Cykl GroEL/GroES: ATP wiąże się do otwartego pierścienia przed białkiem substratowym sprzyjając wiązaniu białka i wytwarzaniu stanu natywnego

Results

Rapid ATP Binding to GroEL as Revealed by Fluorescence Intensity Changes of GroEL F44C Labeled with Oregon Green 488.

Aby monitorować wiązanie ATP przez GroEL, oparliśmy się na wcześniej wytworzonym wariancie GroEL, F44C, zawierającym pojedynczą cysteinę w skądinąd „zerowej cysteinowo” wersji GroEL, w której wszystkie 3 naturalne cysteiny w podjednostce GroEL (aminokwasy 138, 458 i 519) zostały zastąpione alaniną (21). Jak pokazano na Rys. 1A, F44 leży w pętli skierowanej w górę do centralnej wnęki GroEL na poziomie domeny równikowej, umieszczonej pomiędzy równikowymi antyrównoległymi pasmami β, w pobliżu których końców znajdują się reszty tworzące wiązania wodorowe z końcowym fosforanem związanego ATP poprzez cząsteczkę wody i jon potasu. Pętla i reszta 44 są więc przystosowane do wpływu braku i obecności ATP. Wcześniejsze badanie wykazało, że substytucja F44W może wpływać na wiązanie ATP (16). Tutaj użyliśmy mutanta F44C, który wcześniej został zaobserwowany jako w pełni funkcjonalny, na co wskazuje zdolność jego kodującego plazmidu do ratowania wzrostu mutanta z niedoborem GroEL oraz zdolność oczyszczonego białka do przeprowadzania wydajnego, zależnego od ATP/GroES ponownego składania białka in vitro (21). F44C był znakowany zielenią Oregon 488 (OG488)-maleimidem do poziomu ≈70% zajętości. Pozostał on w pełni funkcjonalny w pośredniczeniu w ponownym składaniu dehydrogenazy jabłczanowej (MDH) in vitro, wykazując kinetykę niemal identyczną z kinetyką WT GroEL . Tempo obrotu ATP w stanie ustalonym przez zmodyfikowanego mutanta, nazwanego EL44-OG, również przypominało to z WT GroEL (Rys. S1B).

Fluorescencyjne widma emisyjne EL44-OG (wzbudzone przy 496 nm) ujawniły, że dodanie ATP spowodowało duży spadek intensywności fluorescencji w stanie ustalonym (≈65% w 500 μM ATP), któremu towarzyszyło niewielkie niebieskie przesunięcie maksimum emisji (Fig. 1B). Natomiast ADP powodował mniejszy spadek intensywności, co potwierdza, że γ-fosforan ATP ma specyficzny wpływ na konformację pętli zawierającej 44.

Po zatrzymaniu mieszania 0,5 mM ATP z EL44-OG obserwowano szybki spadek intensywności emisji, z krzywą, którą można było dopasować jako sumę 2 wykładników, jednego o stałej szybkości ≈100 s-1 i drugiego o stałej szybkości 4 s-1 (Rys. 1C). Pierwsze tempo wskazuje na szybką interakcję ATP z nieligandowanym GroEL i odpowiada tempom podanym wcześniej zarówno dla F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1), jak i dla 2 innych wersji GroEL podstawionych tryptofanem: Y485W, gdzie tryptofan został podstawiony w innym miejscu domeny równikowej (ref. 18; 123 ± 2 s-1). 18; 123 ± 2 s-1), oraz R231W (ref. 17; 80 s-1), gdzie tryptofan został podstawiony w kierunku wnęki domeny apikalnej (GroEL jest pozbawiony tryptofanu). Zgodnie z oczekiwaniami, szybkość oddziaływania ATP z EL44-OG była zależna od stężenia ATP (Rys. 1D), a dla szybszej fazy wyznaczono bimolekularną stałą szybkości 2 × 105 M-1 s-1. Wolniejsza faza kinetyczna, również zależna od stężenia ATP, prawdopodobnie odpowiada trzeciej fazie fluorescencji obserwowanej dla GroEL’s R231W i Y485W na wiązaniu ATP (17, 18). Możliwość, że ta faza odzwierciedlała hydrolizę ATP została wykluczona przez zastosowanie chaperoniny z defektem hydrolizy D398A/EL44-OG.

Equally Rapid Fluorescence Change on ATP Binding to Open Trans Ring of GroEL/GroES/ADP Asymmetrical Complex.

W warunkach fizjologicznych normalnym stanem akceptorowym dla ATP jest otwarty pierścień trans asymetrycznego kompleksu GroEL/GroES/ADP. Przy mieszaniu w zatrzymanym przepływie zaobserwowaliśmy, że szybkość wiązania ATP do pierścienia trans kompleksów EL44-OG/GroES/ADP była podobna do tej do nieligandowanego pierścienia GroEL (Fig. 1E, porównaj z Fig. 1F). W tym przypadku występowała również zależność od stężenia ATP, przypominająca zależność od stężenia nieligandowanego EL44-OG (Rys. 1D).

Polipeptyd substratowy związany z pierścieniem trans nie wpływa na szybkość wiązania ATP.

W wielu badaniach in vitro nierodzimy polipeptyd był najpierw kompleksowany z otwartym pierścieniem trans asymetrycznego kompleksu ADP GroEL/GroES przed dodaniem ATP i nadmiaru GroES (8, 9). W tych warunkach wiązanie ATP, a następnie wiązanie GroES jest wyraźnie zdolne do enkapsulacji nierodzimego polipeptydu i kierowania produktywnym fałdowaniem. Czy szybkość wiązania ATP w takim kontekście zależy od związanego białka substratowego? Aby to sprawdzić, nierodzimy MDH został związany do asymetrycznych kompleksów EL44-OG/GroES/ADP, a następnie dodano ATP z mieszaniem w zatrzymanym przepływie. W tych warunkach szybkość zmian intensywności fluorescencji była praktycznie identyczna jak w przypadku kompleksu EL44-OG/GroES/ADP przy braku polipeptydu (porównaj Rys. 1G z Rys. 1E). Tak więc, obecność nienatywnego substratu związanego z domenami apikalnymi pierścienia trans nie ma żadnego wykrywalnego wpływu na szybkie wejście ATP do równikowych kieszeni wiązania nukleotydów pierścienia trans.

Rapid Apical Domain Movement Accompanies ATP Binding.

Gdy ATP wiąże się szybko do GroEL, czy powoduje to znaczące zmiany w apikalnych domenach wiążących polipeptydy w tej samej szybkiej skali czasowej, czy też zmiany apikalne w odpowiedzi na wiązanie ATP są stosunkowo powolne, tak że efekty wiązania ATP muszą być uważane za występujące w późniejszym czasie? Już wcześniejsze badanie R231W wskazywało, że efekty apikalne występowały szybko w przypadku tego mutanta (17). W obecnym badaniu również sonda fluorescencyjna na zewnętrznym aspekcie domen apikalnych, oddalona od miejsca wiązania ATP po wewnętrznej stronie cylindra (GroEL E315C w tle zerowym cysteiny, znakowana OG), wykazała szybką zmianę intensywności fluorescencji, w tej samej skali czasowej co wiązanie ATP. Na przykład, stała szybkości 20 s-1 była obserwowana dla asymetrycznego kompleksu GroEL315-OG/GroES/ADP przy stężeniu ATP 150 μM (Rys. 1H, porównaj z 25 s-1 na Rys. 1E). Takie zmiany apikalne zachodziły w tym samym pierścieniu, z którym związany jest ATP, ponieważ analiza zmodyfikowanej OG jednopierścieniowej wersji E315C, SR315-OG, wykazała podobną szybkość zmiany intensywności fluorescencji (Rys. 1I). Szybkość ruchu apikalnego była również zależna od stężenia ATP, z szybkością równoległą do szybkości wiązania ATP (Fig. S2, porównaj z Fig. 1D).

Relatively Slow Binding of Substrate Polypeptide as Measured by FRET.

Aby umożliwić porównanie szybkości wiązania nierodzimego polipeptydu substratowego z szybkością wiązania ATP, zmierzyliśmy następnie szybkość wiązania białek substratowych do asymetrycznych kompleksów GroEL/GroES/ADP za pomocą FRET. Badaniom poddano trzy różne białka substratowe: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa) oraz podwójnie zmutowaną formę białka wiążącego maltozę (DM-MBP; 41 kDa). Wszystkie 3 białka zachowują się jak rygorystyczne białka substratowe w 25 °C, wymagając obecności GroEL, GroES i ATP, aby osiągnąć formę natywną (3). W przypadku ich braku następuje agregacja ilościowa. W celu monitorowania wiązania, mierzono FRET pomiędzy białkiem substratowym znakowanym maleimidem kumarynowo-propylowym (CPM; donor) na reszcie cysteinowej (patrz Materiały i Metody) a EL44-OG (akceptor). Przy maksimum wzbudzenia dla CPM (384 nm) zbierano widma emisyjne dla substratów znakowanych CPM (donor) podczas wiązania z nieznakowanym GroEL (Rys. 2A, DM-MBP-CPM jako przykład, czarny ślad), dla EL44-OG skompleksowanego z nieznakowanym substratem (Rys. 2A, znakowany akceptor, niebieski ślad) lub dla kompleksów z substratem znakowanym CPM związanym z EL44-OG (Rys. 2A, czerwony ślad). Zarówno dla DM-MBP-CPM, jak i MDH-CPM, występowało silne wygaszanie donora podczas asocjacji z EL44-OG; jednocześnie pojawiał się znaczny sygnał akceptora.

Po zatrzymaniu mieszania 125 nM DM-MBP-CPM z 125 nM EL44-OG obserwowano spadek intensywności emisji donora, z krzywą, którą można było dopasować jako sumę 2 wykładników, jednego o stałej szybkości 1,33 s-1 i drugiego o stałej szybkości 0,65 s-1 (Rys. 2B). Szybsze tempo (k1) było zależne od stężenia chaperoniny (Rys. 2C), natomiast wolniejsze nie. Przy stężeniu GroEL 125 nM (Rys. 2B) szybkość wiązania polipeptydu substratowego (k1 = 1,33 s-1) jest 60-krotnie wolniejsza od szybkości wiązania ATP (100 s-1 przy 500 μM ATP; Rys. 1C). Chociaż można przewidywać, że szybkość wiązania substratu byłaby kilkakrotnie większa przy fizjologicznym stężeniu GroEL wynoszącym 1-2 μM (ryc. 2C), szybkość wiązania ATP byłaby również prawdopodobnie nieco większa, biorąc pod uwagę, że fizjologiczne stężenie ATP jest kilkumilimolarne (ryc. 1D). Tak więc, szybkość przybycia ATP w warunkach fizjologicznych jest prawdopodobnie co najmniej 10-krotnie większa niż przybycie substratu.

W kolejnym teście, dodanie ATP w tym samym czasie co znakowany fluorescencyjnie DM-MBP miało powtarzalny efekt zwiększenia szybkości wiązania DM-MBP (Figura 2D i Tabela S2). Podsumowując, fizjologiczna kolejność dodawania do pierścienia trans wydaje się obejmować szybkie przybycie ATP, po którym następuje wolniejsze przybycie białka substratowego. Kolejność ta jest przeciwna do tej zaprogramowanej w ostatnich badaniach, w których polipeptyd był początkowo wiązany do pierścienia trans, a następnie dodawany był ATP (8, 9). Czy kolejność dodawania ma jakiś wymierny wpływ na ponowne składanie białka substratowego? Aby to sprawdzić, przeprowadziliśmy eksperymenty kolejności dodawania i zmierzyliśmy odzyskiwanie natywnego enzymu w warunkach zasadniczo jednokrotnego obrotu.

Więcej rozległego odzyskiwania stanu natywnego, gdy najpierw dodano ATP, a następnie polipeptyd, w porównaniu z odwrotną kolejnością.

Doświadczenie kolejności dodawania przeprowadzono przy użyciu jednopierścieniowej wersji GroEL, SR1, umożliwiającej analizę „pojedynczej rundy”. Polipeptyd wychwytywany przez SR1 jest niemal ilościowo składany do formy natywnej, po związaniu GroES, wewnątrz długotrwałej wnęki cis stabilnego kompleksu SR1/GroES (10, 11). Tak więc SR1 można inkubować z ATP i nie natywnym polipeptydem w dowolnej kolejności, a następnie dodać GroES, a stopień odzyskania natywnego białka można mierzyć zarówno w odniesieniu do kolejności dodawania, jak i do odstępu czasu pomiędzy dodawaniem (Rys. 3A). W tych testach GroES był dodawany 2 sekundy po ATP/polipeptydzie, aby umożliwić zakończenie początkowych interakcji. We wstępnym eksperymencie zaobserwowaliśmy, że gdy najpierw dodano nierodzime Rubisco, a 2 sekundy później ATP, stopień powrotu Rubisco do formy rodzimej wynosił tylko ≈30%. Porównywało się to z >60% odzyskiem, gdy najpierw dodano ATP oraz z ≈70% odzyskiem obserwowanym, gdy ATP i GroES zostały dodane do uprzednio utworzonego binarnego kompleksu Rubisco-SR1 (powstałego w wyniku 10-minutowej inkubacji nie natywnego Rubisco z SR1). Sugeruje to, że w kontekście reakcji cyklicznej, w której pierścień trans kompleksu akceptor GroEL/GroES/ADP jest otwarty i dostępny do wiązania polipeptydu tylko przez ≈1-2 s zanim GroES się zwiąże, mobilizacja jego domen wierzchołkowych przez szybkie wiązanie ATP sprzyja wiązaniu nierodzimego polipeptydu. Przeciwna kolejność, dodanie polipeptydu 2 s przed ATP, okazała się mniej korzystna dla wiązania, nawet jeśli zmobilizowane przez ATP domeny apikalne były następnie dostępne przez 2 s przed dodaniem GroES. Zauważmy, że gdy odstęp pomiędzy dodaniem Rubisco i ATP został zwiększony do 4 s (Rys. 3A), efekt kolejności dodawania został złagodzony, a kinetyka i zakres powrotu do zdrowia były takie same jak po dodaniu ATP jako pierwszego, co prawdopodobnie było funkcją bardziej intensywnego wiązania polipeptydu podczas odstępu przed dodaniem ATP. Chociaż zakres odzyskiwania Rubisco w badaniach kolejności dodawania z przerwą 2-s był znacząco zmieniony, kinetyka odzyskiwania stanu natywnego wewnątrz stabilnych kompleksów SR1/GroES była podobna, co jest zgodne z wpływem na wiązanie białek substratu, a nie na szybkość fałdowania w komorze enkapsulowanej.

Większe wiązanie Rubisco z ATP dodanym jako pierwszy.

Aby zbadać wpływ kolejności dodawania na wiązanie białek substratowych, użyliśmy Rubisco znakowanego 35S i zmierzyliśmy ilość, która została związana przez SR1 podczas inkubacji z kolejnością dodawania, używając filtracji żelowej końcowych mieszanin produktów w celu oddzielenia stabilnych kompleksów SR1/GroES/Rubisco od niezwiązanego polipeptydu. Ujawniło to, że ≈10,000 cpm 35S-Rubisco związało się, gdy 40,000 cpm 35S-Rubisco (125 nM) zostało dodane 2 sek. przed ATP i że ≈30,000 cpm związało się, gdy ATP zostało dodane 2 sek. przed Rubisco (Rys. 3B). Ten ostatni stopień wiązania uzyskano również, gdy binarne kompleksy SR1-Rubisco tworzone przez 10 min inkubowano z ATP i GroES razem (Rys. 3B). Te pomiary stopnia wiązania substratu są zatem równoległe do stopnia odzyskiwania aktywności enzymatycznej (porównaj Rys. 3B z Rys. 3A) i potwierdzają wniosek, że w kontekście 2-s przerwy między dodaniem ATP/polipeptydu, dodanie ATP początkowo sprzyja bardziej wydajnemu wiązaniu białek substratowych.

Większe tempo wiązania Rubisco do wyeksponowanego przez ATP pierścienia chaperoniny.

Powyższa obserwacja większego zakresu wiązania Rubisco w eksperymencie kolejności dodawania, w którym ATP jest dodawane początkowo, sugeruje, że tempo asocjacji Rubisco z ATP-mobilizowanymi domenami apikalnymi może być większe. Aby to sprawdzić, użyto wersji D398A SR1 z defektem hydrolizy ATP, z OG przyłączonym do cysteiny podstawionej w pozycji 44 (w tle C138A), aby zrelacjonować za pomocą FRET tempo wiązania Rubisco znakowanego CPM (Rys. 3 C-E). Zaobserwowaliśmy, że szybkość wiązania Rubisco, przeprowadzonego w tych samych warunkach, co w poprzednich eksperymentach kolejności dodawania, była 2-krotnie większa w obecności w porównaniu z brakiem ATP (porównaj Rys. 3D z Rys. 3C). Gdy ATP i nierodzime Rubisco były dodawane jednocześnie, co odzwierciedla sytuację fizjologiczną, szybkość wiązania Rubisco była podobna do tej, gdy ATP było dodane przed Rubisco (Rys. 3E, porównaj z Rys. 3D). Dane te potwierdzają, że Rubisco szybciej wiąże się z pierścieniem, którego domeny apikalne zostały zmobilizowane przez ATP, oraz że w warunkach fizjologicznych, w których obecny jest zarówno ATP jak i substrat nie natywny, to właśnie zmobilizowane przez ATP domeny apikalne są aktywne w wiązaniu substratu.