Int J Biol Sci 2008; 4(6):338-344. doi:10.7150/ijbs.4.338
Review
Celina Janion
Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa, Polska
Janion C. Inducible SOS Response System of DNA Repair and Mutagenesis in Escherichia coli. Int J Biol Sci 2008; 4(6):338-344. doi:10.7150/ijbs.4.338. Available from https://www.ijbs.com/v04p0338.htm
Chromosomalny DNA jest narażony na ciągłe uszkodzenia i naprawy. Komórki zawierają szereg białek i specyficznych systemów naprawy DNA, które pomagają w utrzymaniu jego prawidłowej struktury. Odpowiedź SOS była pierwszym systemem naprawy DNA opisanym u Escherichia coli, indukowanym po potraktowaniu bakterii czynnikami uszkadzającymi DNA, zatrzymującym replikację DNA i podziały komórkowe. W indukcję odpowiedzi SOS zaangażowanych jest ponad czterdzieści niezależnych genów SOS, z których większość koduje białka zaangażowane w ochronę, naprawę, replikację, mutagenezę i metabolizm DNA. W normalnych warunkach wzrostu geny SOS ulegają ekspresji na poziomie podstawowym, który wyraźnie wzrasta po indukcji odpowiedzi SOS. Odpowiedź SOS została odkryta u wielu gatunków bakterii (np. Salmonella typhimurium, Caulobacter crescentus, Mycobacterium tuberculosis), ale nie w komórkach eukariotycznych. Jednakże gatunki ze wszystkich królestw zawierają pewne białka podobne do SOS, biorące udział w naprawie DNA, które wykazują homologię aminokwasową i aktywność enzymatyczną podobną do tych występujących u E. coli, ale nie są zorganizowane w system SOS. W pracy przedstawiono krótki aktualny przegląd opisujący odkrycie systemu SOS, fizjologię indukcji SOS, metody jego oznaczania oraz rolę niektórych genów indukowanych przez SOS.
Keywords: SOS response, DNA repair, DNA mutations, error-prone repair, mutagenic DNA polymerases
Historical Overview
Po uznaniu, że geny składają się z DNA (Oswald T. Avery, 1940), przeprowadzono liczne eksperymenty mające na celu zbadanie chemicznych właściwości DNA, głównie poprzez traktowanie bakterii i bakteriofagów różnymi czynnikami i substancjami chemicznymi, takimi jak promieniowanie UV, mitomycyna C (MC), itp. W konsekwencji uzyskano rosnącą listę mutantów bakteryjnych wykazujących nowe i niezwykłe właściwości, a ich właściwości zostały następnie określone.
Hipoteza odpowiedzi SOS została opracowana na podstawie następujących danych: (i) Obserwacja Jean Weigle w l953 roku, że reaktywacja napromieniowanego UV faga λ znacznie wzrosła, gdy napromieniowane fagi zostały wyplantowane na wcześniej napromieniowane komórki gospodarza E. coli. Zjawisko to zostało później nazwane reaktywacją W lub reaktywacją Weigle’a ; (ii) indukcja profaga λ i lizy bakterii (transformacja z rozwoju lizogenicznego do litycznego), gdy lizogeny bakterii E. coli były napromieniowane UV , oraz (iii) obserwacja nitkowatego wzrostu komórek E. coli B w odpowiedzi na napromieniowanie UV, sugerująca związek między zatrzymaniem podziału komórkowego, mechanizmami indukcji profaga λ i mutacją indukowaną UV. . Dane te doprowadziły Miroslava Radmana do wniosku, że u E. coli istnieje system naprawy DNA zależny od białek LexA i RecA, który jest indukowany, gdy DNA jest poważnie uszkodzony i jego synteza zatrzymana, a indukcja tego systemu wiąże się z indukcją mutacji. Radman nazwał go „SOS repair” i „SOS replication” od międzynarodowego telegraficznego (lub optycznego) sygnału alarmowego „SOS” w alfabecie Morse’a (trzy kropki, trzy kreski, trzy kropki).
Hipoteza SOS Miroslava Radmana została początkowo wysunięta w niepublikowanym liście rozesłanym do wielu badaczy w l970 roku, który następnie został opublikowany dopiero w 1974 roku. Evelyn Witkin wysunęła wcześniej hipotezę, że tworzenie filamentów i indukcja profagów w napromieniowanych komórkach E. coli B może mieć powiązany mechanizm. Oryginalny list Radmana i wczesna praca Witkina, uważane za podstawę odkrycia zjawiska odpowiedzi SOS, zostały ostatnio przedrukowane w pracy Bryna A. Bridgesa. Dalsze prace wzdłuż tej linii potwierdziły i rozwinęły tę hipotezę. Systemy przypominające pod pewnymi względami odpowiedź SOS opisaną u E. coli zostały później uznane za działające również w komórkach eukariotycznych, ale odpowiedzi bakteryjne i eukariotyczne są w rzeczywistości zasadniczo różne .
Mechanizm indukcji SOS: Role of RecA* Coprotease and LexA Repressor Protein
Geny recA i lexA były pierwszymi, które zostały uznane za zaangażowane w indukcję SOS. Mutacje w tych genach sprawiają, że komórki są bardzo wrażliwe na promieniowanie UV. Białka 27 kDa LexA i 36 kDa RecA były wcześniej znane jako białka rekombinacyjne działające w życiu płciowym i wymianie genetycznej bakterii. Obecnie wiadomo, że białko RecA uczestniczy również w genetycznej wymianie DNA, w recF, recO, recR, recN i ruvABC-zależnej rekombinacyjnej naprawie DNA oraz, wraz z białkiem LexA, odgrywa główną rolę w regulacji odpowiedzi SOS. Down- i up-regulacja genów indukowanych SOS jest w zasadzie współdziałaniem dwóch białek, represora LexA i RecA*, gdzie LexA jest białkiem represorowym transkrypcji, a RecA* jest koproteazą wspomagającą autokatalityczne samounicestwienie LexA .
Agentami zdolnymi do indukowania systemu odpowiedzi SOS są np, promieniowanie UV, MC, metanosulfonian metylu (MMS) i wiele innych substancji chemicznych, które zaburzają DNA, zatrzymują syntezę DNA i podziały komórkowe, a także prowadzą do akumulacji jednoniciowego (ss) DNA. Poziom białka RecA w komórkach bakteryjnych (podobnie jak helikazy II UvrD) jest bardzo wysoki. Białko RecA ma silną tendencję do tworzenia filamentów nukleoproteinowych na ssDNA, a znacznie słabszą na uszkodzonym, dwuniciowym (ds) DNA. Prawdopodobnie chroni to DNA przed zniszczeniem i jest wymagane dla każdego aspektu aktywności RecA. Montaż RecA na ssDNA przebiega w kierunku 5′-3′ w stosunku 1 cząsteczka RecA na 3 zasady DNA i wymaga dATP lub ATP, ale nie aktywności ATP-azy. Z kolei demontaż wymaga hydrolizy ATP do ADP i przebiega znacznie wolniej niż montaż. RecA zmontowany na ssDNA uzyskuje aktywność koproteazową, RecA*, która ułatwia samorozpad białka LexA, powodując derepresję genów regulowanych przez SOS. Białko LexA ma słabą aktywność autoklektazową, ale jego rozszczepienie i derepresja genów SOS zachodzi tylko w obecności koproteazy RecA*.
Każdy z genów SOS indukowanych uszkodzeniem (din) lub sos ma w pobliżu swojego promotora/miejsca operacyjnego specyficzną 20-nukleotydową „SOS-box” (zwaną również, LexA-box), z którą związane jest białko represorowe LexA, zapobiegające wiązaniu polimerazy RNA i ekspresji genu. SOS-box ma palindromiczną strukturę sugerującą, że represor LexA wiąże się jako dimer, co zostało później potwierdzone. Rola koproteazy RecA* w komórkach indukowanych SOS jest zatem następująca: 1. pomoc w rozszczepieniu białka LexA (202 aminokwasy) w miejscu Ala84-Gly85, co powoduje derepresję genów SOS; 2. 2. rozszczepienie represora CI faga λ lambda, co powoduje przekształcenie faga z formy lizogenicznej w lityczną; 3. przetworzenie UmuD → UmuD’ poprzez sknicowanie UmuD w miejscu Cys24-Gly25, co jest warunkiem wstępnym do utworzenia indukowanej SOS mutagennej polimerazy DNA V (Pol V) składającej się z UmuD’2C. Etapem ograniczaj±cym tempo syntezy Pol V jest przetwarzanie UmuD→ UmuD’, które zachodzi znacznie wolniej niż samorozwi±zanie LexA. Rol± Pol V w mutagenezie jest synteza translecji (TLS) w poprzek uszkodzeń w szablonowym DNA, umożliwiaj±ca replikację DNA, często kosztem wierno¶ci prowadz±cej do mutacji. Wszystkie te białka, represor CI faga λ i represor LexA, UmuD, białka PolB/DinA (Pol II) i DinB (Pol IV) są homologiczne w obrębie ich domen karboksy-końcowych i wszystkie są kodowane przez geny din (sos) regulowane w odpowiedzi SOS.
Indukcja odpowiedzi SOS postępuje do 45-60 min po traktowaniu bakterii czynnikami indukującymi SOS, a następnie gwałtownie ustaje. W tym czasie większość zmian uległa naprawie. Czas derepresji poszczególnych genów din zależy od siły wiązania represora LexA z SOS-box oraz od łatwości, z jaką represor LexA odłącza się od danego SOS-box.
3.1. Odpowiedź SOS była badana wcześniej poprzez testowanie wzrostu ekspresji genów din albo z naturalnych genów, albo przy użyciu konstrukcji genu reporterowego, np. fuzji putatywnego promotora din z pozbawionym promotora genem lacZ kodującym β-galaktozydazę. Graham Walker i współpracownicy jako pierwsi zastosowali do tego zadania defektywnego faga Mu1d(Ap,lacZ) skonstruowanego przez Casadabana i Cohena, który łatwo wstawia się losowo do chromosomu E. coli K12 i tworzy mutację. Fag ten posiada pozbawiony promotora gen lacZ, tak że β-galaktozydaza nie ulega ekspresji. Jednakże, gdy fag Mu jest przypadkowo zintegrowany pod promotorem genu din, tworząc funkcjonalny operon din::Mu-1d(Ap,lacZ), β-galaktozydaza jest syntetyzowana w odpowiedzi na uszkodzenia DNA.
Ponieważ hydroliza substratu β-galaktozydazy (o-nitrofenylo-β-galaktozyd) tworzy żółte kolonie, te noszące fuzję din::Mu-lacZ są łatwo wyselekcjonowane na płytkach agarowych; dokładny poziom β-galaktozydazy wyrażonej w odpowiedzi na uszkodzenie DNA może być następnie dokładnie zmierzony w płynnym podłożu (patrz Rys.1 dla szczegółów). W ten sposób wykryto ponad dziesięć nowych din-genów, a większość z nich następnie zidentyfikowano.
Kinetyka indukcji β-galaktozydazy w szczepach fuzyjnych din::lacZ przez mitomycynę C (MC) . Fuzje din::lac zostały wytworzone przez insercję bakteriofaga Mu d1(Ap, lac) do chromosomu E. coli. Pochodna λ::Mu d1(Ap lac) została wygenerowana przez insercję Mu d1(Ap lac) w faga λ do chromosomu E. coli. Symbole: o, szczep fuzyjny nie poddany obróbce; ●, szczepy fuzyjne plus MC; lexA(Ind-) pochodne szczepu fuzyjnego plus MC; ■, recA (Def) pochodne szczepu fuzyjnego plus MC; ▼, pochodna zawierająca pKM280 szczepu λ:: Mu d1(Ap lac) szczepu plus MC. Przedrukowano z za zgodą autora. Dwa z genów, dinA i dinB zostały następnie zidentyfikowane jako polB (Pol II) i Pol IV, odpowiednio .
(Kliknij na obraz, aby powiększyć.)
Ostatnio opracowano nową metodę pomiaru ekspresji genów SOS i aktywności promotorowej genów SOS (np, recA, lexA, umuDC) przy użyciu plazmidu zawierającego promotor SOS, który ma być badany, połączony z genem reporterowym gfp kodującym białko zielonej fluorescencji (GFP). Pozwala to na pomiar aktywności promotora genów SOS w pojedynczej komórce bakteryjnej, jak również lokalizację i czas trwania indukcji SOS. Okazuje się, że indukcja genów SOS nie przebiega jako pojedyncze wydarzenie, ale następuje w kilku powtarzalnych krokach, których modulacja zależy od dawki indukującej SOS, poziomu uszkodzeń w DNA oraz akumulacji białka UmuD’. Metoda ta otwiera nową drogę do pomiaru dynamiki odpowiedzi SOS.
3.2. Poprzez poszukiwanie pól SOS: Wyznaczanie indeksu heterologii (HI)
Postęp w sekwencjonowaniu DNA i znajomość charakterystycznych elementów sekwencji genów SOS umożliwiły bezpośrednie, obliczeniowe poszukiwania genów indukowalnych przez SOS. Po zsekwencjonowaniu 33% chromosomalnego DNA E. coli, Lewis i wsp. zlokalizowali za pomocą analizy sekwencji i ilościowych eksperymentów wiązania DNA sześć nowych genów potencjalnie regulowanych przez LexA i nazwali je sosA-F . Dla dwóch z nich, sosC i sosD, autorzy potwierdzili doświadczalnie, że silnie wiązały one oczyszczony represor LexA.
Po określeniu sekwencji DNA całego chromosomu E. coli K12 Fernandez de Henestrosa i wsp. zlokalizowali, poprzez poszukiwanie potencjalnych SOS-box związanych z otwartymi ramkami odczytu, 69 potencjalnych SOS-box o wartości HI ≤ 15, w tym wszystkie dotychczas poznane i siedem nowych. Nowe geny były następnie analizowane pod względem ich zdolności do ekspresji po traktowaniu MC, długości ekspresjonowanego mRNA oraz wartości HI (Rys. 2). Analizy przeprowadzono na trzech izogenicznych szczepach E. coli różniących się allelem lexA: lexA+(wild type) indukowanym SOS, nieindukowanym SOS lexA3(Ind-) oraz konstytutywnie ekspresyjnym allelem lexA51(Def). Potencjalne funkcje nowych i starych genów zostały dalej scharakteryzowane i przedyskutowane. Wyniki potwierdziły, że każdy z nowych genów zawierających SOS box był rzeczywiście genem zależnym od LexA, a jego ekspresja była indukowana przez MC tylko w szczepie lexA+; w pozostałych przypadkach nie ulegały one ekspresji (lexA3), lub ulegały pełnej ekspresji (lexA51), niezależnie od tego, czy bakterie były traktowane MC, czy nie (szczegóły patrz Rys. 2).
Z sekwencji nukleotydowej genu ydjQ (alternatywne nazwy b1741 sosD) wywnioskowano, że koduje on białko o długości 295 aminokwasów, które ma znaczną homologię z N-końcową połową białka UvrC. Wiadomo, że ekscyna UvrABC (składająca się z białek UvrA, UvrB i UvrC) jest zaangażowana w naprawę ekscytonu nukleotydów (NER), która usuwa nieporęczne addukty lub zmiany wpływające na strukturę (np. dimery pirymidynowe, fotoprodukty pirymidynowe (6-4) i miejsca abazowe) ze zmodyfikowanego DNA. Wiadomo było również, że część N UvrC nacina ssDNA początkowo po 3′ stronie zmiany, a następnie część C UvrC nacina DNA po 5′ stronie zmiany. Ostatnio Moolenaar i wsp. zmienili nazwę białka YdjQ na Cho (po homologu UvrC) i zbadali jego aktywność enzymatyczną. Potwierdzili oni, że białko Cho nacina kompleksy UvrB-DNA tylko po 3′- stronie zmiany, jednak niektóre zmiany w DNA, które były bardzo słabo nacinane przez białko UvrC, były bardzo wydajnie nacinane przez białko Cho. Tak więc, białko Cho znacznie zwiększa zakres substratów w naprawie DNA przez system NER. Geny uvrA, uvrB, i ydjQ (ale nie uvrC) są genami indukowanymi przez SOS.
Analiza północna genów E. coli, które wydają się być regulowane przez LexA. RNA ekstrahowano z trzech izogenicznych szczepów, które różniły się genem LexA: RW118 (lexA+), RW434 (lexA), i RW542 (lexA51). RNA uzyskano z komórek nieuszkodzonych (-) oraz z komórek poddanych ekspozycji na mitomycynę C (5 µg ml-1) (+) przez 30 min przed ekstrakcją. Wcześniej zidentyfikowane geny recA i umuDC regulowane przez LexA zostały użyte jako kontrole pozytywne. Geny przedstawiono zgodnie z ich rosnącym indeksem heterologii (HI). Rozmiary transkryptu mRNA i możliwe funkcje genów są również wskazane Patrz ref. w celu uzyskania dalszych szczegółów. (Dzięki uprzejmości Blackwell Science).
(Kliknij na obraz, aby powiększyć.)
3.3. Lokalizacja genów din za pomocą technik mikromacierzowych
Technika mikromacierzowa pozwala na monitorowanie dużej liczby genów w jednym eksperymencie. Courcelle i wsp., wykorzystali mikromacierze zawierające amplifikowane fragmenty chromosomalnego DNA E coli z otwartymi ramkami odczytu z 4101 genów (95,5% ogółu) do pomiaru ekspresji wszystkich genów w szczepach napromieniowanych UV oraz nienapromieniowanych SOS indukowanym (lexA+) i nieindukowanym lexA1(Ind-). W szczepie napromieniowanym UV lexA+ autorzy zidentyfikowali 17 nowych genów zależnych od LexA, indukowanych przez SOS, oprócz 26 znanych wcześniej; zatem całkowita liczba genów indukowanych przez SOS u E. coli wynosi prawdopodobnie 43. W tej samej publikacji autorzy ustalili, że gen ssb, kodujący białko wiążące ssDNA, nie jest indukowany przez SOS, jak wcześniej sądzono. Zaobserwowali również szereg genów, których ekspresja wzrastała (zwykle nie więcej niż dwukrotnie) w komórkach napromieniowanych UV, ale które nie były regulowane przez białko LexA. Zauważyli, że transkrypty białek wielu genów nieregulowanych przez LexA były zredukowane po napromieniowaniu UV i doszli do wniosku, że transkrypty te zostały prawdopodobnie uszkodzone lub zdegradowane przez UV. Zidentyfikowali również trzydzieści genów posiadających potencjalne struktury podobne do SOS box, ale które nie były regulowane przez LexA.
Mechanizm i specyficzność wiązania represora LexA do SOS Boxes
Uważa się, że sekwencje wszystkich potencjalnych SOS boxów w chromosomie E. coli zostały zidentyfikowane. Niektóre przykłady pól SOS, które wiążą (A) lub nie wiążą (B i C) represora LexA, wraz z wartościami HI i liczbą niedopasowań (NM) są pokazane w Tabeli 1. NM oznacza liczbę pozycji w polach SOS odbiegaj±cych od idealnego palindromu. Zarówno liczba, jak i wzór niedopasowań mogą mieć kluczowe znaczenie dla specyficzności wiązania białka LexA do poszczególnych pól SOS. Wydaje się, że ta hipoteza jest dobrym wyjaśnieniem specyficzności i różnej siły wiązania białka LexA do sekwencji pól SOS. Należy to jednak potwierdzić.
Można zauważyć, że generalnie, gdy SOS-boxy mają niskie wartości HI, pomiędzy 2,7 a 12, mogą wiązać represor LexA (Tabela 1A); a gdy HI jest powyżej 16,4 (Tabela 1B) najwyraźniej nie są w stanie wiązać represora LexA. Jednak w niektórych przypadkach (pokazanych w części C), takich jak geny yigN (alternatywna nazwa sosB) i dinJ (sosA), pola SOS nie wiążą represora LexA pomimo ich umiarkowanych wartości HI (odpowiednio 9,27 i 7,06) .
Potencjalne pola SOS genów, które wiążą lub nie wiążą represora LexA.
Gen | Sekwencja pola SOS | HI* | NM** |
---|---|---|---|
Consensus | TACTGTATATATATACAGTA | 0 | |
A. Geny, których pola SOS wiążą LexA i są regulowane przez represor LexA | |||
recA | TACTGTATGAGCATACAGTA | 4.31 | 1 |
umuDC | TACTGTATATAAAACAGTA | 2.77 | 2 |
uvrB | AACTGTTTATCCAGTA | 6.11 | 5 |
polB | GACTGTATAAAACCACAGCC | 12.09 | 5 |
lexA1 | TGCTATATACTCACAGCA | 6.34 | 4 |
lexA2 | AACTGTATATACACCCAGGG | 8.32 | 6 |
B. Geny, których potencjalne pola SOS nie wiążą LexA, ale nie są regulowane przez LexA | |||
intE | GGCTGCTGAAAAATACAGAA | 16.04 | 7 |
ymfI | TTCTGTACCAGAAACAGTT | 15.48 | 8 |
ymfM | AGCTGCAGGAGCATGCAGCA | 19.32 | 3 |
lit | TGATGACAGAGTGTCCAGTG | 20.32 | 8 |
C. Geny, których pola SOS nie wiążą LexA w spanie o niskiej wartości HI | |||
yigN | AACTGGACGTTGTACAGCA | 9.27 | 5 |
dinJ | AGCTGAATAAATACAGCA | 7.06 | 3 |
Potencjalne pola SOS (sekwencja na nici kodującej), które wiążą (A), lub nie wiążą (B i C) represora LexA.
HI* oznacza indeks heterologii; NM** oznacza liczbę niedopasowań w polach SOS odbiegających od idealnego palindromu. Brak wiązania represora LexA pomimo stosunkowo niskiej wartości HI (sekcja C) świadczy o tym, że nie ma między nimi bezpośredniej korelacji. W każdym razie wskazuje to, że wartość HI nie może być jedynym wskaźnikiem zdolności pola SOS do wiązania LexA. Liczba niedopasowań w palindromicznych polach SOS w każdym z odcinków jest podobna, a zatem nie determinuje zdolności wiązania LexA z polami SOS. Dane w częściach A i C pochodzą z ref. , those in part B are from ref. .
Characteristics of Some SOS-Induced Genes
Geny odpowiedzi SOS występują rozproszone w całym chromosomie E. coli jako pojedyncze geny zlokalizowane w pojedynczych operonach. Sześć z nich, umuDC (źródło Pol V), ruvAB (katalizujący migrację gałęzi w strukturach Hollidaya) i ysdAB (o nieznanej funkcji) jest kodowanych przez pary genów tworzących operon. Generalnie, w jednym operonie występuje tylko jeden SOS-box. Wyjątkiem są geny lexA i ydjM (b1728), które zawierają po dwa pola SOS (oddzielone odpowiednio o jedną i dwie zasady) oraz recN zawierający trzy pola SOS. Sekwencje pól SOS w jednym genie są różne . W przypadku ydjM dwa dimeryczne represory LexA wi±ż± się kooperatywnie do każdego pola SOS i, jak się ocenia, oba s± funkcjonalne. Sekwencje SOS-boxów w jednym genie różnią się o 2 do 4 zasad. Jak i dlaczego powstają dodatkowe SOS-boxy w genach i jak wpływają one na potencjał ekspresji genów to pytania, które pozostają do odpowiedzi.
The Time Required for Derepression of SOS-Induced Genes
Skala czasowa derepresji genów i syntezy białek indukowanych przez SOS jest różna dla poszczególnych genów. Do najszybciej derepresjonowanych genów (<1 min po indukcji SOS) należą: lexA kodujący białko represorowe LexA (szybko degradowane w komórkach indukowanych SOS), uvrAB, cho i uvrD zaangażowane w naprawę NER, ruvAB biorący udział w rekombinacyjnej naprawie DNA, polB i dinB kodujące odpowiednio Pol II i Pol IV oraz dinI, którego produkt hamuje przetwarzanie UmuD do UmuD’. Białko UmuD’ jest niezbędne do syntezy mutagennego Pol V (UmuD’2C). Dlatego białko DinI opóźnia syntezę Pol V. Ekspresja genów recA i recN, kodujących białka rekombinacji i naprawy rekombinacyjnej, zachodzi 5 min po indukcji SOS, natomiast ekspresja sulA (stara nazwa sfiA) i umuDC następuje w ostatnim etapie indukcji SOS. Białko sulA jest inhibitorem podziałów komórkowych powodującym filamentowy wzrost komórek i wydłużającym czas, w którym komórkowe DNA może być naprawione.
Copy Numbers of din Genes Encoding Proteins
RecA i UvrD należą do najobficiej syntetyzowanych białek. Ich liczba na poziomie konstytutywnym wynosi, odpowiednio, około 10 000 i 8 000 kopii na komórkę i wzrasta 10-krotnie po indukcji SOS. Białko RecA wi±że się z ssDNA i prawdopodobnie chroni je przed niekontrolowanym zniszczeniem. UvrD, helikaza DNA II, uczestniczy w zależnej od tamy naprawie niedopasowania (MMR), a także bierze udział w naprawie zależnej od UvrABC i Cho (NER), wypierając zawierający uszkodzenia ssDNA z naprawianej nici DNA. Liczby cząsteczek białek syntetyzowanych w komórkach nieindukowanych vs. indukowanych SOS są następujące: 20:250 dla UvrA; 250:1000 dla UvrB; 40:300 dla DNA Pol II, oraz 250:2500 dla DNA Pol IV (11, 34). Białko UmuD ulega ekspresji, w ilości 180 cząsteczek na komórkę nie indukowaną i w ilości 2400 cząsteczek na komórkę pozbawioną funkcjonalnego represora LexA; w komórce indukowanej SOS jest 200 cząsteczek UmuC, a w komórce nie indukowanej nie ma Pol V (< 15 cząsteczek).
Mutagenne polimerazy DNA indukowane SOS
W E. coli, oprócz konstytutywnie syntetyzowanej replikującej DNA Pol III istnieją trzy potencjalnie mutagenne polimerazy DNA, których synteza jest zwiększona (Pol II i Pol IV) lub występuje tylko w komórkach indukowanych SOS (Pol V). Wśród nich Pol II jest jedyną polimerazą DNA posiadającą aktywność korekty egzonukleazy 3′-5′ i jest najmniej podatna na błędy; jej rola obejmuje również odzyskiwanie zdegradowanego DNA w widełkach replikacyjnych. Zarówno pol II, jak i pol IV pojawiają się we wczesnych etapach indukcji SOS, a pol V w jej końcowej fazie. Pol V jest najbardziej podatnym na błędy enzymem i najważniejszym dla mutagenności komórek indukowanych SOS.
W E. coli defektywnej w umuD(C) prawie żadne mutacje nie są indukowane po napromieniowaniu UV, a mutacje indukowane przez traktowanie MMS są znacznie zredukowane. Głównymi zmianami mutagennymi powstającymi w DNA po napromieniowaniu UV są dimery cyklobutanowe TT-cis-syn oraz fotoprodukty CT lub TT (6-4), natomiast po traktowaniu MMS stwierdza się dominację 3-metyladeniny (3meA), miejsc apurynowych oraz 1meA i 3meC (w komórkach mutantów alkB). Zarówno UV jak i MMS, podobnie jak wiele innych mutagenów, są induktorami SOS i stąd, mimo że uszkodzenia uszkadzające są różne, sygnał indukujący SOS musi być wspólny; ogólnie przyjmuje się, że sygnałami indukującymi SOS są filamenty RecA/ssDNA powstające na gromadzącym się ssDNA w komórkach, gdy synteza DNA jest zatrzymana. Niektóre z przedmutagennych zmian wymagają mutagennych polimeraz DNA, aby doprowadzić do mutacji, podczas gdy inne nie. Jednak to, która indukowana przez SOS, mutagenna polimeraza DNA jest wymagana, zależy od rodzaju zmiany.
Podsumowanie
Hipoteza odpowiedzi SOS była zdumiewająca, owocna i inspirująca. Zebraliśmy wiele informacji dotyczących metabolizmu DNA, ekspresji genów indukowanych przez SOS i ich funkcji. Mimo to, wciąż pojawiają się nowe pomysły.
Podziękowania
Jestem ogromnie wdzięczny profesorowi Grahamowi C.Walkerowi, Rogerowi Woodgate’owi i wydawnictwu Blackwell Science za zgodę na przedruk.
Konflikt interesów
Autor oświadczył, że nie istnieje żaden konflikt interesów.
1. Weigle JJ. Induction of mutation in a bacterial virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1953;39(7):628-636
2. Radman M. Fenomenologia indukowalnej mutagennej ścieżki naprawy DNA u Escherichia coli: hipoteza naprawy SOS. In: (red.) Sherman S, Miller M, Lawrence C, Tabor WH. Molekularne i środowiskowe aspekty mutagenezy. Springfield IL: Charles C Thomas publisher. 1974:128-142
3. Borek E, Ryan A. The transfer of irradiation-elicited induction in a lysogenic organism. Proc Natl Acad Sci U S A. 1958;44(5):374-347
4. Hertman I, Luria SE. Transduction studies on the role of a rec+ gene in the ultraviolet induction of prophage lambda. J Mol Biol. 1967;23(2):117-133
5. Defais M, Fauquet P, Radman M, Errera M. Ultrafioletowa reaktywacja i ultrafioletowa mutageneza lambda w różnych systemach genetycznych. Virology. 1971;43(2):495-503
6. Craig R. Function of nucleoside triphosphate and polynucleotide in Escherichia coli recA protein-directed cleavage of phage lambda repressor. J Biol Chem. 1981;256(15):8039-8044
7. Witkin EM. Ultraviolet-induced mutation and DNA repair. Annu Rev Microbiol. 1969;23:487-514
8. Bridges BA. Error-prone DNA repair and translesion DNA synthesis II: The inducible SOS hypothesis. DNA Repair (Amst). 2005;4(6):725-739
9. Eller MS, Asarch A, Gilchrest BA. Photoprotection in human skin-A multifaceted SOS response. Phtochem & Photobiol. 2008;84:339-349
10. Clark AJ, Margulies AD. Isolation and characterization of recombination-deficient mutants of Escherichia coli K12. Proc Natl Acad Sci U S A. 1965;53:451-459
11. Kuzminov A. Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda. Microbiol Mol Biol Rev. 1999;63(4):751-813
12. Horii T, Ogawa T, Nakatani T, Hase T, Matsubara H, Ogawa H. Regulation of SOS functions: purification of E. coli LexA protein and determination of its specific site cleaved by the RecA protein. Cell. 1981;27(3 Pt 2):515-522
13. Little JW, Mount DW. The SOS regulatory system of Escherichia coli. Cell. 1982;29(1):11-22
14. Walker GC. Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli. Microbiol Rev. 1984;48(1):60-93
15. Arenson TA, Tsodikov OV, Cox MM. Quantitative analysis of the kinetics of end-dependent disassembly of RecA filaments from ssDNA. J Mol Biol. 1999;288(3):391-401
16. Schlacher K, Pham P, Cox MM, Goodman MF. Roles of DNA polymerase V and RecA protein in SOS damage-induced mutation. Chem Rev. 2006;106(2):406-419
17. Lewis LK, Harlow GR, Gregg-Jolly LA, Mount DW. Identification of high affinity binding sites for LexA which define new DNA damage-inducible genes in Escherichia coli. J Mol Biol. 1994;241(4):507-523
18. Thliveris AT, Little JW, Mount DW. Repression of the E coli recA gene requires at least two LexA protein monomers. Biochimie. 1991;73(4):449-456
19. Burckhardt SE, Woodgate R, Scheuermann RH, Echols H. UmuD mutagenesis protein of Escherichia coli: overproduction, purification, and cleavage by RecA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85(6):1811-1815
20. Shinagawa H, Iwasaki H, Kato T, Nakata A. RecA protein-dependent cleavage of UmuD protein and SOS mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 1988;85(6):1806-1810
21. Tang M, Shen X, Frank EG, O’Donnell M, Woodgate R, Goodman MF. UmuD'(2)C is an error-prone DNA polymerase, Escherichia coli pol V. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999;96(16):8919-8924
22. Kenyon CJ, Walker GC. DNA-damaging agents stimulate gene expression at specific loci in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980;77(5):2819-2823
23. Casadaban MJ, Cohen SN. Lactose genes fused to exogenous promotors in one step using a Mu-lac bacteriophage: in vivo probe for transcriptional control sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(9):4530-4533
24. Bonner CA, Hays S, McEntee K, Goodman MF. DNA Polymerase II is encoded by the DNA damage-inducible dinA gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 1990;87:7663-7667
25. Wagner J, Gruz P, Kim SR, Yamada M, Matsui K, Fuchs RPP, Nohmi T. The dinB gene encodes a novel E. coli DNA polymerase, DNA pol IV, involved in mutagenesis. Mol Cell. 1999;4(2):281-286
26. Friedman N, Vardi S, Ronen S, Alin M, Stavans J. Precise temporal modulation in the response of the SOS DNA repair network in individual bacteria. PLoS Biol. 2005;3(7):e238
27. Krishna S, Maslov S, Sneppen K. UV-induced mutagenesis in Escherichia coli SOS response: a quantitative model. PLoS Comput Biol. 2007;3(3):e41
28. Fernandez de Henestrosa AR, Ogi T, Aoyagi S, Chafin D, Hayes JJ, Ohmori H, Woodgate R. Identification of additional genes belonging to the LexA regulon in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2000;35(6):1560-1572
29. Selby CP, Sancar A. Mechanisms of transcription-repair coupling and mutation frequency decline. Microbiol Rev. 1994;58(3):317-29
30. Moolenaar GF, van Rossum-Fikkert S, van Kesteren M, Goosen N. Cho, a second endonuclease involved in Escherichia coli nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(3):1467-1472
31. Courcelle J, Khodursky A, Peter B, Brown PO, Hanawalt PC. Comparative gene expression profiles following UV exposure in wild-type and SOS-deficient Escherichia coli. Genetics. 2001;158(1):41-64
32. Yasuda T, Morimatsu K, Horii T, Nagata T, Ohmori H. Inhibition of Escherichia coli RecA coprotease by Din I. EMBO J. 1998;17(11):3207-3216
33. Cooper DL, Lahue R.S, Modrich P. Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination, and cancer biology. Annu Rev Biochem. 1996;65:101-133
34. Kim S.-R, Matsui K, Yamada M, Gruz P, Nohmi T. Roles of chromosomal din genes encoding DNA pol IV in targeted and untargeted mutagenesis in Escherichia coli. Mol Cell. 1999;4(2):281-286
35. Woodgate R, Ennis DG. Levels of chromosomally encoded Umu proteins and requirements for in vivo UmuD cleavage. Mol Gen Genet. 1991;229(1):10-16
36. Rangarajan S, Woodgate R, Goodman MF. A phenotype for enigmatic DNA polymerase II in replication restart in UV-irradiated Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96(16):9224-9229
37. Kato T, Shinoura Y. Isolation and characterization of mutants of Escherichia coli deficient in induction of mutations by ultraviolet light. Mol Gen Genet. 1977;156(2):121-131
38. Śledziewska-Gojska E, Janion C. Alternative pathways of methyl methanesulfonate-induced mutagenesis in Escherichia coli. Mol Gen Genet. 1989;216(1):126-31
39. Nieminuszczy J, Sikora A, Wrzesiński M, Janion C, Grzesiuk E. AlkB dioxygenase in preventing MMS-induced mutagenesis in Escherichia coli: effect of Pol V and AlkA proteins. DNA Repair (Amst). 2006;5(2):181-188
40. Napolitano R, Janel-Bintz R, Wagner J, Fuchs RP. All three SOS-inducible DNA polymerases (Pol II, Pol IV and Pol V) are involved in induced mutagenesis. EMBO J. 2000;19(22):6259-6265
41. Fuchs RP, Fujii S, Wagner J. Properties and functions of Escherichia coli: Pol IV i Pol V. Adv Protein Chem. 2004;69:229-264
42. Foster PL. Stress-induced mutagenesis in bacteria. Crit Rev Biochem Molec Biol. 2007;42:373-397
43. Iwasaki H, Nakata A, Walker GC, Shinagawa H. The Escherichia coli polB gene, which encodes DNA polymerase II, is regulated by the SOS system. J Bacteriol. 1990;172(11):6268-6273
Kontakt z autorem
.