Frontiers | Myosin Light Chain Kinase: A Potential Target for Treatment of Inflammatory Diseases | Pharmacology

W ssakach, kinaza lekkiego łańcucha miozyny (MLCK) jest kodowana przez geny mylk1 i mylk2 (Herring i in., 2006). mylk2 koduje izoformę MLCK, która ulega ekspresji wyłącznie w komórkach mięśni szkieletowych (Herring i in., 2006; Wang L. i in., 2016). Ze względu na brak danych dotyczących produktów kodujących genu mylk2, omawiamy głównie produkty genu mylk1, do których należą długołańcuchowa MLCK (220 kDa), krótkołańcuchowa MLCK (130 kDa) oraz niekatalityczne białko o karboksy-końcowym (17 kDa), telokina (Chen i in., 2013; Chen C. et al., 2014; An et al., 2015). Produkty kodujące genu mylk1 ulegają ekspresji w różnych typach komórek i tkanek, w tym w mięśniach, płytkach krwi, komórkach wydzielniczych i mózgowych (Jin et al., 2002). Liczne czynności komórkowe, takie jak skurcz, adhezja, migracja komórek i tworzenie bariery nabłonkowej zachodzą w sposób zależny lub niezależny od fosforylacji regulacyjnego łańcucha lekkiego miozyny (MLC) (Chen i in., 2013; Chen C. i in., 2014; Kim i Helfman, 2016). Nieprawidłowa ekspresja MLCK została zaobserwowana w wielu chorobach zapalnych, w tym w zapaleniu trzustki (Shi i in., 2014), chorobach układu oddechowego (Zhou i in., 2015), chorobach układu sercowo-naczyniowego (Cheng i in., 2015), nowotworach (Zhou i in., 2014) oraz nieswoistych zapaleniach jelit (IBD) (Yi i in., 2014). Omówiono udział MLCK i szlaku sygnalizacyjnego MLCK, które leżą u podstaw reprezentatywnych chorób zapalnych. Niektóre choroby, w których MLCK jest zaangażowana, wymieniono w tabeli 1.

TABELA 1

TABELA 1. Rola kinazy łańcucha lekkiego miozyny (MLCK) w wybranych chorobach.

MLCK in Respiratory Diseases, Atherosclerosis, and Pancreatitis

W zapalnych chorobach płuc, uszkodzenie integralności bariery komórek śródbłonka płuc zmienia przepuszczalność naczyń krwionośnych i często dochodzi do zalewania pęcherzyków płucnych (Mao et al., 2015). Nieprawidłowa ekspresja MLCK występuje w uszkodzeniu płuc, a inhibitor MLCK ML-7 lub delecja genu MLCK może osłabiać uszkodzenie płuc (Wang T. i in., 2016). MLCK ma podobną aktywność w astmie i w zapaleniu płuc, a zmienność genu MYLK jest silnie związana z ostrym uszkodzeniem płuc i podatnością na astmę (Wang i in., 2014, 2015; Wang T. i in., 2016).

Dysfunkcja bariery śródbłonkowej indukowana przez MLCK jest również zaangażowana w zapalenie trzustki i miażdżycę (Cheng i in., 2015; Wang i in., 2014; Wang T. i in., 2016). Ciężkie ostre zapalenie trzustki wiąże się z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Jego patogeneza nie jest do końca poznana (Zerem, 2014), ale ekspresja MLCK jest znacząco zwiększona w szczurzych modelach ostrego zapalenia trzustki (Shi i in., 2014), a podwyższenie stężenia czynnika martwicy nowotworów (TNF)-α w ciężkim ostrym zapaleniu trzustki okazało się pośredniczyć w zależnej od MLCK regulacji cytoszkieletu, prowadząc do zniszczenia funkcji bariery śródbłonkowej (Shi i in., 2014; Yu i in., 2016). Zapoczątkowanie i rozwój miażdżycy często prowadzi do postępującego uszkodzenia naczyń, któremu towarzyszy dysfunkcja śródbłonka (Phinikaridou i wsp., 2015). Udział MLCK w naturalnej historii miażdżycy został potwierdzony poprzez łagodzenie uszkodzenia naczyń i miażdżycy przez ML-7, inhibitor MLCK (Cheng i in., 2015).

MLCK in Cancer Development

Nieprawidłowa ekspresja MLCK została zaobserwowana w liniach komórkowych raka trzustki, płuc i prostaty (Tohtong i in., 2003; Nagaraj i in., 2010; Chen i in., 2011). Szybkie, dynamiczne zmiany cytoszkieletu są niezbędne do inwazji i przerzutów komórek nowotworowych. Zależna od MLCK fosforylacja cytoszkieletu miozyny II zwiększa potencjał przerzutowy komórek nowotworowych, a zależna od MLCK rearanżacja cytoszkieletu moduluje funkcje bariery śródbłonka naczyniowego związane z angiogenezą, która jest krytycznym etapem w rozwoju nowotworów (Dudek i Garcia, 2001). Z drugiej strony, potencjał przerzutowy komórek raka piersi jest zwiększony przez utratę MLCK (Kim i Helfman, 2016). Zmiany w migracji i adhezji komórek są również charakterystycznymi wczesnymi etapami zapalenia, ale istnieje niewiele doniesień na temat regulacji MLCK w migracji komórek zapalnych.

MCLK w IBD

Zapalne choroby jelit, w tym wrzodziejące zapalenie jelita grubego i choroba Leśniowskiego-Crohna, charakteryzują się przewlekłym zapaleniem przewodu pokarmowego i wiążą się ze znacznym upośledzeniem sprawności pacjentów oraz wysokimi kosztami leczenia (Rai i in., 2015). Chociaż patogeneza IBD pozostaje niejasna, istnieją dowody na to, że dysfunkcja bariery jelitowej jest głównym czynnikiem sprawczym (Hindryckx i Laukens, 2012; Pastorelli i in., 2015). Dysfunkcja połączeń ścisłych prowadzi do uszkodzenia bariery jelitowej, która umożliwia przechodzenie różnych patogenów (Jin i Blikslager, 2016). Połączenia ścisłe składają się z białek transmembranowych, takich jak okludyny i klaudyny oraz peryferyjnych białek błonowych, tj. białek zonula occludens (Van Itallie i Anderson, 2014). Połączenia ścisłe znajdują się w apikolateralnym regionie komórek śródbłonka i są związane z pierścieniem aktynozyn przezbłonowych. Indukowana przez MLCK fosforylacja aktyomiozyny perijunkcyjnej pośredniczy w utracie połączeń ścisłych, co może zapoczątkować inicjację i rozwój IBD. Ekspresja i aktywność MLCK jest zwiększona w IBD u ludzi i jest związana z histologicznymi dowodami aktywności choroby (Blair et al., 2006). Nieprawidłowe podwyższenie MLCK zaobserwowano również w doświadczalnym zapaleniu jelita grubego indukowanym przez podawanie sodowego siarczanu dekstranu przez zgłębnik lub wewnątrzkolonijne podawanie kwasu trinitrobenzenosulfonowego (Su i wsp., 2013; Xiong i wsp., 2016).

AktywacjaMLCK w IBD

TNF-α jest cytokiną prozapalną, która powoduje dysfunkcję bariery ścisłego połączenia jelitowego, co jest centralnym elementem patogenezy IBD (Saleh et al., 2016). W IBD sygnalizacja pośredniczona przez receptor 2 (R2) TNF przyczynia się do zwiększonej ekspresji nabłonkowej MLCK (Su i wsp., 2013; Suzuki i wsp., 2014). W ostatnim doniesieniu Al-Sadi i wsp. (2013), przepuszczalność ścisłych połączeń monowarstw komórek Caco-2, w modelu in vitro nabłonka jelitowego, była zwiększona przez aktywację przez TNF-α szlaku sygnałowego ERK1/2. Aktywacja szlaku ERK1/2 indukowała fosforylację zawierającego domenę ETS czynnika transkrypcyjnego Elk-1. Aktywowany Elk-1 przemieszczał się następnie do jądra i wiązał się z promotorem MLCK, co ostatecznie prowadziło do ekspresji MLCK w nabłonku. LIGHT (lymphotoxin-like inducible protein that competes with glycoprotein D for herpes virus entry on T cells) jest członkiem rodziny rdzeni TNF, który jest zaangażowany w patogenezę ludzkiego IBD (Krause i in., 2014), a w hodowlanym nabłonku hamowanie MLCK łagodziło utratę bariery indukowaną przez LIGHT, co sugerowało, że utrata bariery nabłonkowej indukowana przez LIGHT może zależeć od aktywacji MLCK (Schwarz i in., 2007).

Zwiększenie przepuszczalności połączeń ścisłych przez IL-1β-mediowane zwiększenie ekspresji MLCK wykazano w chorobach zapalnych (Beard i in., 2014). W migracji mezenchymalnych komórek macierzystych wykazano, że IL-1β powoduje wzrost ekspresji nabłonkowej MLCK poprzez aktywację szlaku PKCd/NF-κB; stymulowała również aktywność MLCK poprzez szlak sygnałowy PKCa/MEK/ERK (Lin i in., 2014).

IFN-γ został również powiązany z aktywacją MLCK poprzez promowanie adhezji i internalizacji bakterii komensalnych przez nabłonkowe MLCK-activated brush border fanning (Wu et al., 2014). Jednakże, podobnie jak w przypadku regulacji MLCK przez LIGHT, konieczne są dalsze badania nad regulacją MLCK przez INF-γ, aby ustalić, czy jest ona bezpośrednia. Ścieżki sygnałowe związane z regulacją MLCK przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1.

MLCK-Associated Signaling Pathways That Can Trigger IBD

W IBD, dysfunkcja bariery nabłonkowej wywołana przez MLCK jest wyzwalana przez dwie ścieżki sygnałowe. Po pierwsze, w jelicie, nabłonek tworzy barierę przed patogenami w świetle. Nieprawidłowa ekspresja MLCK w chorobach zapalnych przewodu pokarmowego prowadzi do fosforylacji regulacyjnego łańcucha lekkiego miozyny II (MLC), skurczu pierścienia aktomiozyny i zwiększonej przepuszczalności jelit (Yi i in., 2015). Zatem zależna od MLCK fosforylacja MLC jest istotnym mechanizmem leżącym u podstaw indukowanej przez MLCK dysfunkcji bariery nabłonkowej. Drugi mechanizm obejmuje stymulowane przez MLCK zwiększenie ekspresji klaudyny-2 i endocytozę okludyny (Su i in., 2013; Jin i Blikslager, 2016). Zwiększona ekspresja klaudyny-2 została powiązana z dysfunkcją bariery nabłonka jelitowego (Hu i in., 2015; Krishnan i in., 2015), a także ze zmniejszonym wchłanianiem, biegunką z przeciekiem i odpowiedzią zapalną (Hu i in., 2015). Down-regulation of occludin in IBD decreases gastrointestinal permeability, which may disrupt the integrity of the barrier against a variety of pathogens (Yin et al., 2015).

Potential Pathological Role of Smooth Muscle MLCK in IBD

Smooth muscle (sm) MLCK is transcribed from the same gene as epithelial MLCK. Jest zaangażowana w regulację skurczu sm, a zmienność zawartości smMLCK prowadzi do zaburzeń motoryki (Chen i in., 2015). Zaburzenia motoryki wtórnie powodują nieprawidłowy wzrost flory jelitowej, co z kolei nasila patogenezę stanu zapalnego jelit (Chen D. i wsp., 2014; Welch i wsp., 2014). To, czy istnieje bezpośredni wpływ smMLCK na choroby zapalne, wymaga dalszych badań.

InhibitoryMLCK o potencjalnym zastosowaniu farmaceutycznym

Kinaza lekkich łańcuchów miozyny posiada domeny katalityczne, hamujące oraz wiążące kalmodulinę (Chang i wsp., 2016). Aktywność domeny katalitycznej może być ujawniona przez częściowe trawienie tryptyczne i może być blokowana przez inhibitory MLCK (Luck i Choh, 2011; Chang i in., 2016). Inhibitory MLCK działają poprzez kompetycyjne wiązanie w miejscu lub w pobliżu miejsca wiążącego ATP na cząsteczce MLCK (Saitoh i in., 1987; Luck i Choh, 2011). MLCK była szeroko badana w sm, ale jest szeroko rozpowszechniona w komórkach i tkankach zwierzęcych. W związku z tym, określenie aktywności MLCK w innych tkankach ma kluczowe znaczenie; inhibitory MLCK są dobrymi narzędziami do tego celu. Inhibitory MLCK mają również potencjał farmakologiczny jako środki rozszerzające naczynia krwionośne i przeciwzapalne. Niektóre inhibitory MLCK, ich pochodzenie i dowody na działanie farmakologiczne wymieniono w tabeli 2.

TABELA 2

TABELA 2. Inhibitory kinazy łańcucha lekkiego miozyny o potencjalnym zastosowaniu farmaceutycznym.

ML-9 i ML-7

ML-9 jest klasycznym inhibitorem MLCK (IC50 = 3,8 μM), który okazał się hamować zarówno zależną od Ca2+kalmoduliny, jak i niezależną smMLCK (Saitoh i in., 1987; Shi i in., 2007). Zarówno ML-9, jak i jego syntetyczne pochodne są dobrymi selektywnymi inhibitorami smMLCK (Ito i in., 2004). Wykazano, że ML-9 obniża ciśnienie wewnątrzgałkowe w oczach królika (Honjo i in., 2002).

Inny inhibitor MLCK, ML-7 , jest środkiem przepuszczalnym dla błon (Shi i in., 2007). Zarówno ML-9 jak i ML-7 są pochodnymi naftalenosulfonamidowymi (Shi i in., 2007). Inhibicja ML-7 jest ponad 30-krotnie silniejsza niż ML-9 (IC50 = 300 nM) (Shi i in., 2007). Jednakże, w porównaniu z ML-9, specyficzne hamowanie MLCK przez smMLCK i inne izoformy MLCK może być mniej silne (Saitoh i in., 1987). Korzystne działanie ML-7 wykazano w wielu schorzeniach, w tym w uszkodzeniu niedokrwiennym/reperfuzyjnym serca (Lin i in., 2012; Zhang i in., 2015), IBD (Cheng i in., 2015) i miażdżycy (Cheng i in., 2015).

Inhibitory MLCK

K-252a, alkaloid mikrobiologiczny oczyszczony z kultur mikrobiologicznych, jest nieselektywnym inhibitorem MLCK (Nakanishi i in., 1992), jak również innych kinaz białkowych, w tym kinazy białkowej C i niektórych kinaz białkowych zależnych od cyklicznych nukleotydów (Nakanishi i in., 1992). KT592 jest pochodną K-252a o zwiększonej selektywności. Wortmannina, wyizolowana i oczyszczona ze szczepu grzybów Talaromyces wortmannin KY12420, jest kolejnym inhibitorem MLCK (Nakanishi et al., 1992). Wykazano, że zmniejsza ona odpowiedzi wydzielnicze w komórkach rdzenia nadnerczy szczurów poprzez hamowanie MLCK (Warashina, 2000) oraz ma działanie przeciwgrzybicze, przeciwkrwotoczne i przeciwzapalne, które może nie być związane z hamowaniem MLCK (Nakanishi et al., 1992). The potential pharmacological effects of these inhibitors warrant further study.

Naturally Occurring Potential Inhibitors of MLCK

As shown in Table 2, some naturally occurring bioactive constituents may be inhibitors of MLCK. W systemie in vitro obejmującym oczyszczoną miozynę i MLCK, kwercetyna hamowała fosforylację miozyny. Hamowanie to może być blokowane przez inhibitor MLCK ML-7, co wskazuje, że kwercetyna może być bezpośrednim inhibitorem MLCK (Zhang et al., 2006). W zwierzęcym modelu zaburzeń motoryki jelit, podanie kapsaicyny znacząco zmniejszyło ekspresję MLCK, co również implikuje MLCK jako cel hamowania przez kapsaicynę (Chen i in., 2015). Zahamowanie w odpowiedzi na kwas salwianolowy B może być pośrednie; zaangażowana jest inna sygnalizacja. Kwas salwianolowy B obniża ekspresję MLCK poprzez upregulację mikroRNA1 (Xiong i in., 2016). Stwierdzono również, że upregulacja mikroRNA-374a, mikroRNA-155, miR-520c-3p i miR-1290 zmniejsza ekspresję MLCK w różnych tkankach (Adyshev et al., 2013; Weber et al., 2014). Alternatywną ścieżką inhibicji są naturalnie występujące związki bioaktywne, które działają pośrednio poprzez mikroRNA. Potrzebne są jednak eksperymenty farmakologiczne specyficzne dla danej choroby, aby potwierdzić działanie potencjalnych naturalnie występujących inhibitorów MLCK.

Podsumowanie

W niniejszym przeglądzie podsumowano dowody na rolę MLCK w chorobach zapalnych, zwłaszcza IBD. Nieprawidłowa ekspresja MLCK jest zaangażowana w różne zdarzenia patologiczne, głównie poprzez powodowanie zmian cytoszkieletu, które zaburzają funkcję bariery nabłonkowej. Efekt działania leków anty-MLCK w poszczególnych chorobach zapalnych zależy od stopnia, w jakim funkcja śródbłonka jest zaangażowana. Zapobieganie efektom ubocznym związanym z leczeniem jest kluczową kwestią, ponieważ MLCK ulega obfitej ekspresji w wielu tkankach. Uwzględnienie dwóch aspektów selektywności pomaga przewidywać i zapobiegać skutkom ubocznym stosowania inhibitorów MLCK. Pierwszym z nich jest selektywne hamowanie MLCK i innych kinaz białkowych, takich jak kinaza białkowa C i kinaza białkowa zależna od cyklicznych nukleotydów; drugim jest selektywne hamowanie różnych izoform MLCK, takich jak smMLCK i nmMLCK. Potencjalne środki farmaceutyczne antyMLCK oferują nowy wgląd w leczenie chorób zapalnych, który różni się od tradycyjnej terapii przeciwzapalnej.

Author Contributions

Conceived and designed the review: DC. References check: DC, YX, CW, LW, ZZ, and LS. Drafted the paper and revised it critically for important intellectual content: DC, YX, CW, LW, ZZ, and LS. Manuskrypt został zaakceptowany przez wszystkich autorów.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych powiązań, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Badanie to było wspierane przez National Natural Science Foundation of China (numer grantu 81600440, 81273919) oraz Dalian Municipal Medical Research Foundation.

Materiały uzupełniające

Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć online pod adresem: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fphar.2017.00292/full#supplementary-material

FIGURE S1 | Mechanizmy leżące u podstaw indukowanej przez MLCK regulacji funkcji bariery śródbłonka są pokazane. Strzałki ciągłe wskazują na interakcje bezpośrednie, a strzałki przerywane na interakcje pośrednie.

Adyshev, D. M., Moldobaeva, N., Mapes, B., Elangovan, V., and Garcia, J. G. (2013). MicroRNA regulation of nonmuscle myosin light chain kinase expression in human lung endothelium. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 49, 58-66. doi: 10.1165/rcmb.2012-0397OC