM2, jest uznawany za supresor nowotworów i przyczynia się do tego mechanizmu poprzez indukcję zatrzymania cyklu komórkowego w sposób zarówno TP53-zależny, jak i TP53-niezależny. Ponadto, regulacja miRNA wydaje się odgrywać ważną rolę. W poprzednich badaniach wykazaliśmy silną jądrową nadekspresję MDM2 w około 25% MPM; ta obserwacja była ograniczona do epitelioidalnych MPM lub epitelioidalnych komponentów dwufazowych MPM . Pacjenci z MDM2-dodatnim MPM wykazywali znacznie krótszy całkowity czas przeżycia (OS) i czas wolny od progresji choroby (PFS) w porównaniu z MDM2-ujemnym MPM. Można to wytłumaczyć znacznie zmniejszoną lub całkowicie zniesioną aktywnością i/lub stabilnością TP53, w czym pośredniczy nadekspresja MDM2 .

Przywrócenie aktywności TP53, np. poprzez hamowanie MDM2, może skutkować natychmiastową odpowiedzią komórek nowotworowych na stres i/lub uszkodzenia DNA indukowane przez TP53. Nutlin-3A (analog cis-imidazoliny) jest silnym i selektywnym inhibitorem MDM2 o wartości IC50 wynoszącej 90nM i zapobiega interakcji MDM2-TP53 poprzez wiązanie się z hydrofobową kieszenią wiążącą TP53 w MDM2.

Tak więc, celem tego badania było sprawdzenie efektu hamowania MDM2 w MPM poprzez Nutlin-3A w porównaniu do współczesnych powszechnych strategii chemioterapeutycznych przy użyciu trzech linii komórkowych wykazujących różne profile markerów dotyczących statusu TP53, poziomu ekspresji P14/ARF- i MDM2.

2. Materiał i Metody

2.1. Cell Line Experiments

Based on reviewing the literature, concentrations for the cytostatics were estimated (Nutlin-3A , cisplatin , and pemetrexed , respectively).

Human MPM cell lines were obtained from the American Type Culture Collection in 2012-08 (Manassas, VA, USA). Linie komórkowe zostały uwierzytelnione i przetestowane pod kątem zanieczyszczeń przy użyciu komercyjnej usługi (Multiplexion, Heidelberg, Niemcy) i zostały ostatnio ponownie przetestowane bezpośrednio po zakończeniu eksperymentów.

NCI-H2052, NCI-H2452, i MSTO-211H były hodowane w Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (Invitrogen, CA, USA) zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Invitrogen) w temperaturze 37 ° C w atmosferze 5% CO2-humidified. Komórki hodowano do 85% do 95% konfluencji, następnie przemywano buforowanym fosforanami roztworem soli fizjologicznej (Invitrogen) i trypsynizowano 1 ml 0,05% trypsyny-0,53 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego, czerwieni fenolowej (Invitrogen). Trypsynizację przerywano przez dodanie do reakcji świeżego medium. Około 10 μl przenoszono do hemocytometru (BRAND, Wertheim, Niemcy) w celu policzenia komórek. 1000 komórek na studzienkę (100 μl) posiano do mikropłytek 96/U (Eppendorf, Hamburg, Niemcy) odpowiednich do wykrywania luminescencji i fluorescencji. Komórki pozostawiono na noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. Następnego dnia usuwano pożywkę i do każdej studzienki dodawano świeżą pożywkę zawierającą jeden z cytostatyków lub bez dodatku. Cisplatynę (10μM; TEVA, Petah Tikva, Izrael) pemetreksed (200μM; Lilly, IN, USA) i Nutlin-3A (5, 10 lub 20μM; Sigma-Aldrich, MO, USA) stosowano pojedynczo lub w kombinacji. Nutlin-3A musiała być rozpuszczona w sulfotlenku dimetylu (Sigma-Aldrich). Stężenia stosowanych cytostatyków zestawiono w tabeli 1. Hodowle komórkowe zawierające cytostatyki i puste podłoże inkubowano przez trzy dni w temperaturze 37°C i 5% CO2. W ciągu 72 godzin oceniano nekrozę, apoptozę i żywotność komórek za pomocą następujących testów luminescencyjnych: CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega) oraz CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Testy przeprowadzono zgodnie z zaleceniami dostawcy. Dla każdego leku cytostatycznego i oznaczenia luminescencji zmierzono co najmniej cztery punkty danych. Luminescencję oceniano przy użyciu czytnika mikropłytek SpectraMax L Luminescence Microplate Reader (Molecular Devices, CA, USA). Luminescencję (względne jednostki luminescencji; RLU) mierzono przy długości fali 570nm, a czas integracji ustawiono na 1 sekundę. Temperatura SpectraMax L podczas pomiarów utrzymywana była w zakresie od 21,5°C do 24,5°C. Dodatkowo, z każdej linii komórkowej przygotowano blok FFPE do analizy immunohistochemicznej i qPCR.

2.2. Izolacja RNA i Real-Time qPCR

Poziomy ekspresji ACTB (gen referencyjny), MDM2 i P14/ARF, badano za pomocą TaqMan real-time qPCR w trzech liniach komórkowych MPM. Dlatego też RNA izolowano poprzez wycięcie trzech do pięciu sekcji 4μm z bloku FFPE za pomocą mikrotomu (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Niemcy). Całkowite RNA izolowano przy użyciu zestawu miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Niemcy) i protokołu producenta, z wyjątkiem dwóch modyfikacji (trawienie proteinazą K przez noc; elucja w 25μl). Stężenie RNA mierzono za pomocą spektrometrii UV/VIS (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Niemcy). RNA przechowywano w temperaturze -80°C. Do syntezy cDNA użyto zestawu iScript Select cDNA Synthesis Kit oraz protokołu (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, USA) użyto 1μg całkowitego RNA na reakcję.

Do qPCR w czasie rzeczywistym użyto TaqMan Gene Expression Assays on Demand (AoD) dla ACTB (Hs03023943_g1), MDM2 (Hs01066942_m1), i P14/ARF (Hs99999189_m1) (Applied Biosystems®; CA, USA). Objętości reakcji zostały zmodyfikowane przez użycie 50% zalecanych całkowitych objętości reakcji z 50 ng cDNA na wejściu. Każdy cel był mierzony w trzech powtórzeniach. Wartości Ct dla P14/ARF i MDM2 zostały znormalizowane do średnich wartości ACTB. Real-time qPCR i analizę danych przeprowadzono na aparacie Roche LightCycler 480 II (Roche, Basel, Szwajcaria) i odpowiednim oprogramowaniu. Wszystkie eksperymenty qPCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono zgodnie z wytycznymi MIQE

2.3. Immunohistochemia

Immunohistochemia została wykonana zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu automatycznego barwiarki (Ventana Discovery XT, Monachium, Niemcy). Po walidacji na tkankach referencyjnych (liposarcoma dla MDM2, gruczolakorak płuc dla TP53), badania immunohistochemiczne wykonywano z przeciwciałami skierowanymi przeciwko MDM2 (klon IF2, Calbiochem, Darmstadt, Niemcy, rozcieńczenie: 1:80) i TP53 (klon BP53-12, Zytomed, Berlin, Niemcy; rozcieńczenie: 1:5000). Wstępną obróbkę w celu odzyskania antygenu przeprowadzono przez ogrzewanie w wodzie dejonizowanej o pH 6 przez 30 minut. Ekspresję białka oceniano za pomocą czterostopniowego systemu punktacji IHC opartego na odsetku jąder komórek nowotworowych z pozytywną immunoreakcją (Wynik 0: brak sygnału; Wynik 1 (słaba ekspresja): 1-25%; Wynik 2 (umiarkowana ekspresja): 26-50%; Wynik 3 (silna ekspresja): >50%).

2.4. Analiza statystyczna

Analizy statystyczne i graficzne przeprowadzono przy użyciu środowiska programowania statystycznego R (v3.4.2).

Do analizy między pojedynczymi grupami zastosowano test sumy rang Wilcoxona Manna-Whitneya (nieparametryczny) lub dwustronny test t-Studenta (parametryczny). W przypadku zmiennych porządkowych z więcej niż dwiema grupami (różnice sygnału luminescencji pomiędzy wszystkimi grupami leczenia), do wykrycia różnic pomiędzy grupami zastosowano test Kruskala-Wallisa (nieparametryczny) lub ANOVA (parametryczny).

Poziom istotności statystycznej zdefiniowano jako p<0,05.

3. Wyniki

Profile ekspresji MDM2, TP53 i P14/ARF różnią się pomiędzy badanymi liniami komórkowymi i zostały podsumowane w Tabeli 2. Skany barwień immunohistochemicznych przedstawiono na rycinie 1, a wyniki qPCR na rycinie 2. W NCI-H2052 stwierdzono wyraźną immunoekspresję MDM2, ale niewielką P14/ARF i TP53. Immunohistochemicznie, MSTO-211H nie wykazał ekspresji MDM2 i P14/ARF, ale obecna była ekspresja TP53. W NCI-H2452 nie stwierdzono ekspresji MDM2- ani TP53-, natomiast wykryto ekspresję P14/ARF. Badane linie komórkowe reprezentują konstelację molekularną, która była opisywana we wcześniejszych badaniach u pacjentów z MPM.

Linia komórkowa MDM2 P53 P14/ARF NCI-.H2052 „+” „+” „+/-„ MSTO-211H „+/-„ „+” „-„ NCI-.H2452 „-„ „-„ „+”

-: minimalna do braku ekspresji +: ekspresja mierzalna +/-: mała ekspresja mierzalna

Tabela 2

Konstelacja markerów molekularnych badanych linii komórkowych MPM. Immunoekspresja lub mRNA-ekspresja badanych markerów jest przedstawiona dla każdej badanej linii komórkowej.

(a) NCI-H2052, barwienie anty-P53

(b) NCI-H2052, anti-MDM2 staining

(c) NCI-H2452, anti-P53 staining

(d) NCI-H2452, anti-MDM2 staining

(e) MSTO-211H, anti-P53 staining

(f) MSTO-211H, anti-MDM2 staining

(a) NCI-H2052, barwienie anty-P53
(b) NCI-H2052, barwienie anty-MDM2
(c) NCI-H2452, anti-P53 staining
(d) NCI-H2452, anti-MDM2 staining
(e) MSTO-211H, anti-P53 staining
(f) MSTO-211H, anti-MDM2 staining

Rycina 1

Barwienie immunohistochemiczne badanych linii komórkowych MPM przeciwciałami skierowanymi przeciwko P53 i MDM2. NCI-H2052 wykazuje silne barwienie (Score 2) w odniesieniu do P53 (a) i MDM2 (b). NCI-H2452 nie wykazał immunoekspresji ani dla P53 ((c), wynik 0), ani dla MDM2 ((d), wynik 0). MSTO-211H barwił się pozytywnie dla P53 ((e), wynik 1) i MDM2 ((f), wynik 1). Paski skali oznaczają 100 μm dla zdjęć (a) i (b) oraz 500 μm dla zdjęć (c), (d), (e) i (f).

Rycina 2

Wykres słupkowy przedstawia względną ekspresję mRNA MDM2, P53 i P14/ARF w badanych liniach komórkowych MPM. Na osi x pokazano badane linie komórkowe i odpowiednią ekspresję mRNA P53, MDM2 i P14/ARF. Na osi y pokazano wartości 2∧ΔCt dla względnej ekspresji mRNA badanych genów docelowych po normalizacji względem genu referencyjnego ACTB (actin, beta). NCI-H2052 i MSTO-211H wykazują podwyższoną ekspresję MDM2, podczas gdy NCI-H2452 wykazuje minimalną ekspresję MDM2. Ekspresja mRNA TP53 była obniżona w NCI-H2452 w porównaniu do obu pozostałych linii komórkowych. Ekspresja P14/ARF była poniżej granicy wykrywalności w badanych próbkach.

3.1. Response of MPM Cell Lines to Pemetrexed, Cisplatin, and Varying Nutlin-3A Concentrations

Cisplatin (10μM) and pemetrexed (200μM) as single agent as well as in combination were tested versus three Nutlin-3A concentrations (5μM, 10μM, and 20μM).

3.1.1. Żywotność komórek

NCI-H2052. Każde stężenie Nutlin-3A było lepsze w zmniejszaniu żywotności komórek w porównaniu do cisplatyny lub pemetreksedu lub ich kombinacji, odpowiednio (p=0,0039). W przeciwieństwie do tego, leczenie samym pemetreksedem wykazywało znacząco podwyższoną żywotność komórek. Leczenie samą cisplatyną wykazywało większą żywotność komórek niż cisplatyna i pemetreksed w połączeniu.

MSTO-211H. Pemetreksed w połączeniu z cisplatyną był związany z najwyższą żywotnością komórek, a następnie z samą cisplatyną i najmniejszym stężeniem Nutlin-3A (p=0,0952). Pemetreksed w połączeniu z cisplatyną znacząco zmniejszał żywotność komórek, ale Nutlin-3A (10μM) wykazywał nieco silniejszą redukcję. Najwyższe stężenie Nutlin-3A zmniejszało żywotność komórek do minimum.

NCI-H2452. Najwyższe stężenie Nutlin-3A (20μM) zmniejszało żywotność komórek do minimum (p=0,0017). Nutlin-3A w stężeniu 10μM był drugim najsilniejszym inhibitorem żywotności komórek, po samej cisplatynie, samym pemetreksedzie i cisplatynie w połączeniu z pemetreksedem. Najmniejsze stężenie Nutlin-3A wykazywało najsłabszy wpływ na zmniejszenie żywotności komórek.

Box plots for cell viability highlight decreasing cell viability with increasing Nutlin-3A concentration in the tested cell lines. Wyniki dla wszystkich linii komórkowych dotyczące starzenia się/żywotności komórek są podsumowane na Rysunkach 3(a)-3(c).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Rysunek 3

Indukcja senescencji w liniach komórkowych MPM przez pemetreksed, cisplatynę i różne stężenia Nutlin-3A, jak również różne stężenia Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną. Rycina 3 przedstawia boxploty dla żywotności/senescencji komórek dla trzech badanych linii komórkowych MPM. Na osi y pokazano RLU (względne jednostki luminescencji). Wysokie RLU wskazują na wysoką żywotność komórek, podczas gdy niskie RLU wskazują na senescencję. Na osi x pokazano stężenia zastosowanych cytostatyków i kontroli. We wszystkich trzech liniach komórkowych MPM, 20μM Nutlin-3A wykazała najsilniejsze zahamowanie żywotności komórek w porównaniu z innymi cytostatykami jednoagregatowymi i zastosowanymi stężeniami. Jest to prawdziwe wobec innych stężeń Nutlin-3A (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,007, NCI-H2452: p<0,001), cisplatyny (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,018, NCI-H2452: p=0.004), pemetreksedu (NCI-H2052: p=0,032, MSTO-211H: p=0,008, NCI-H2452: p=0,006) oraz kombinacji obu tych leków (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,002, NCI-H2452: p<0,001). Dodatkowo, wyższe stężenia Nutlin-3A (10μM, 20μM) w połączeniu ze schematem cisplatynowym wykazywały najsilniejsze hamowanie żywotności komórek w porównaniu z obecnie zatwierdzonymi cytostatykami, zarówno jako pojedyncze środki (cisplatyna: NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,022, NCI-H2452: p=0,006; pemetreksed: NCI-H2052: p=0,014, MSTO-211H: p=0,029, NCI-H2452: p<0,001) lub w połączeniu (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,014, NCI-H2452: p<0,001).

3.1.2. Apoptosis

NCI-H2052. W linii komórkowej NCI-H2052, najwyższy wskaźnik apoptozy stwierdzono dla 20μM Nutlin-3A, podczas gdy pozostałe podejścia do leczenia wykazywały podobną indukcję apoptozy (p=0,14).

MSTO-211H. W MSTO-211H najwyższe wskaźniki apoptozy stwierdzono dla pemetreksedu, a następnie dla pemetreksedu w połączeniu z cisplatyną i różnymi stężeniami Nutlin-3A (p=0,0219). Prawie nie obserwowano apoptozy dla samej cisplatyny i Nutlin-3A.

NCI-H2452. NCI-H2452 wykazał najwyższy wskaźnik apoptozy w odpowiedzi na Nutlin-3A w najwyższym stężeniu (20μM), a następnie na cisplatynę (p=0,0359). Znacząco niższe wskaźniki apoptozy stwierdzono dla pozostałych cytostatyków.

Wyniki dotyczące apoptozy podsumowano na rycinach 4(a)-4(c).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Rycina 4

Rycina 4 przedstawia boxploty dla apoptozy dla badanych linii komórkowych MPM. Na osi y pokazano RLU (relative luminescence units). RLU i wzrastające wskaźniki apoptozy wykazują bezpośrednią korelację. Na osi X przedstawiono stężenia zastosowanych cytostatyków i kontroli. W przypadku linii komórkowych NCI-H2052 i NCI-H2452 (przedstawionych odpowiednio na ryc. 4(a) i 4(c)), 20μM Nutlin-3A wykazała najsilniejszą indukcję apoptozy przy porównaniu pojedynczych środków (cisplatyna: NCI-H2052: p=0,084, NCI-H2452: p=0,028; pemetreksed: NCI-H2052: p=0,011, NCI-H2452: p=0,049), ale także wobec cisplatyny w połączeniu z pemetreksedem (NCI-H2052: p=0,015, NCI-H2452: p=0,008). MSTO-211H (pokazany na Rysunku 4(b)), najwyższy wskaźnik apoptozy, stwierdzono dla pemetreksedu, a następnie 5μM, 20μM Nutlin-3A oraz kombinacji pemetreksedu i cisplatyny (wszystkie p<0,001). Analizując Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną, dla linii komórkowej NCI-H2052, (a) najwyższy wskaźnik apoptozy stwierdzono dla 10μM Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną (wszystkie p<0,001). MSTO-211H (b) wskaźniki apoptozy dla 10μM Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną porównywalne do leczenia samym pemetreksedem (p=0,493), znacząco wyższe w porównaniu do wszystkich innych metod (p=0,016). W NCI-H2452 (c), leczenie cisplatyną w połączeniu z 20μM i 10μM Nutlin3A wykazało najsilniejszą indukcję apoptozy obok samego 20μM Nutlin-3A (p=0,004), ale nie wykazuje istotnych statystycznie różnic w porównaniu z leczeniem pojedynczym 20μM Nutlin-3A (p=0,199).

3.1.3. Martwica

Na martwicę komórek nie miał wpływu żaden z chemioterapeutyków w porównaniu do kontroli (dane nie pokazane).

3.2. Response of MPM Cell Lines to Varying Nutlin-3A Concentrations Combined with Cisplatin

W dalszych eksperymentach indukcję apoptozy badano stosując schemat Nutlin-3A lub połączenie Nutlin-3A i cisplatyny. Trzy kombinacje Nutlin-3A (5μM, 10μM, i 20μM) plus cisplatyna (10μM) porównano z samą cisplatyną (10μM), samym pemetreksedem (200μM), samą Nutlin-3A (10μM) oraz kombinacją cisplatyny i pemetreksedu.

3.2.1. Cell Viability

NCI-H2052. Sama Nutlin-3A i jej kombinacja z cisplatyną wykazywały istotnie zwiększoną indukcję senescencji w porównaniu z drugim schematem (p=0,0051). Jedynie 5μM Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną wykazywała mniejszą siłę indukcji senescencji niż 5μM Nutlin-3A bez cisplatyny. Wyższe stężenia Nutlin-3A (10 i 20μM) z cisplatyną minimalnie obniżały żywotność komórek. Najwyższą żywotność komórek stwierdzono dla pemetreksedu, a następnie kombinacji pemetreksedu i cisplatyny.

MSTO-211H. Każde połączenie Nutlin-3A z cisplatyną indukowało znacząco zwiększoną senescencję komórkową w porównaniu z cisplatyną, pemetreksedem lub kombinacją obu tych leków (p=0,0059). Jednakże, połączenie cisplatyny i pemetreksedu wykazywało podobną skuteczność w porównaniu z najniższym schematem Nutlin-3A/cisplatyna i samą Nutlin-3A. Wyższe stężenia Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną zmniejszały żywotność komórek do minimum.

NCI-H2452. Nutlina-3A w połączeniu z cisplatyną lub samodzielnie była lepsza w porównaniu z innymi cytostatykami, z wyjątkiem najniższego stężenia 5μM (p=0,0089). Co ciekawe, cisplatyna wykazywała porównywalną skuteczność jak sama 10μM Nutlin-3A oraz cisplatyna w połączeniu z 5μM Nutlin-3A. Najwyższą żywotność komórek obserwowano w przypadku pemetreksedu, cisplatyny w połączeniu z pemetreksedem i 5μM Nutlin-3A. Najwyższe stężenie Nutlin-3A (20μM) z cisplatyną wykazało najwyższy wskaźnik senescencji.

Box plots dla żywotności komórek podkreślają, że żywotność komórek zmniejszała się wraz ze wzrostem stężenia schematu cisplatyna/Nutlin-3A w badanych liniach komórkowych. Wyniki dotyczące senescencji/żywotności komórek podsumowano na rysunkach 3(a)-3(c).

3.2.2. Apoptosis

NCI-H2052. W linii komórkowej NCI-H2052 wyższe stężenia Nutlin-3A w połączeniu z zastosowaną cisplatyną indukowały istotnie zwiększoną apoptozę w porównaniu z samym pemetreksedem lub w połączeniu z cisplatyną (p=0,0069). Najwyższe wskaźniki apoptozy stwierdzono dla 10μM Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną.

MSTO-211H. Linia komórkowa MSTO-211H wykazywała najwyższy wskaźnik apoptozy przy leczeniu samym pemetreksedem (p=0,0035). Drugi najwyższy wskaźnik apoptozy stwierdzono dla 10μM Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną. Pemetreksed w połączeniu z cisplatyną powodował trzeci najwyższy wskaźnik apoptozy. Cisplatyna w połączeniu z 20μM Nutlin-3A była silniej działająca niż sama cisplatyna, sama Nutlin-3A i najmniejsze stężenie Nutlin-3A (5μM) w połączeniu z cisplatyną.

NCI-H2452. Najwyższe wskaźniki apoptozy stwierdzono dla pojedynczego środka Nutlin-3A o stężeniu 20μM, jak również dla stężeń 10μM i 20μM Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną, a następnie dla cisplatyny (p=0,1).

Wyniki dotyczące apoptozy podsumowano na rycinach 4(a)-4(c).

3.2.3. Martwica

Na martwicę komórek nie miał wpływu żaden z chemioterapeutyków w porównaniu z nietraktowaną kontrolą (dane nie pokazane).

Wszystkie wyniki eksperymentów hamowania linii komórkowej podsumowano w tabeli 3.

(a) Odpowiedź linii komórkowych MPM na pemetreksed, cisplatynę, i różne stężenia Nutlin-3A

. . . Żywotność komórek 10um. Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Nut 10uM Nut 20uM Nut H2052 + -. + ++ ++ +++ MSTO-211H 0 + 0 0 ++ +++ H2452 0 0 – – -. + ++ Apoptoza 10um Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Orzech 10uM Orzech 20uM Orzech H2052 0 0 + 0 0 0 ++ MSTO-211H 0 ++ + + 0 ++ H2452 0 0 0 0 0 0 0 ++ +++

(b) Odpowiedź linii komórkowych MPM na różne stężenia Nutlin- 3A w połączeniu z cisisisisiloksanem.3A w połączeniu z cisplatyną

. . Żywotność komórek 10uM Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Orzech+10um Cis 10uM Orzech+10um Cis 20uM Orzech+10um Cis 10uM Orzech H2052 0 -. 0 + ++ + + MSTO-211H + + ++ ++ ++ ++ ++ H2452 + – -. + ++ +++ + Apoptoza 10uM Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Nut+10um Cis 10uM Nut+10um Cis 20uM Nut+10um Cis 10uM Nut H2052 0 0 0 +++ ++ 0 MSTO-.211H + +++ + + ++ ++ + H2452 + 0 0 + 0 ++ + +

Tabela 3

4. Dyskusja

W poprzednich badaniach zidentyfikowaliśmy MDM2 jako biomarker prognostyczny u pacjentów z MPM i że ekspresja jest regulowana przez specyficzne miRNA . Nutlin-3A hamuje interakcję MDM2-TP53, a tym samym indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego, senescencję i apoptozę w zależności od typu komórki. Ponadto jest to lek niegenotoksyczny, który wykazuje niewielką toksyczność w modelach zwierzęcych i jest związany z mniejszym ryzykiem oporności niż konwencjonalne leki.

Na tym tle wysunęliśmy hipotezę, że nadekspresja MDM2, być może w połączeniu z częściową lub całkowitą utratą P14/ARF, może być ukierunkowana przez schemat terapeutyczny oparty na Nutlin-3A w celu przywrócenia aktywności TP53 w podgrupie MPM.

W tym podejściu in vitro, efekty obecnie najnowocześniejszych chemioterapeutyków cisplatyny i pemetreksedu, pojedynczo i w połączeniu, w porównaniu z Nutlin-3A, były badane w trzech liniach komórkowych obejmujących schemat występujący u pacjentów. Nutlin-3A skutecznie indukowała senescencję we wszystkich trzech liniach komórkowych MPM i była lepsza w porównaniu z cisplatyną i/lub pemetreksedem, podczas gdy apoptoza mogła być indukowana tylko przy wysokich stężeniach. Z literatury wiadomo, że efekty działania Nutlin-3A są specyficzne dla danego typu komórek, indukując raczej zatrzymanie cyklu komórkowego i senescencję niż apoptozę. W związku z tym badaliśmy cisplatynę i Nutlin-3A w połączeniu w celu zwiększenia stresu komórkowego poprzez indukowanie uszkodzeń DNA opartych na platynie. Połączenie Nutlin-3A z cisplatyną powoduje wzrost wskaźników apoptozy i senescencji w porównaniu z samą Nutlin-3A, ponieważ główną funkcją TP53 jest uszkodzenie DNA i odpowiedź na stres .

Ten sam mechanizm wydaje się być prawdziwy w przypadku połączenia Nutlin-3A i radioterapii, aby zapewnić dodatkowe uszkodzenia komórkowe i przesunąć komórkową odpowiedź TP53 w kierunku apoptozy, co już wykazano w TP53 wild-type esophageal squamous cell carcinoma in vitro i in vivo . Co ciekawe, Shimazu i wsp. stwierdzili dodatkowe działanie hamujące wzrost MPM w połączeniu Nutlin-3A z metforminą, inhibitorem mTOR, co sugeruje możliwość krzyżowego oddziaływania pomiędzy szlakiem mTOR i TP53. Autorzy potwierdzili nasze wyniki dotyczące linii komórkowych NCI-H2052 i MSTO-211H jako najlepiej reagujących na terapię Nutlin-3A, postulując wartość IC50 wynoszącą odpowiednio 0,37μM (MSTO-211H) i 0,50μM (NCI-H2052).

Jak wspomniano wcześniej, nadekspresja MDM2 może prowadzić do utraty funkcji regulacyjnej P53 poprzez zwiększoną degradację proteasomalną. Poza jego fizjologicznym inhibitorem P14/ARF, analiza zależności sygnalizacyjnych między tymi genami wskazuje na dodatkową rolę RB1 w tej sieci sygnalizacyjnej. Wykazano, że oprócz hamowania interakcji MDM2-TP53, Nutlin-3A wpływa również na interakcje MDM2-RB1, co czyni to możliwym wyjaśnieniem efektów niezależnych od TP53 opartych na Nutlin-3A. Co ciekawe, nawet linia komórkowa MSTO-211H o niskiej ekspresji MDM2, jak również linia komórkowa NCI-H2452 negatywna pod względem MDM2 i TP53 wykazuje zmniejszoną, ale wyraźnie wykrywalną, indukcję apoptozy przez Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną. Również komórki immunohistochemicznie negatywne mają, jak opisano wcześniej, wykrywalny wzór ekspresji genu MDM2, co skutkuje stężeniem białka MDM2 poniżej granicy wykrywalności IHC. Postawiliśmy hipotezę, że skoro regulacja MDM2 napędzana przez TP53 jest istotnym mediatorem apoptozy i stanu komórek w sytuacji fizjologicznej, również hamowanie interakcji TP53-MDM2 przy tak niskich poziomach MDM2 będzie miało korzystny wpływ na cytotoksyczność związków platyny, tłumacząc występujące efekty uboczne terapii Nutlin-3A. Dla NCI-H2452, linii komórkowej z nieobecną ekspresją TP53, obserwowany efekt musi być niezależny od TP53 i jest najprawdopodobniej oparty na działaniu hamującym RB1.

Obecnie Nutlin-3A jest podawany per os jako substancja R05045337 w wieloośrodkowym badaniu klinicznym fazy I w terapii nowotworów hematologicznych. Ponadto RG7112, pochodna Nutlin-3A, weszła do badań klinicznych I fazy u pacjentów z tłuszczakomięsakami, które są guzami typu dzikiego TP53 z amplifikacją MDM2. W tym badaniu klinicznym RG7112 był podawany per os u 20 pacjentów w warunkach neoadjuwantowych. Jeden pacjent wykazał częściową remisję, a 14 wykazało stabilność choroby, ale wszyscy pacjenci cierpieli z powodu działań niepożądanych, takich jak neutropenia. Możliwym wyjaśnieniem może być wysoka dawka leku wynosząca 1440 mg m-2 dziennie-1 per os. W poprzednich badaniach in vivo, doustne podawanie Nutlin-3A wykazało kilka ograniczeń, takich jak wysokie ilości wejściowe Nutlin-3A (200-400 mg/Kg) i trudności w podawaniu tych wysokich dawek. Warto zauważyć, że opracowano skuteczne systemy dostarczania z wykorzystaniem polimerów takich jak poli(laktyd-co-glikolid) (PLGA) i przeciwciał monoklonalnych .

5. Wnioski

W tym badaniu in vitro, nasza hipoteza, że MDM2-overexpressing MPM może być ukierunkowany przez chemioterapię opartą na Nutlin-3A została udowodniona. W szczególności, dla optymalnego ustawienia biomarkera MDM2-overekspresji i niskiej/nieobecnej ekspresji P14/ARF, zaobserwowano lepsze wskaźniki apoptozy i senescencji w porównaniu do konwencjonalnych chemioterapeutyków. Nawet w przypadku mniej optymalnego ustawienia biomarkerów z minimalną ekspresją MDM2, korzystna indukcja apoptozy i senescencji była oczywista dla Nutlin-3A w połączeniu z cisplatyną w porównaniu z konwencjonalnym schematem leczenia. Dlatego też terapia oparta na Nutlin-3A może być bardzo wartościowa dla podgrupy pacjentów z MPM.

Dostępność danych

Dane wykorzystane do poparcia wyników tego badania są dostępne na życzenie od autora.

Ujawnienie

Wyniki niniejszego badania zostały przedstawione na German Cancer Consortium (DKTK), 1st Essen Translational Oncology Symposium (ETOS) (Essen, 2018) oraz na 33. German Cancer Congress (Berlin 2018).

Konflikt interesów

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Podziękowania

Badanie zostało sfinansowane przez Institute of Pathology, University Hospital Essen oraz Ruhrlandklinik Essen.

.