Abstract
Disaccharidases (DS) are brush border enzymes embedded in the microvillous membrane of small intestinal enterocytes. W nieleczonej celiakii (CD) obserwuje się ogólne obniżenie aktywności DS. W niniejszym artykule omówiono różne aspekty aktywności DS w CD: ich przydatność w diagnostyce oraz zastosowanie w testach toksyczności in vitro. Te ostatnie nigdy nie były wykorzystywane w badaniach nad CD. Jednakże, dzięki ostatnim postępom w technice organoidów jelita cienkiego, DS może być wykorzystana jako biomarker w badaniach in vitro. Obejmuje to tworzenie samoodnawiających się komórek nabłonkowych wyhodowanych z tkanki, które wykazują ekspresję markerów różnicowania, w tym enzymów granicy szczoteczkowej. Określenie aktywności DS w dwunastnicy może dostarczyć dodatkowych informacji podczas diagnostyki CD: (i) ilościowego określenia nasilenia obserwowanych zmian histologicznych, (ii) dostarczenia wartości predykcyjnych dla stopnia zaniku kosmków błony śluzowej oraz (iii) ułatwienia rozpoznania CD w przypadku, gdy widoczne są niewielkie zmiany histologiczne. DS mogą również dostarczyć dodatkowych informacji do oceny odpowiedzi na dietę bezglutenową, gdyż wyraźny wzrost ich aktywności następuje po 4 tygodniach od jej rozpoczęcia. Różne endogenne i egzogenne czynniki wpływające na DS mogą być również istotne przy rozważaniu badania roli DS w innych schorzeniach, w tym w nieceliakalnej wrażliwości na gluten i niedoborach DS.
1. Wprowadzenie
W niektórych osobach objawy żołądkowo-jelitowe, w tym biegunka, są związane z przyjmowaniem pewnych form węglowodanów w diecie. Objawy są przypisywane do jednego lub wielu niedoborów enzymów błony śluzowej jelita cienkiego, które hydrolizują disacharydy. Obejmują one niedobór laktazy (typ wrodzony i dorosły), niedobór sacharazy-izomaltazy, niedobór maltazy-glukoamylazy i niedobór trehalazy. Z wyjątkiem niedoboru laktazy u dorosłych, inne wymienione wyżej niedobory występują stosunkowo rzadko. Inne schorzenia, w tym celiakia (CD), których skutkiem jest uszkodzenie jelita cienkiego, mogą powodować obniżenie aktywności disacharydaz (DS). Zasugerowano również, że wtórne niedobory DS mogą ewentualnie odpowiadać za objawy u pacjentów z CD, którzy mają nienaruszone kosmki .
Laktoza, która jest trawiona przez enzym laktazę na granicy szczoteczek jest jednym ze słabo wchłanianych krótkołańcuchowych węglowodanów, często określanych jako FODMAPs (fermentowalne, oligo-, di-, monosacharydy i poliole). Wykazano, że zmniejszenie spożycia FODMAP poprawia objawy żołądkowo-jelitowe u pacjentów z nieceliakalną nadwrażliwością na gluten (NCGS). Wykazano, że składniki inne niż gluten w pszenicy mogą być ważne w NCGS, a mianowicie inhibitor amylazy-trypsyny . Brak biomarkerów dla tego stanu może skłonić badaczy do zbadania potencjalnej roli enzymów granicy szczoteczkowej, takich jak laktaza.
W nieleczonej CD obserwuje się ogólny spadek aktywności DS . Przed pojawieniem się testów serologicznych, aktywność DS w jelicie cienkim była ważnym parametrem laboratoryjnym pomocnym w diagnostyce CD. Określenie aktywności poszczególnych DS ma również kluczowe znaczenie w diagnostyce różnicowej wrodzonych zaburzeń metabolicznych. Pomiar ich aktywności pozwala na rozróżnienie pierwotnych i wtórnych niedoborów DS. Pierwotne typy niedoborów DS stanowią „wrodzone błędy metabolizmu” określonego enzymu. Przykładem tego jest wrodzony niedobór laktazy, w którym występują prawidłowe poziomy maltazy i sacharazy przy obniżonym poziomie laktazy. CD jest wtórnym niedoborem DS, ponieważ wszystkie DS są zmniejszone z powodu wywołanego przez gluten uszkodzenia błony śluzowej jelita cienkiego .
Wyraźny wzrost aktywności DS występuje cztery tygodnie po rozpoczęciu diety bezglutenowej (GFD), ale ich aktywność jest ponownie zmniejszona, jeśli pacjenci z celiakią powrócić do normalnej diety . U pacjentów z leczoną CD, wewnątrzprzewodowe podanie glutenu wywołuje charakterystyczne zmiany histologiczne i związane z tym znaczne zmniejszenie aktywności disacharydaz w ciągu 3,5 godziny. Zmniejszenie aktywności DS koreluje z histologicznym stopniem biopsji, tak że DS może być zastosowane jako biomarker CD.
Ten manuskrypt przegląda różne aspekty aktywności DS w CD: ich użyteczność w diagnostyce i ich zastosowanie do testowania toksyczności in vitro. Ponadto opisujemy ostatnie postępy w technice organoidów jelita cienkiego, w tym kokultury z komórkami immunologicznymi, które oferują ekscytującą możliwość opracowania najnowocześniejszych modeli in vitro do badań nad CD. W tym modelu enzymy z granicy szczoteczek mogłyby być wykorzystane jako markery patogenezy CD.
2. Diagnostyczne aspekty aktywności disacharydaz jelita cienkiego w CD
Złotym standardem w diagnostyce CD i śledzeniu efektów GFD jest badanie biopsji dwunastnicy w połączeniu z serologią CD, w tym transglutaminazą tkankową. Pomiar aktywności DS dostarcza dodatkowych informacji w momencie diagnozy i podczas obserwacji w celu oceny odpowiedzi na GFD. Ponadto wykazano, że oznaczanie aktywności DS może pomóc w rozpoznaniu CD, gdy obserwuje się łagodniejsze zmiany histologiczne, w tym nieprawidłowości typu Marsh I i II w biopsjach jelita cienkiego .
2.1. Positive and Negative Predictive Values of Mucosal Villous Atrophy
Pomiar aktywności enzymów na granicy szczotki oferuje dodatkowe obiektywne narzędzie do oceny nasilenia nieprawidłowości histologicznych u nieleczonych pacjentów z celiakią . Aktywność DS w dwunastnicy jest dobrym predyktorem stopnia zaniku kosmków śluzówki w CD. Pozytywne wartości predykcyjne dla umiarkowanego lub ciężkiego zaniku kosmków są następujące:(i)90% dla maltazy (maltaza U/g białka)(ii)86% dla sacharazy (<40 U/g białka)(iii)71% dla laktazy (<20 U/g białka).
Zmniejszona aktywność maltazy i sacharazy ma zatem wysoką pozytywną wartość predykcyjną dla stopnia zaniku kosmków śluzówki. Wartości predykcyjne aktywności laktazy są niższe, prawdopodobnie z powodu obecności pierwotnego niedoboru laktazy u pacjentów z celiakią. Żaden pacjent z aktywnością DS w normalnym zakresie nie wykazywał ciężkiego zaniku kosmków .
2.2. Mucosal Healing in CD with a Gluten-Free Diet (GFD)
Jest dobrze znane, że aktywność enzymów na granicy szczotki jest zmniejszona u nieleczonych pacjentów z celiakią. Jednakże, aktywność ta wzrasta podczas remisji, zwłaszcza po czterech tygodniach od rozpoczęcia GFD. Ważne jest, aby zauważyć różne reakcje między DS a GFD; występuje wyraźny wzrost aktywności alfa glukozydaz, podczas gdy aktywność laktazy pozostaje niska u wielu pacjentów. Peña i wsp. wykazali, że odpowiedź laktazy na GFD jest zmienna, czasami wykazując pełny powrót do zdrowia w ciągu kilku miesięcy, ale czasami pozostając w depresji przez lata. Wiek pacjenta ma duże znaczenie w szybkości odzyskiwania aktywności laktazy. Pacjenci w wieku poniżej 30 lat zwykle wykazują pełny powrót do zdrowia w ciągu kilku miesięcy, podczas gdy większość starszych pacjentów wykazuje niewielki lub żaden powrót do zdrowia w tym okresie czasu. Utrzymywanie się niskiej aktywności laktazy pomimo dobrej poprawy histologicznej wykazano w innych badaniach w przypadku niektórych pacjentów, zwłaszcza dorosłych .
Z wyjątkiem laktazy, pomiar DS może stanowić ilościowy wskaźnik poprawy stanu błony śluzowej jelita cienkiego; ich wzrost dobrze koreluje z poprawą stanu błony śluzowej na podstawie histologii biopsji jelita cienkiego . Poza obserwacją histologiczną i serologiczną, pomiar aktywności DS stanowi dodatkowe potencjalne narzędzie do oceny leczenia CD za pomocą GFD. Aktywność sacharazy jest najlepszym wskaźnikiem odpowiedzi błony śluzowej na GFD. Interesujące jest jednak, że nawet po dwóch latach leczenia CD za pomocą GFD, aktywność sacharazy w dystalnej części dwunastnicy nie wzrasta do poziomu kontroli, chociaż efekty kliniczne obserwuje się wcześniej. Generalnie, aktywności enzymów w błonie śluzowej jelita cienkiego u pacjentów z CD w remisji są niższe niż w grupach kontrolnych dobranych pod względem wieku, płci i miejsca biopsji. Jednak pacjenci z celiakią na GFD mają znacznie zwiększone poziomy maltazy i sacharozy, ale ograniczony wzrost aktywności laktazy w porównaniu z grupą nieleczoną. Warto wspomnieć, że ścisłe GFD jest leczeniem z wyboru nie tylko w przypadku CD, ale także w przypadku związanych z CD wtórnych niedoborów DS .
2.3. Rozpoznanie CD z punktacją Marsh I/II w biopsjach błony śluzowej jelita cienkiego (subkliniczna CD)
W biopsjach błony śluzowej jelita cienkiego z punktacją Marsh I i/lub II nie stwierdza się zaniku kosmków. Zanik kosmków stanowi jedynie końcowy etap w klinicznym przebiegu choroby; CD rozwija się stopniowo od zapalenia błony śluzowej jelita cienkiego do hiperplazji krypt i wreszcie do zaniku kosmków .
Łagodniejsze zmiany biopsyjne, które są ograniczone do nacieku limfocytarnego z hiperplazją krypt lub bez niej, mogą wymagać dodatkowych danych w celu zwiększenia pewności rozpoznania CD, ponieważ te zmiany histologiczne nie są charakterystyczne wyłącznie dla CD. Rozpoznanie CD może być wzmocnione przez genotypowanie (HLA-DQ2 lub HLA-DQ8); markery serologiczne i barwienie immunohistochemiczne limfocytów śródnabłonkowych γδ+ve występujących u pacjentów z CD mogą być również stosowane w celu potwierdzenia rozpoznania .
Uszkodzenie mikrokosmków może być jedną z najwcześniejszych zmian wywołanych glutenem w CD . Dlatego zmiany biochemiczne mogą poprzedzać nieprawidłowości histologiczne biopsji dwunastnicy obserwowane w mikroskopii świetlnej. Murray i wsp. donieśli o rozpoznaniu CD w powtórnej biopsji u 4 z 37 (10,8%) pacjentów, którzy nie mieli atrofii kosmków w początkowej biopsji kilka lat wcześniej. Jednak ci czterej pacjenci mieli obniżoną aktywność DS i niewielkie zmiany histologiczne (Marsh I lub II) w pierwotnej biopsji. Zmniejszona aktywność DS bez zaniku kosmków może zatem reprezentować wczesną CD .
Mones i wsp. zaobserwowali znaczne zmniejszenie aktywności DS u pacjentów pediatrycznych z CD, u których zmiany histologiczne w biopsji jelita cienkiego oceniono jako Marsh I lub II (z nienaruszonymi kosmkami). Pozytywny test dla przewidywania CD został zdefiniowany przez następujące wartości odcięcia dla poszczególnych aktywności DS: laktaza, ≤15 jednostek/g białka; sacharoza, ≤25 jednostek/g białka; maltaza, ≤100 jednostek/g białka; i palatynaza, ≤5 jednostek/g białka. Czułość diagnostyczna wahała się od 74% do 85%, przy czym najwyższą czułość zaobserwowano dla laktazy. Swoistość diagnostyczna wahała się od 57% do 91%, z najwyższą swoistością dla sacharazy. Pozytywna wartość predykcyjna niedoboru DS dla CD wahała się od 70% do 91%. Negatywna wartość predykcyjna (prawidłowy poziom DS) wynosiła od 72% do 76%, aby przewidzieć biopsję nie uznaną za CD. Niedobór DS stwierdzony w biopsji dwunastnicy może zatem pomóc w rozpoznaniu CD w biopsji z nienaruszonymi kosmkami. Podobne wyniki uzyskano w innym badaniu, w którym ocena aktywności DS dostarczyła dowodów na poparcie diagnozy CD u niektórych pacjentów.
3. Aspekty badawcze aktywności disacharydaz w celiakii
Aktywność DS w biopsjach błony śluzowej jelita cienkiego można określić metodą Dahlqvista. Tkankę inkubuje się z odpowiednim disacharydem, a uwolnioną glukozę oznacza się metodą kolorymetryczną przy użyciu odczynnika TRIS – oksydazy glukozy. Jednostki aktywności DS są wyrażone jako mikromole disacharydu hydrolizowanego w ciągu minuty na gram błony śluzowej (mokrej masy) .
3.1. Czynniki wpływające na aktywność enzymów
DS są zmniejszone w aktywnej celiakii. Mogą one być zmniejszone w innych stanach chorobowych, w tym w nieswoistych zapaleniach jelit, alergii pokarmowej, dyspepsji, zaburzeniach wchłaniania białkowo-energetycznego, niedoborach odporności i chorobach zakaźnych (takich jak giardioza, infekcje wirusowe i przerost bakterii jelita cienkiego). Obniżenie aktywności DS może być zwykle odwrócone przez skuteczne leczenie choroby podstawowej. Co ciekawe, DS może być również nieprawidłowo zwiększona u pacjentów z cukrzycą. Zmniejszenie poszczególnych niedoborów DS jest widoczne w pierwotnych niedoborach DS, które obejmują wrodzoną nietolerancję laktozy, niedobór sacharazy-izomaltazy, niedobór maltazy-glukoamylazy i niedobór trehalazy .
W zdrowych osobach, aktywności DS mogą wykazywać szeroki zakres wartości bezwzględnych . Istnieje kilka endogennych i egzogennych czynników, które wpływają na ich aktywność.
3.1.1. Czynniki endogenne
Aktywność DS zmienia się wzdłuż osi podłużnej (dwunastnica-junum-jelito) jelita. Laktaza wykazuje maksymalną aktywność w odległości 50-200 cm od więzadła Treitza i jest prawie nieobecna w dystalnym jelicie krętym. Aktywność sucrazy jest stała w całym jelicie cienkim. Maltaza jest dwukrotnie bardziej obfite w dystalnym jelicie krętym w porównaniu do tego w proksymalnym jelita czczego .
Ethnicity wpływa na wartości DS, jak wykazano podczas porównywania afrykańskich i fińskich dzieci z normalną architekturą villous; pierwszy miał niższe aktywności dwunastnicy laktazy, sacharozy i maltazy. Około jedna trzecia fińskich dzieci wykazuje aktywność laktazy poniżej ustalonego zakresu referencyjnego 20 U / g białka, w przeciwieństwie do dwóch trzecich afrykańskich dzieci .
Seks nie wpływa na żadną z aktywności DS . Wiek ma znaczący wpływ tylko na aktywność laktazy; zmniejsza się z wiekiem. U niektórych czarnych dzieci niedobór laktazy może rozwinąć się po 3 roku życia i nie jest związany z chorobą błony śluzowej .
Rytm okołodobowy wpływa na aktywność DS . Ponadto, oscylacje aktywności DS korelują z rytmem przyjmowania pokarmu .
Płatowe zmiany błony śluzowej, które mogą wystąpić w CD, wpływają na wartości bezwzględne aktywności DS stwierdzane w biopsjach. Jonsson i wsp. wykazali, że istnieje około 30% współczynnik zmienności w aktywności DS w próbkach pobranych z dwóch miejsc w dwunastnicy.
3.1.2. Czynniki egzogenne
Wiadomo, że karmienie sacharozą powoduje wzrost aktywności sacharozy-izomaltazy. Wzrost ten jest wynikiem syntezy de novo enzymu, który osiąga swój szczyt (2,6-krotny wzrost) 12 godzin po rozpoczęciu diety zawierającej sacharozę. Degradacja enzymu jest niezależna od diety .
Żołądek utrudnia odnowę komórek nabłonka jelitowego. Powoduje zmniejszenie masy jelita cienkiego, wielkości kosmków i indeksu mitotycznego enterocytów krypt. Pozbawienie węglowodanów wywołuje spadek sacharazy jelitowej, który jest przywrócony przez karmienie węglowodanami .
Poziomy DS różnią się również w zależności od miejsca biopsji. Odnosi się to nie tylko do osi podłużnej (dwunastnica-junum-jelito) w jelicie cienkim, ale także do osi krypta-wiosna. Ponieważ DS są osadzone w mikrokosmkach enterocytów kosmków, ich aktywność zależy od liczby enterocytów kosmków obecnych w bioptacie, tak więc bardziej powierzchowne bioptaty o większej zawartości nabłonka mogą mieć większą zawartość DS.
3.2. Ex Vivo and In Vitro Methods for Studying Gluten Toxicity in Coeliac Disease
Nie istnieje model zwierzęcy odtwarzający wszystkie cechy celiakii. Badania in vivo są złotym standardem dla oceny toksyczności celiakii . Jednak dobrze wiadomo, że podawanie glutenu in vivo może powodować ogólnoustrojowe uszkodzenie pacjenta. Dlatego metody in vitro są zwykle stosowane przed podjęciem badań in vivo przy ocenie środków spożywczych pod kątem braku toksyczności CD .
Najbardziej wiarygodną metodą in vitro jest hodowla biopsji błony śluzowej jelita cienkiego, często określana jako hodowla narządowa biopsji dwunastnicy (OC). Metoda ta została pierwotnie opisana przez Browninga i Triera. Istnieje duże zapotrzebowanie na przedkliniczne badania in vitro, więc zasada metody Browninga i Triera została rozwinięta i zastosowana do testowania probiotyków, co wymaga apikalnej stymulacji eksplantatów błony śluzowej jelita. OC umożliwia różne inne zastosowania, na przykład biochemiczne badania syntezy i przetwarzania DS, składania dimerów DS oraz badanie wpływu insuliny na podwyższoną aktywność DS u osób z cukrzycą. Oryginalna metoda Browninga i Triera została zmodyfikowana w taki sposób, że system wykrywa szkodliwe działanie glutenu poprzez dodanie go do podłoża hodowlanego i ocenę późniejszych nieprawidłowości histologicznych, morfologicznych i immunologicznych. Zmodyfikowana technika Browninga i Triera jest nadal szeroko stosowana w badaniach nad patogenezą CD oraz w testach na toksyczność celiakii. Wykazano również, że system OC jest przydatny w diagnostyce CD, głównie w przypadkach bez atrofii kosmków lub u pacjentów seronegatywnych.
3.2.1. Early Work on Small Intestinal Organ Culture and the Study of Brush Border Enzymes in CD
Uszkodzenie enterocytów jest cechą charakterystyczną celiakii . Toksyczny wpływ glutenu na błonę śluzową jelita cienkiego został wykazany biochemicznie poprzez pomiar aktywności enzymu granicy szczotki – fosfatazy alkalicznej (AP) w OC. Aktywność AP uzyskanej z biopsji nieleczonych pacjentów z CD wzrastała, gdy tkanka była inkubowana w podłożu bezglutenowym. Wzrost ten był hamowany przez obecność peptydów glutenu w podłożu hodowlanym, wykazując toksyczne działanie glutenu .
Katz i Falchuk zaproponowali następnie wykorzystanie techniki OC jelita cienkiego jako testu predykcyjnego do ostatecznego rozpoznania wrażliwości na gluten. Dwudziestu dwóch z 26 pacjentów, u których zdiagnozowano CD, wykazało wrażliwość na gluten in vitro na swoich początkowych biopsjach. Wzrost aktywności AP w tkance jelitowej od tych 22 pacjentów był hamowany przez obecność peptydów glutenu w medium. Wskaźnik fałszywie ujemny dla ustalenia rozpoznania CD wynosił zatem 15% (4 z 26). W ich badaniu było również 14 pacjentów z nieprawidłową błoną śluzową, u których nie stwierdzono CD. Trzynastu z nich nie wykazywało wrażliwości na gluten in vitro (wskaźnik fałszywie dodatni 7%). Wszyscy pacjenci z prawidłowymi biopsjami zostali prawidłowo sklasyfikowani. Te ekscytujące wyniki sugerują, że hodowla narządów jelita cienkiego może być wykorzystana do prospektywnej diagnostyki CD. W innym badaniu, Falchuk i wsp. ponownie wykazali wrażliwość na gluten in vitro u pacjentów z aktywną CD. Zasugerowali również istnienie różnic w zależności od typu zgodności histologicznej badanych.
Inni badacze podjęli podobne badania OC, mierząc aktywność AP i innego enzymu z granicy szczoteczkowej α-glukozydazy. Howdle i wsp. oraz Hauri i wsp. nie mogli odtworzyć in vitro wpływu glutenu na biopsje dwunastnicy od nieleczonych pacjentów z CD ani poprzez ocenę aktywności AP lub α-glukozydazy.
Mitchell i wsp. wykazali, że podczas OC dochodzi do stopniowej utraty białek z tkanki. Równocześnie zmniejsza się poziom enzymów granicy szczoteczkowej i gromadzi się w medium. Dlatego zaproponowali wyrażanie aktywności enzymów jako mU/ml podłoża hodowlanego, w przeciwieństwie do U/g białka, ze względu na straty białek podczas hodowli organów i odzyskane aktywności enzymów w podłożu .
Kilku autorów badało białka, zawartość DNA i enzymy granicy szczotki w OC z biopsji jelita cienkiego. Większość z nich zaobserwowała spadek wszystkich tych parametrów w hodowanych biopsjach z wyjątkiem aktywności AP, która wzrosła praktycznie we wszystkich przypadkach. DS są prawdopodobnie łatwiej tracone do medium podczas hodowli niż AP .
3.2.2. Modele komórkowe i aktywność enzymów
Oprócz OC błony śluzowej jelita cienkiego u pacjentów z CD, badacze wykorzystali różne linie komórkowe do badań in vitro nad CD. Uznane modele komórkowe są oparte na wrażliwych na gluten liniach komórek T i klonach wyizolowanych od osób z CD, które są nadal szeroko stosowane w badaniach przesiewowych toksyczności CD. Znaczna ilość badań została również podjęta przy użyciu linii komórek nabłonkowych pochodzenia nowotworowego, które są stosunkowo łatwe do hodowania. Nie ustalono jednak, w jakim stopniu transformacja złośliwa wpływa na ich ewentualną zależność od otaczającego mikrośrodowiska. Wykazano, że w przeciwieństwie do prawidłowych komórek nabłonkowych, linie komórkowe raka jelita grubego nie wymagają dodatku czynników wzrostu do ich ekspansji in vitro. Ponadto, komórki Caco2 wyrażają znacznie mniejsze ilości enzymów granicy szczoteczkowej w porównaniu z normalnymi enterocytami .
Przed opublikowaniem przez Sato i wsp. ich przełomowego odkrycia dotyczącego organoidów jelitowych, enterocyty były notorycznie trudne do hodowania in vitro. Przez dziesięciolecia wiele badań normalnego nabłonka jelitowego zgłaszało trudności w utrzymaniu hodowli tych komórek przez okres dłuższy niż kilka dni (i odnośniki do nich), pomimo stosowania różnych protokołów izolacji i późniejszych warunków hodowli. Przez wiele lat uważano, że długotrwałe hodowle z pierwotnych tkanek ludzkich nie mogą być założone, chyba że komórki zostały genetycznie przekształcone. Odkryto również, że zaburzenie interakcji pomiędzy normalnymi komórkami nabłonka i otaczającą je macierzą zewnątrzkomórkową indukuje apoptozę komórek .
Quaroni i wsp. udało się jednak założyć długoterminową hodowlę komórek nabłonka jelita cienkiego szczura. Ich wstępne podejście do izolacji było takie, jak stosowane w OC, ale wyhodowane komórki nabłonkowe miały cechy niezróżnicowanych komórek krypt jelita cienkiego. Słaby poziom zróżnicowania hodowanych enterocytów in vitro był opisywany w innych badaniach z wykorzystaniem biopsji jelita ludzkiego, mysiego, szczurzego i wołowego, które są zgodne z naszymi obserwacjami (dane niepublikowane). Rusu i wsp. badali różnicowanie in vitro, oceniając specyficzne aktywności maltazy i AP w bydlęcych próbkach (a) świeżo zeskrobanego nabłonka, (b) zawiesin organoidów używanych do posiewu kultur (nie mylić z organoidami Sato) oraz (c) jelitowych kultur komórkowych, które obejmują komórki hodowane pierwotnie oraz komórki hodowane po pierwszym i drugim pasażu. Zawiesiny organoidów wykazywały 50% redukcję w odniesieniu do preparatu świeżego nabłonka. Aktywność maltazy, użytej jako marker różnicowania, wyraźnie spadała w hodowlach pierwotnych i z kolejnymi pasażami do stabilnie niskiego poziomu. Podobne wyniki uzyskano z pomiarów aktywności AP jelitowego. Wyniki te odzwierciedlały utratę różnicowania komórek in vitro .
Nabłonek jest tylko jednym (i) z czterech składników zintegrowanej jednostki funkcjonalnej, która składa się również z (ii) macierzy zewnątrzkomórkowej, (iii) komórek pochodzących z mezenchymy i (iv) czynników luminalnych. Izolacja enterocytów z ich mezenchymalnego środowiska powoduje utratę różnicowania. Nieprzekształcone ludzkie płodowe komórki jelita cienkiego hodowane na plastiku mają cechy niezróżnicowanych enterocytów kryptowych. Sekwencyjne dodanie tkanki łącznej i cząsteczek luminalnych do niezłośliwych ludzkich enterocytów płodowych in vitro wywołało spektrum zmian w typie komórek nabłonkowych w kierunku pełnego zróżnicowania. Linia komórkowa jelita cienkiego szczura również różnicowała się, jak oceniono przez znaczny wzrost aktywności sacharazy, gdy była hodowana w obecności mezenchymy. Normalny rozwój i różnicowanie nabłonka jelita cienkiego zależy zatem od interakcji z mezenchymem i innymi składnikami .
Długotrwałe hodowle normalnych pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych wyizolowanych z jelita cienkiego są obecnie dobrze ustalone. Ludzkie nabłonkowe „mini-jelita” mogą być hodowane z krypt jelitowych i pojedynczych komórek macierzystych . Możliwe jest rozmnażanie kultur organoidów in vitro, które pochodzą zarówno z jelita myszy, jak i człowieka. Te organoidy mogą być hodowane w nieskończoność i wykazują wszystkie cechy nabłonka jelita cienkiego w zakresie architektury, typów komórek i cech samoodnawiania .
Sato i wsp. zdefiniowali warunki, które promowały proliferację i różnicowanie organoidów. Komórki macierzyste, jak również organoidy musiały być osadzone w Matrigel, który jest matrycą bogatą w lamininę i kolagen, która naśladuje blaszkę podstawną. Hodowla ludzkiego jelita cienkiego jest bardziej złożona niż hodowla jelita mysiego. Oprócz R-spondin, Noggin i naskórkowego czynnika wzrostu, warunki hodowli zoptymalizowane dla człowieka wymagają większej ilości suplementów (Wnt3A, gastryna, nikotynamid, inhibitor Alk i inhibitor p38). Różnicowanie hodowanych ludzkich organoidów nabłonka małego w różne typy komórek jelita wymaga wycofania niektórych suplementów (Wnt3, nikotynamid i inhibitor p38). Marker różnicowania dla dojrzałych enterocytów został uwidoczniony przez barwienie AP na granicy szczoteczek. W innym badaniu, Middendorp i wsp. również pominęli pewne suplementy hodowlane, aby osiągnąć różnicowanie jelita cienkiego ludzkich organoidów. Co ciekawe, wizualizacja dojrzałych enterocytów przez barwienie sacharazą-izomaltazą działała dobrze dla organoidów jelita krętego, ale nie dla dwunastnicy. Ekspresja laktazy była indukowana zarówno w organoidach jelita krętego jak i dwunastnicy przez tzw. medium różnicujące .
3.2.3. Recent Advances in Intestinal Organoid Methods
Technologia organoidów jelitowych może mieć zastosowanie w terapii regeneracyjnej niektórych chorób jelit poprzez ekspansję ex vivo nabłonka jelitowego i transplantację. Ta metodologia umożliwia również rozmnażanie in vitro chorych tkanek przewodu pokarmowego, co może wyjaśnić patogenezę choroby i rozwój terapii. Organoidy jelitowe zostały już wykorzystane do modelowania chorób monogenowych, które wpływają na nabłonek, zapalnych chorób jelit (patrząc na śmierć komórek, integralność błony śluzowej i skutki cytokin zapalnych) oraz interakcji między tkankami jelitowymi i mikrobami, a także raka (i odniesienia do nich). Badania nad CD pozostają w tyle za tymi postępami. Dobrze wiadomo, że istnieje wiele typów komórek zaangażowanych w patogenezę CD i jako takie, organoidy nie posiadają wielu typów komórek obecnych w systemie in vivo. Jednakże, złożoność może być zwiększona poprzez kokulturę z komórkami immunologicznymi. Nozaki i wsp. opisali kokulturę organoidów murine i limfocytów śródnabłonkowych (IELs), w której zarówno komórki αβT jak i γδT proliferowały z powodzeniem i były tak samo ruchliwe jak IELs rezydujące w warunkach in vivo. Kokultury organoidów zostały również opisane dla jelitowego układu nerwowego i miofibroblastów .
Dzięki postępom w badaniach serologicznych i genetycznych w diagnostyce celiakii, biopsja dwunastnicy może nie być już wymagana dla wielu pacjentów. W związku z tym, materiał do biopsji stanie się rzadki. Jednakże, organoidy jelitowe mogą być również generowane z embrionalnych komórek macierzystych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (i odniesienia do nich), które, chociaż wymagają więcej czasu na ustanowienie i są technicznie bardziej wymagające i kosztowne w przeciwieństwie do organoidów pochodzących z biopsji, mogą znacznie zwiększyć liczbę powstałych organoidów i pozwolić na wykorzystanie materiału klinicznego do hodowli komórek odpornościowych.
3.2.4. Relevance of Intestinal Organoid Work and Brush Border Enzymes to the Development of State-of-the-Art In Vitro Methods for CD Research
Dobrze wiadomo, że w patogenezie CD uruchamiane są wrodzone i adaptacyjne reakcje immunologiczne; jednak dokładna sekwencja tych patologicznych zdarzeń nie została do tej pory wyjaśniona. Technologia organoidów, jednakże, pozwala na sekwencyjne dodawanie komórek do kokultury, umożliwiając w ten sposób badanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej poprzez odtworzenie organoidów celiakii i IELs oddzielnie od efektów adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Z kolei komórki T specyficzne dla glutenu, które mogą być również hodowane in vitro, mogą być następnie włączone do tego modelu in vitro CD w celu ułatwienia pełnego toksycznego wpływu glutenu na nabłonek jelitowy.
Technologia organoidów umożliwia również wyjaśnienie roli enterocytów w przetwarzaniu peptydów gliadyny w CD. Enterocyty mają zdolność funkcjonowania jako komórki prezentujące antygen, przy czym stymulacja komórek T jest pośredniczona przez ich cząsteczki HLA-DR. Co więcej, gliadyna zawiera peptydy, które mogą wywoływać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. Co ciekawe, peptyd glutenu, który wyzwala wrodzoną odporność w celiakii, jest inaczej przetwarzany w enterocycie w porównaniu z peptydami wyzwalającymi adaptacyjną odpowiedź immunologiczną, w której peptydy docierają do późnych endosomów HLA-DR dodatnich i są prezentowane komórkom T lamina propria. Ponieważ uszkodzenie granicy szczoteczkowej enterocytów jest jedną z najwcześniejszych zmian w CD, DS może być wykorzystana do badania toksycznego działania glutenu w CD. Należy zauważyć, że enzymy granicy szczoteczkowej są integralną częścią dojrzałych enterocytów kosmków i są ilościowo związane z ich różnicowaniem. Aktywność DS może jednak nie korelować z żywotnością enterocytów, ponieważ aktywność enzymów granicy szczoteczek wykazano w nieżywotnych komórkach nabłonka. W związku z tym, barwienie immunologiczne, a dokładniej brak barwienia immunologicznego dla enzymów na granicy szczotki spowodowany raczej zniszczeniem mikrokosmków niż ich aktywnością, może być stosowany jako marker patogenezy CD.
Technologia organoidów ma znaczny potencjał w modelowaniu choroby, a tym samym w wyjaśnianiu sekwencji zdarzeń patogenetycznych w CD, w których enzymy na granicy szczotki mogą być wykorzystywane. Nowe modele in vitro oparte na ostatnich postępach w badaniach nad komórkami macierzystymi mogą ułatwić opracowanie nowych strategii terapeutycznych w CD.
4. Wnioski
Struktura błony śluzowej jelita cienkiego i związane z nią procesy fizjologiczne są bardzo złożone. CD zwiększa tę złożoność, wpływając na wiele elementów jelita, w tym na DS. Pomimo faktu, że działania DS odgrywają ważną rolę w diagnostyce CD, zastosowanie działań DS w badaniach in vitro w CD nie zostało jeszcze ustalone. Ostatnie postępy w hodowli ex vivo nabłonkowych „mini-jelit” stanowią nową, ekscytującą platformę, która stała się dostępna. Umożliwia ona badanie prawidłowego lub chorego nabłonka za pomocą inżynierii tkankowej. Komórki nabłonka rosną i różnicują się w określonych warunkach, które obejmują obecność macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników wzrostu. Samoodnawiająca się populacja komórek nabłonka wykazuje ekspresję enzymów granicy szczoteczek, które mogą być wykorzystane w badaniach in vitro nad CD, gdy do modelu zostaną wprowadzone inne komórki odpornościowe.
Konflikt interesów
Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr H. Julii Ellis za pomocne dyskusje i przejrzenie manuskryptu. Tanja Šuligoj chciałaby podziękować Clinical Research Trust za wsparcie. Borut Božič chciałby podziękować za częściowe wsparcie finansowe ze strony Słoweńskiej Fundacji Nauki, Grant no. SZF-BBozic01/2007.