Results and Discussion
Aby lepiej zrozumieć powstawanie i naprawę miejsc AP wynikających z naprawy przez wycinanie zasad i spontanicznej depurynacji/depyrimidynacji in vivo, zmierzyliśmy liczbę endogennych miejsc AP w genomowym DNA wyekstrahowanym z różnych tkanek dorosłych szczurów i ludzkiej wątroby o jakości transplantacyjnej przy użyciu testu ASB (3). Liczba endogennych miejsc AP różniła się znacznie pomiędzy tkankami (Rys. 1)⇓ ale nie w obrębie tkanek. Największa liczba miejsc AP została wykryta w mózgu, z 30 miejscami AP na 106 nukleotydów, a następnie w sercu i okrężnicy. Natomiast wątroba, nerki i płuca szczurów konsekwentnie wykazywały najniższą liczbę miejsc AP (8-9 miejsc AP na 106 nukleotydów). Liczba endogennych miejsc AP w wątrobie ludzkiej była porównywalna do tej w wątrobie szczura. Dane te wskazują, że w normalnych warunkach fizjologicznych liczba miejsc AP utrzymuje się na poziomie 50 000-200 000 zmian w komórce ssaka. Stan ustalony liczby miejsc AP w genomowym DNA powinien odzwierciedlać równowagę pomiędzy tworzeniem i naprawą miejsc AP. Możliwe interpretacje większej liczby endogennych miejsc AP w mózgu są następujące: (a) wyższa szybkość depurynacji i/lub tworzenia endogennych adduktów DNA, co skutkuje większą liczbą miejsc AP; (b) wyższa aktywność glikozylazy DNA, indukująca większą liczbę miejsc AP; (c) niższa aktywność endonukleazy AP typu II, powodująca akumulację miejsc AP; oraz (d) mniejsza wydajność dRp-azy lub β-eliminacji, pozostawiająca 5′-nickowane miejsca AP.
Endogenne miejsca AP w tkankach szczura i człowieka. DNA ekstrahowano w temperaturze 4°C z nienaruszonych tkanek szczurów i prawidłowych wątrób ludzkich, a liczbę miejsc AP mierzono przy użyciu testu ASB. A, typowe zdjęcie rentgenowskie pokazujące endogenne miejsca AP w tkankach szczura. DNA (w tym standardowe próbki DNA) załadowano na membranę NC (1,5 μg na szczelinę). B, skaningowe dane densytometryczne endogennych miejsc AP w tkankach szczura i człowieka. Kolumny, średnie z zduplikowanych szczelin od pięciu do ośmiu pojedynczych próbek; słupki, SD.
Głównym procesem w naprawie miejsc AP jest ścieżka zależna od endonukleazy typu II AP/β-pol (7). Endonukleaza AP typu II może rozpoznawać miejsca AP i nacinać szkielet fosfodiestrowy bezpośrednio 5′ do zmian, pozostawiając grupę 3′-hydroksylową i terminus miejsca 5′-AP (5). 5′-dRp jest następnie uwalniany, a pojedyncza luka nukleotydowa jest wypełniana. Wykazano, że znaczne ilości endonukleazy AP typu II są obecne w jądrze komórek ssaków (8). Wcześniej wykazaliśmy, że połączenie testu ASB i endonukleazy AP typu II lub NaOH indukuje odpowiednio 3′ lub 5′ rozszczepienie miejsc AP (3). Aby zrozumieć aktywność endonukleazy AP i dRp-azy in vivo, zoptymalizowaliśmy test rozszczepiania miejsc AP. W tym eksperymencie użyliśmy Exo III jako endonukleazy AP typu II do identyfikacji 3′-nicków miejsc AP oraz putrescyny do wykrycia 5′-nicków (ryc. 2)⇓. Aby scharakteryzować ten test rozszczepiania miejsc AP, inkubowaliśmy DNA, które zostało wstępnie potraktowane MX w celu zmniejszenia liczby miejsc AP do 3,8 ± 0,5 miejsc AP na 106 nukleotydów (średnia ± SD) z buforem ciepła i kwasu. Różne okresy inkubacji ciepło/kwas indukowały 11, 47, 115 i 320 miejsc AP na 106 nukleotydów. Pojedyncze traktowanie Exo III zmniejszyło liczbę miejsc AP o 4-10 miejsc AP na 106 nukleotydów w każdej próbce DNA, niezależnie od początkowej liczby obecnych (Rys. 3)⇓. Ta redukcja może być spowodowana połączeniem enzymatycznego nacięcia po stronie 5′ przez Exo III i niespecyficznego 3′ rozszczepienia miejsc AP podczas inkubacji z Exo III. To niespecyficzne 3′ rozszczepienie uniemożliwiło dokładne określenie ilościowe liczby 3′-nickowanych miejsc AP w DNA za pomocą tego testu. W przeciwieństwie do tego, traktowanie putrescyną nie wykazało zmniejszenia liczby miejsc AP. Po inkubacji z Exo III, a następnie z putrescyną, liczba miejsc AP została zredukowana do pierwotnej liczby miejsc AP w DNA grasicy cielęcej wstępnie traktowanym MX. Wydajność rozszczepiania miejsc AP przez kombinację Exo III i putrescyny wynosiła >99%.
Schemat badania rozszczepiania miejsc AP. Aby lepiej zrozumieć aktywność endonukleazy AP typu II, jak również dRp-azy in vivo, określiliśmy występowanie rozszczepień po stronie 5′ lub 3′ miejsc AP w genomowym DNA. Putrescyna i Exo III (endonukleaza AP typu II) pozostawiają odpowiednio 3′- i 5′- rozszczepione miejsca AP. W przypadku nienaruszonych miejsc AP bez nacięć po stronie 3′ i 5′ miejsc AP, test ASB może teoretycznie wykryć pierwotną liczbę miejsc AP po potraktowaniu Exo III lub putrescyną, ponieważ miejsca AP pozostają na szkielecie DNA po nacięciu po obu stronach wiązania fosfodiestrowego przylegającego do miejsca AP. Jednakże połączenie Exo III i putrescyny powoduje rozszczepienie zarówno po stronie 3′, jak i 5′ miejsca AP, co skutkuje uwolnieniem miejsca AP od szkieletu DNA. Takie uwolnione miejsca AP nie są wykrywane przez ten test. Na podstawie liczby miejsc AP pozostawionych na szkielecie DNA po tej reakcji rozszczepienia można oszacować liczbę 5′- i 3′-odciętych miejsc AP. Jeżeli w DNA obecne są miejsca AP ulegające 5′-odcięciu, pojedyncze traktowanie putrescyną może uwolnić miejsca AP ulegające 5′-nickacji poprzez 3′-wycięcie miejsc AP. Podobnie, 3′-nicked miejsca AP w DNA mogą być uwolnione przez 5′-ekscytację przy użyciu Exo III .
Test rozszczepienia miejsca AP w DNA grasicy cielęcej traktowanym buforem ciepła / kwasowym. Aby zwalidować test rozszczepiania miejsc AP, zbadaliśmy wpływ Exo III i putrescyny na nieuszkodzone miejsca AP indukowane w DNA grasicy cielęcej. Pierwotna liczba miejsc AP w DNA grasicy cielęcej została zredukowana przez MX (CTD/MX). Następnie DNA inkubowano w buforze ciepło-kwaśnym przez różną długość czasu, aby wprowadzić różną liczbę nienaruszonych miejsc AP (-/-; Ref. 9). DNA inkubowano z Exo III i/lub putrescyną, a liczbę pozostałych miejsc AP w DNA grasicy cielęcej mierzono testem ASB. Kolumny, średnie z duplikatów trzech pojedynczych próbek; słupki, SD. A, test rozszczepienia miejsc AP w DNA zawierającym 115 miejsc AP na 106 nukleotydów. B, podsumowanie testu rozszczepiania miejsc AP w DNA zawierającym różne liczby miejsc AP.
Zastosowaliśmy ten test do genomowego DNA wyekstrahowanego ze szczurzych i ludzkich tkanek w celu scharakteryzowania endogennych miejsc AP. Frakcje nienaruszonych i rozszczepionych miejsc AP oraz resztkowe zmiany aldehydowe są podsumowane na Rys. 4⇓. DNA tkanek szczura i człowieka inkubowano z Exo III, a następnie z putrescyną, aby zbadać, czy wykryte zmiany były rzeczywistymi miejscami AP. Po 5′ i 3′ rozszczepieniu miejsc AP, wykryto 1,5-2,2 resztkowych zmian aldehydowych na 106 nukleotydów. Dane te wskazują, że test ASB prawidłowo mierzy endogenne miejsca AP. Resztkowe zmiany mogą wynikać z ograniczeń reakcji enzymatycznych w teście rozszczepiania miejsc AP, jak również z obecności endogennych aldehydowych zmian zasadowych, takich jak formyluracyl (10). Ponadto, łączna frakcja 3′-odciętych i nienaruszonych miejsc AP została wykryta na poziomie ∼2-3 zmian na 106 nukleotydów w różnych tkankach, co stanowi ∼1/3-1/10 całkowitej liczby endogennych miejsc AP. Aby zbadać liczbę miejsc AP ulegających 5′-cleaved, inkubowaliśmy DNA z putrescyną. Redukcja miejsc AP przez putrescynę (oryginalna liczba miejsc AP minus liczba miejsc AP pozostałych po inkubacji z putrescyną) odpowiada liczbie 5′-odciętych miejsc AP. W przeciwieństwie do DNA grasicy cielęcej poddanego działaniu buforu ciepło-kwasowego, genomowe DNA poddane działaniu putrescyny miało wyraźnie zmniejszoną liczbę miejsc AP. Dane te wskazują, że około dwie trzecie lub więcej endogennych miejsc AP jest już rozszczepionych po stronie 5′ miejsc AP in vivo.
Podsumowanie testu rozszczepiania miejsc AP w DNA tkanek szczura i człowieka. Pierwotna liczba miejsc AP, jak opisano w legendzie do ryc. 1B⇓, składała się z 5′-odciętych, 3′-odciętych, nienaruszonych miejsc AP i resztkowych zmian aldehydowych. Liczbę miejsc AP 5′-cleaved obliczono jako pierwotną liczbę miejsc AP minus liczba miejsc AP pozostałych po leczeniu samą putrescyną. Połączona frakcja 3′-sklejonych i nienaruszonych miejsc AP stanowiła różnicę między leczeniem putrescyną a leczeniem kombinacją Exo III i putrescyny. Resztkowe miejsca AP wykazywały liczbę nieuwolnionych zmian aldehydowych.
Po 5′ rozszczepieniu miejsc AP przez endonukleazę AP typu II, nacięte miejsca AP muszą następnie zostać uwolnione od szkieletu DNA poprzez wycięcie reszt 5′-dRp. Ten proces uwalniania jest prawdopodobnie wykonywany przez dRp-azę poprzez reakcję hydrolityczną (11) lub β-eliminację (12) lub przez enzym endonukleolityczny, który wycina reszty 5′-dRp (13). Wykazano, że Xenopus i ludzki β-pol uwalniają 5′-dRp przez β-eliminację (14). Wykorzystując wielkość łat naprawczych w komórkach β-pol-null lub -proficient, wykazano, że pojedyncza ścieżka naprawy szczelin była dominująca w komórkach β-pol-proficient, ale nie w komórkach β-pol-null (15). Ponadto, interakcja pomiędzy ludzką endonukleazą AP i β-polem przyspiesza uwalnianie reszt 5′-dRp in vitro (16). Jednakże wydajność naprawy reszt 5′-dRp nie została dobrze scharakteryzowana w komórkach lub in vivo. Wykorzystując ekstrakty bezkomórkowe drożdży stwierdzono, że przetwarzanie cząsteczek 5′-dRp jest etapem ograniczającym szybkość naprawy przez wycięcie zasad w DNA zawierającym uracyl (17). Ponadto, zbadano wydajność katalityczną β-polu w usuwaniu 5′-dRp (18). Co ciekawe, Kcat aktywności 5′-dRp-azy β-polu było ∼100-krotnie niższe niż Kcat endonukleazy AP. Badanie to wykazuje wyraźne utrzymywanie się miejsc 5′- naciętych przez AP w tkankach szczura i człowieka. Dane te sugerują, że nacinanie przez endonukleazę AP i późniejsze uwalnianie reszt 5′-dRp może nie być wydajnie powiązane na poziomie podstawowym in vivo i że proces naprawy 5′-dRp może być jednym z etapów ograniczających szybkość naprawy wycinania zasad.
W poprzednim badaniu (3) wykazaliśmy, że spontaniczna depurynacja wystąpiła w 1,5 miejscach AP na 106 nukleotydów dziennie w warunkach fizjologicznych. Aby sprawdzić, czy termolabilne addukty DNA, takie jak N3- i N7-alkilowe puryny, były źródłem większej liczby endogennych miejsc AP w mózgu, przeprowadzono test depurynacji w DNA mózgu i wątroby. Nie zaobserwowano jednak różnicy między mózgiem a wątrobą (dane nie pokazane). W związku z tym, stały stan endogennych miejsc AP może nie być spowodowany labilnymi zmianami zasad. Jedn± z najważniejszych i najliczniejszych endogennych zmian w DNA jest oksydacyjne uszkodzenie zasad DNA. Stwierdzono, że stan stacjonarny 5-hydroksycytozyny w mózgu szczura jest ∼2-krotnie wyższy niż w wątrobie szczura (19). Takie oksydacyjne zasady pirymidynowe są naprawiane przez koniec III, pozostawiając miejsca AP na szkielecie DNA. Aby zbadać, czy stres oksydacyjny może być związany z ustaloną liczbą miejsc AP w DNA, miejsca wrażliwe na End III były oznaczane ilościowo przy użyciu kombinacji testu ASB i E. coli End III. Liczba miejsc wrażliwych na End III była trzykrotnie wyższa w mózgu (14 zmian na 106 nukleotydów) w porównaniu z innymi tkankami (4-5 zmian na 106 nukleotydów). Ostatnio sklonowano i scharakteryzowano ludzki homolog genu End III (hNTH1) (20). Ekspresja mRNA tego genu różni się w poszczególnych narządach w sposób odpowiadający liczbie endogennych miejsc AP (20). Większość glikozylaz DNA biorących udział w naprawie utlenionych zasad posiada aktywność liazy AP, która rozszczepia 3′ stronę miejsc AP. Dlatego endogenne miejsca 5′ AP nie pochodziłyby z rozszczepienia utlenionych zasad przez takie glikozylazy DNA. Wstępny eksperyment wykazał, że nadtlenek wodoru z FeSO4 bezpośrednio indukował 5′-odcięte miejsca AP w DNA grasicy cielęcej bez udziału enzymów (dane nie pokazane). Badania te sugerują, że stres oksydacyjny może być jednym z czynników odpowiedzialnych za stały stan miejsc AP z rozszczepieniem 5′.
Początkowo spodziewaliśmy się znaleźć niską liczbę endogennych miejsc AP w genomowym DNA ze względu na ich toksyczność i mutagenność. Jednakże, badania te pokazują, że stan stabilny miejsc AP wynosi ∼1 zmiany na 105 nukleotydów w genomowym DNA. Chociaż miejsca AP są stale naprawiane, frakcja miejsc AP, która wymyka się naprawie, prawdopodobnie przyczynia się do mutacji, aberracji chromosomowych i błędów transkrypcji, które mogą być związane z samoistnymi chorobami związanymi z wiekiem, takimi jak rak i zaburzenia zwyrodnieniowe.
.