Abstract
U pacjenta z mocznicą rozwinęła się hiperkalcemia po zakażeniu gruźlicą, a jego poziomy wapnia zjonizowanego korelowały z poziomami 1,25-dihydroksywitaminy D3 (1,25(OH)2D3). Przeprowadziliśmy dalsze badania w celu ustalenia, czy monocyty są alternatywnym miejscem konwersji 1,25(OH)2D3 poza komórkami kanalików nerkowych. Wykorzystując test biologiczny ex vivo, w tym badaniu stwierdziliśmy, że aktywność 1-α hydroksylazy (CYP27B1) w monocytach jest znacząco wyższa u pacjentów z aktywną gruźlicą (TB) niż u osób mających częsty kontakt z gruźlicą. Jednakże, gdy monocyty od pacjentów z aktywną gruźlicą były restymulowane antygenem pochodzącym od Mycobacterium tuberculosis, obserwowano mniejszą ilość 1,25(OH)2D3. Z kolei u osób mających częsty kontakt z gruźlicą poziom 1,25(OH)2D3 był niezmieniony. Wnioskujemy, że monocyty mogą być alternatywnym źródłem 1-α hydroksylazy, która mogłaby przekształcać 25-hydroksywitaminę D3 do bardziej aktywnej 1,25(OH)2D3.
1. Wprowadzenie
Gruźlica nęka świat od czasów prehistorycznych. Zgodnie z ostatnim raportem, milion pacjentów ulega gruźlicy i związanych z nią chorób współistniejących rocznie. W ostatnich dekadach poczyniono ogromne wysiłki, aby zrozumieć patofizjologiczny proces choroby. Modele zwierzęce i badania na ludziach utorowały drogę do wyjaśnienia indywidualnych odpowiedzi immunologicznych na Mycobacterium tuberculosis (MTB). Badania te dostarczają dowodów na to, że witamina D odgrywa ważną rolę w odporności człowieka na gruźlicę. witamina D jest stosowana w walce z gruźlicą od ponad 200 lat. Olej z wątroby dorsza i kalcyferol, główne źródła witaminy D, zostały wykorzystane od 17 wieku w leczeniu pacjentów z gruźlicą . W normalnej fizjologii, po ekspozycji na słońce, 7-dehydrocholesterol przechowywany w skórze został przekształcony w prewitaminę D3, a następnie izomeryzacji termicznej do witaminy D3. Następnie witamina D3 jest hydroksylowana w wątrobie do 25-hydroksywitaminy D3 (25(OH)D3). Następnie 25(OH)D3 jest dalej hydroksylowana do najbardziej aktywnej formy witaminy D3, 1,25(OH)2D3, przez 1- hydroksylazę (CYP27B1). Komórki nabłonka kanalików nerkowych są głównym źródłem 1- hydroksylazy i odgrywają kluczową rolę w określaniu stężenia 1,25(OH)2D3 w surowicy . Obecność CYP27B1 w tkankach pozanadnerczowych jest znana od dziesięcioleci. Wpływ pozanadnerczowego CYP27B1 na stężenie 1,25(OH)2D3 w surowicy nie został jeszcze określony.
Przypadkowo spotkaliśmy 34-letniego pacjenta z mocznicą, który otrzymywał regularne hemodializy przez 2 lata. Pacjent odczuwał osłabienie mięśni i zmęczenie przez 2 dni przed wizytą u lekarza rodzinnego. Badania chemiczne krwi wykazały podwyższony poziom wapnia zjonizowanego (5,44 mg/dl). Pomimo hiperkalcemii, objawy pacjenta zostały złagodzone przez konwencjonalne leczenie. Cztery miesiące później u pacjentki wystąpiło postępujące osłabienie mięśni z towarzyszącą gorączką. W izbie przyjęć ponownie stwierdzono podwyższony poziom wapnia zjonizowanego (6,88 mg/dl). Ponadto w badaniu EKG stwierdzono nieprawidłowy rytm serca, krótki odstęp QT z poszerzoną falą T. W badaniu radiologicznym klatki piersiowej stwierdzono nacieki w prawym górnym płacie płucnym, które później uznano za gruźlicę płuc. Pacjentkę poddano 9-miesięcznemu leczeniu przeciwgruźliczemu. Po 4 miesiącach leczenia stężenie wapnia zjonizowanego u pacjentki uległo normalizacji (5,2 mg/dl), a objawy całkowicie ustąpiły. Aby wyjaśnić patogenezę hiperkalcemii u tego pacjenta, oprócz poziomu wapnia zjonizowanego zmierzyliśmy również poziom 1,25(OH)2D3. Jak pokazano na rycinie 1, poziomy 1,25(OH)2D3 były wysoce skorelowane z poziomami wapnia zjonizowanego.
Zmiany w stężeniach wapnia zjonizowanego i 1,25(OH)2D3 w surowicy pacjenta z aktywną gruźlicą i mocznicą.
Oprócz nerkowej ekspresji CYP27B1, makrofagi i monocyty są uważane za ważne pozanadnerczowe miejsca ekspresji CYP27B1. W tym badaniu ocenialiśmy rolę monocytów w metabolizmie witaminy D3 za pomocą próby biologicznej ex vivo. Ponadto, stymulowaliśmy monocyty antygenem pochodzącym z MTB, aby uzyskać dalszy wgląd w to, jak monocyty modulują metabolizm witaminy D3 w odpowiedzi na wyzwanie bakteryjne.
2. Materiały i metody
2.1. Subject Population
Badanie to zostało przeprowadzone na Uniwersytecie Medycznym Kaohsiung. Uczestnicy zostali podzieleni na dwie grupy: (1) aktywna gruźlica i (2) częsty kontakt z gruźlicą. Osoby z aktywną gruźlicą płuc potwierdzoną posiewem plwociny i zdjęciem klatki piersiowej zostały przydzielone do grupy aktywnej gruźlicy (). Częste kontakty z gruźlicą () obejmowały następujące osoby: (1) personel medyczny, który pracował w ośrodku gruźlicy przez co najmniej 10 lat i nigdy nie był zakażony oraz (2) członkowie rodzin pacjentów z gruźlicą, klinicyści i pielęgniarki, którzy mieli długotrwały kontakt z pacjentami z gruźlicą i nigdy nie byli zakażeni. Wszystkie osoby mające częsty kontakt z chorymi na gruźlicę były szczepione BCG i corocznie poddawane badaniu radiologicznemu klatki piersiowej; w przypadku nieprawidłowego obrazu klatki piersiowej wykonywano test Mantoux. Wykluczono osoby chore na cukrzycę, nowotwory złośliwe lub inne choroby mogące powodować upośledzenie odporności. Obie grupy były dopasowane pod względem płci i wieku (Tabela 1).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||
| Czas trwania choroby zdefiniowano jako okres od diagnozy do pobrania krwi. Długość ekspozycji zdefiniowano jako przedział czasu od rozpoczęcia pracy w ośrodku gruźliczym do pobrania krwi. |
||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2. Przygotowanie komórek
Komórki jednojądrowe krwi obwodowej (PBMCs) izolowano z krwi poddanej działaniu heparyny, pobranej od 2 grup dawców, stosując standardowy gradient Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Szwecja). PBMCs ( komórki/mL) zawieszano w podłożu RPMI 1640 uzupełnionym L-glutaminą i 10% płodową surowicą cielęcą. Po inkubacji przez 1 godzinę w kolbie 75 cm2 w nawilżanym inkubatorze 37°C, 5% CO2, pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki zdekantowano do probówki stożkowej, a kolbę przepłukano dwukrotnie pożywką bez surowicy, aby usunąć wszelkie pozostałości nieprzylegających komórek. Przylegające monocyty zostały usunięte przez delikatne zeskrobanie za pomocą plastikowego skrobaka do komórek. Komórki przeniesiono do probówki stożkowej, odwirowano w celu usunięcia roztworu płuczącego i ponownie zawieszono do liczby komórek/mL w uzupełnionej pożywce. Populacja komórek adherentnych zawierała ponad 85% komórek CD14+.
2.3. Antygen
MTB wyizolowana od pacjentów z gruźlicą została ponownie zawieszona w buforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej i uśmiercona termicznie w łaźni wodnej w temperaturze 70°C przez 70 minut. Następnie bakterie poddano sonikacji przy użyciu sonikatora New Highway (Farmingdale, NY, USA). Stężenie białka w homogenacie bakteryjnym oznaczono przy użyciu zestawu Pierce BCA protein assay kit (IL, USA) i przechowywano w temperaturze -20°C.
2.4. Analiza cytofluorometryczna
Analizę cytometryczną przeprowadzono przy użyciu cytometru FACS (Becton Dickinson). Ogół komórek inkubowano z każdym przeciwciałem monoklonalnym w nasyconych ilościach w 50 μL buforu barwiącego (zrównoważony roztwór soli Hanka: 1% BSA i 0,1% azydek sodu) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemywano trzykrotnie PBS. Komórki przygotowywano do analizy poprzez zawieszenie w 500 μL 1% paraformaldehydu w PBS. Populacja monocytów została zakwalifikowana do analizy w oparciu o wykres kropkowy rozproszenia bocznego i rozproszenia do przodu. Do każdej analizy użyto w sumie 5,000 komórek. Kratkowane komórki były dalej analizowane przez barwienie fluorescencyjne przy użyciu fluoresceiny-izotiocyjanianu- (FITC-) sprzężonego z anty-CD14 (Ancell).
2.5. Ilościowe oznaczanie 1,25(OH)2D3
Oczyszczone monocyty hodowano w gęstości komórek/mL w 100 μL w każdej studzience 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowych z 200 nM 25(OH)D3 rozpuszczonym w końcowym stężeniu 1% etanolu. Po 3 godzinach inkubacji dodano 1 mL acetonitrylu, aby zatrzymać reakcję. Komórki i pożywka zostały zebrane i połączone z równą objętością metanolu w celu usunięcia lipidów. Ilość 1,25(OH)2D3 oznaczano przy użyciu zestawu 1,25-dihydroksywitaminy D 125I RIA (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). W skrócie, 2 mL wody i 5 mL metanolu/wody (70 : 30) dodano do wkładu C18OH w celu usunięcia soli, polarnych lipidów i barwników w warunkach próżni. Następnie, 5 mL heksanu/chlorku metylenu (90 : 10) dodano do wkładu C18OH w celu usunięcia 25(OH)D3, a 5 mL heksanu/izopropanolu (99 : 1) dodano w celu usunięcia 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Każdy wkład C18OH był ciasno osadzony wewnątrz wkładu krzemionkowego. Po dodaniu heksanu/izopropanolu (92 : 8) w warunkach próżni usunięto wkład C18OH. Ostatecznie oczyszczony 1,25(OH)2D3 został wymyty z wkładu krzemionkowego w 5 mL heksanu/izopropanolu (80 : 20). Poziomy 1,25(OH)2D3 oznaczano ilościowo metodą kompetycyjnej radioimmunoanalizy (RIA) z użyciem przeciwciał przeciw-1,25(OH)2D3 i przeciw-1,25(OH)2D3 znakowanych 125I.
2.6. Traktowanie antygenami MTB
Monocyty ( komórek/mL) inkubowano z 10 μg/mL MTB i 200 ng/mL 25(OH)D3. Po 3 godzinach inkubacji dodano 1 mL acetonitrylu w celu zatrzymania reakcji. Powstały 1,25(OH)2D3 był oczyszczany z komórek i podłoża i oznaczany ilościowo metodą RIA. Pozostała część procedury była taka sama jak w przypadku poprzedniego oznaczenia.
2.7. Analiza statystyczna
Wszystkie dane były analizowane przy użyciu testu Studenta.
3. Wyniki
3.1. Ionized Calcium and 1,25 Dihydroxyvitamin D3 Concentrations in a Patient with Active TB and Uremia
Serum zjonizowanego wapnia i 1,25(OH)2D3 oznaczono w różnych punktach czasowych od pierwszej wizyty do jednego roku po zakończeniu leczenia przeciwgruźliczego. Jak pokazano na rycinie 1, poziomy wapnia zjonizowanego korelowały ze stężeniem 1,25(OH)2D3 (rycina 1).
3.2. Populacja badana
Do grupy częstego kontaktu z gruźlicą zrekrutowano 25 osób, a do grupy aktywnej gruźlicy 25 pacjentów. Średni wiek i stosunek płci nie różniły się istotnie między grupami. Charakterystykę zbioru danych przedstawiono w tabeli 1.
3.3. Kwantyfikacja 1,25(OH)2D3
Monocyty hodowano z 25(OH)D3 przez 3 godziny. Następnie 1,25(OH)2D3 został oczyszczony z komórek i medium i zmierzony przez RIA. Jak pokazano na rycinie 2, ilość 1,25(OH)2D3 w grupie aktywnej gruźlicy wynosiła pg/mL (średnia ± SD), co było znacznie wyższe niż w grupie częstego kontaktu z gruźlicą () (). Kiedy monocyty były jednocześnie inkubowane z MTB i 25(OH)D3 przez 3 godziny, ilość 1,25(OH)2D3 w grupie aktywnej gruźlicy zmniejszyła się znacznie w porównaniu z grupą bez MTB ( i , resp.) () (patrz Figura 3). Nie było różnicy między monocytami z ekspozycją lub bez ekspozycji na MTB w grupie częstych kontaktów z gruźlicą ( i , resp.).
Kwantyfikacja 1,25(OH)2D3 u pacjentów z aktywną gruźlicą i częstymi kontaktami z gruźlicą. Pomiar RIA 1,25(OH)2D3 oczyszczonego z zawiesin monocytów hodowanych z 25(OH)D3 przez 3 godziny. Ilość 1,25(OH)2D3 w grupie z aktywną gruźlicą była istotnie wyższa niż w grupie częstych kontaktów z gruźlicą. Każda kolumna przedstawia średnią z oznaczeń ilościowych 1,25(OH)2D3. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. *.
Kwantyfikacja 1,25(OH)2D3 u pacjentów z aktywną gruźlicą i częstymi kontaktami z gruźlicą z antygenem M. tuberculosis (MTB) lub bez niego. Monocyty poddano pulsacji 25(OH)D3 z lub bez MTB. Ilość 1,25(OH)2D3 z ekspozycją na MTB zmniejszyła się znacząco w porównaniu z ilością bez MTB w grupie z aktywną gruźlicą. Każda kolumna przedstawia średnią z oznaczeń ilościowych 1,25(OH)2D3. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. *.
4. Dyskusja
Zaobserwowaliśmy, że poziomy 1,25(OH)2D3 korelowały z poziomami wapnia zjonizowanego u chorego na mocznicę z gruźlicą płuc. W aktywnej gruźlicy płuc, poziomy 1,25(OH)2D3 w surowicy tego pacjenta były wysokie, co z kolei indukowało wysokie poziomy zjonizowanego wapnia. Po leczeniu zarówno poziom 1,25(OH)2D3, jak i zjonizowanego wapnia obniżył się. Teoretycznie u pacjenta z mocznicą aktywność CYP27B1 w nerkach jest niewielka. Niskie poziomy 1,25(OH)2D3 w surowicy są często obserwowane u pacjentów z mocznicą. Zgodnie z tym, co zaobserwowano u ludzi, w mysim modelu anefrycznym również obserwuje się niski poziom 1,25(OH)2D3 . Jednak pozanadnerczowe źródło CYP27B1 jest opisywane od ponad 6 dekad. Harrell i Fisher jako jedni z pierwszych stwierdzili pozanadnerczową syntezę 1,25(OH)2D3 w warunkach patologicznych. Autorzy ci stwierdzili związek między zaburzoną homeostazą wapnia a sarkoidozą. Później wykazano, że makrofagi tkankowe są pozanadnerczowym źródłem produkcji 1,25(OH)2D3 w tych grupach pacjentów. W coraz większej liczbie tkanek stwierdzono ekspresję CYP27B1 w różnych grupach badawczych, takich jak melanocyty skóry, makrofagi tkankowe i komórki resztkowe łożyska. Co zaskakujące, nie każda komórka wykazująca ekspresję CYP27B1 posiada aktywność enzymatyczną. Aby wyjaśnić, czy krążące monocyty mogą przyczyniać się do wysokiego poziomu 1,25(OH)2D3, zastosowaliśmy próbę biologiczną ex vivo z użyciem 25(OH)D3 jako substratu do określenia aktywności CYP27B1. Nasze wyniki wykazały, że aktywność CYP27B1 w monocytach pochodzących od pacjentów z aktywną gruźlicą jest znacząco wyższa niż w monocytach pochodzących od osób mających częsty kontakt z gruźlicą. Krążące monocyty przyczyniają się do konwersji 25(OH)D3 do bardziej aktywnego 1,25(OH)2D3. Co intrygujące, witamina D3 była tradycyjnie uważana za czynnik endokrynny; 1,25(OH)2D3 wytwarzany w miejscach lokalnych (kanaliki nerkowe) jest przenoszony przez krew, aby oddziaływać na inne tkanki lub narządy, na przykład kości. Jednak w ostatnich dekadach wykazano, że witamina D3 pełni inne funkcje niż endokrynne. 1,25(OH)2D3 produkowany przez komórki zapalne może stymulować ekspresję receptorów witaminy D zarówno w komórkach sąsiednich, jak i w samych komórkach zapalnych. Poprzez wiązanie się z receptorem witaminy D i receptorem retinoidów, kompleks ligand-receptor może wiązać się z promotorami wielu genów zapalnych. Ze względu na te efekty uważano, że witamina D3 ma zarówno funkcje parakrynne, jak i autokrynne. W przeciwieństwie do endokrynnej funkcji witaminy D3 jako regulatora wapnia, jej funkcje parakrynne i autokrynne skłaniają komórki zapalne do produkcji peptydów przeciwbakteryjnych i nasilają proces autofagii. Ponieważ 1,25(OH)2D3 jest produkowany lokalnie i nie jest przenoszony do miejsc docelowych regulacji homeostazy wapnia, jego produkcja nie wpływa na poziom wapnia w surowicy. Co ciekawe, w tym badaniu stwierdziliśmy, że 1,25(OH)2D3 produkowany przez monocyty był szczególnym przypadkiem. Chociaż 1,25(OH)2D3 produkowany przez monocyty może działać lokalnie, komórki te są przenoszone przez krew do tkanek w całym organizmie. Produkowany przez monocyty 1,25(OH)2D3 zachowuje się również jak czynnik endokrynny. Monocyty mogą być jedynymi komórkami w naszym organizmie, które mogą zarządzać endokrynnymi, parakrynnymi i autokrynnymi funkcjami witaminy D3. Interesującym zagadnieniem jest to, jaki jest względny udział monocytowego źródła 1,25(OH)2D3 w całkowitym poziomie 1,25(OH)2D3. Dusso i wsp. zaobserwowali, że maksymalna produkcja 1,25(OH)2D3 z monocytów jest trywialna (w fmole/godzinę/mikrogram DNA) w porównaniu do stężenia 1,25(OH)2D3 w normie (w pmol/mL). Jednak dane pochodzą z eksperymentu ex vivo, nie wiemy jak wiele monocytów w organizmie jest stymulowanych do produkcji 1,25(OH)2D3. Spekulujemy, że względny wkład monocytowego źródła 1,25(OH)2D3 do całkowitego poziomu 1,25(OH)2D3 jest niewielki w większości okoliczności. Nawet u pacjentów z chorobą ziarniniakową tylko nieliczni mają kliniczne objawy hiperkalcemii wynikającej z wysokiego poziomu 1,25(OH)2D3. Nasz przypadek wskaźnikowy jest jednym z nich.
Stwierdziliśmy również, że gdy monocyty od pacjentów z aktywną gruźlicą są hodowane z antygenem MTB, konwersja 1,25(OH)2D3 jest znacznie niższa niż w przypadku braku dodatku antygenu. W grupie częstych kontaktów z gruźlicą, nie było różnicy między byciem z antygenem MTB lub bez niego. Istnieją dwa możliwe wytłumaczenia tej obserwacji. Po pierwsze, primed monocyty od pacjentów z aktywną gruźlicą mogą indukować więcej aktywności hydroksylazy 24(OH) (CPY24) niż ich odpowiedniki, która aktywnie hydroksyluje 1,25(OH)2D3 do kwasu kalcytoniowego, gdy są dalej stymulowane antygenem MTB. witamina D3 indukuje nie tylko produkty genowe zapalenia, ale także ekspresję CPY24. CPY24 jest głównym enzymem katabolicznym witaminy D3. Aktywność CYP27B1 i CYP24 jest modulowana w diametralnie różny sposób, aby kontrolować poziom 1,25(OH)2D3 w surowicy. Dzięki temu skoordynowanemu działaniu hiperkalcemia jest rzadko obserwowana u pacjentów. W grupie częstych kontaktów z gruźlicą wykazano jeszcze lepiej skoordynowane działanie, dlatego nie obserwowano zmian w przemianie 1,25(OH)2D3 po stymulacji antygenem MTB. Drugim wyjaśnieniem jest to, że aktywność CPY27B1 jest wyczerpana, gdy monocyty są ponownie stymulowane antygenem MTB.
Ekspresja mRNA nie została określona w tym badaniu z następujących powodów. Po pierwsze, do próby biologicznej ex vivo wymagana była duża liczba monocytów pochodzących od uczestników. Gdybyśmy przeprowadzili zarówno ilościową ekspresję mRNA, jak i badanie biologiczne ex vivo, musielibyśmy pobrać ponad 30 mL krwi od każdego uczestnika. Pobranie takiej objętości krwi zostało odrzucone przez naszą komisję etyczną. Po drugie, jak wskazano wcześniej, niektóre tkanki mogą wykazywać ekspresję CYP27B1 bez wykrywalnej aktywności enzymatycznej. poziomy mRNA nie zawsze są skorelowane z aktywnością enzymatyczną. Pomimo ekspresji CYP27B1 w niektórych tkankach, nie wykryto aktywności enzymatycznej. W przyszłych badaniach należy oznaczyć poziomy CYP27B1 i CYP24 oraz metabolitów witaminy D3, takich jak kwas kalcytroinowy i 24,25(OH)2D3, w celu wyjaśnienia metabolizmu witaminy D3 w procesie patofizjologicznym gruźlicy.
5. Wnioski
W podsumowaniu, poziomy wapnia korelowały z poziomami 1,25(OH)2D3 u pacjenta z mocznicą zakażonego gruźlicą. Ponadto stwierdziliśmy, że aktywność CYP27B1 w monocytach jest wyższa u pacjentów z aktywną gruźlicą niż u tych z częstym kontaktem z gruźlicą.
Zatwierdzenie etyczne
Ten projekt badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Hospital. Numer zatwierdzenia to KMUH-IRB-20130103.
Konflikt interesów
Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów dla tej pracy.
Wkład autorów
Yi-Ching Tung i Wen-Chan Tsai przeprowadzili eksperymenty i napisali pracę. Tsan-Teng Ou i Wen-Chan Tsai zaprojektowali badania i zebrali okazy. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję pracy.
.