Co to jest sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym pojedynczej cząsteczki (SMRT)?

By Dr Maho Yokoyama, Ph.D.Reviewed by Christian Zerfaß, Ph.D.

Skip to:

• How does SMRT Sequencing Work?
• Studying DNA Methylation in Bacteria; an Application of SMRT Sequencing

Sekwencjonowanie DNA działa poprzez użycie polimerazy DNA do dodania nukleotydów do szablonu. Istnieje kilka technologii dostępnych do sekwencjonowania DNA. Jednym z takich przykładów jest sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym (ang. Single-Molecule Real-Time sequencing, SMRT sequencing).

Badacz badający przezroczyste szkiełko sekwencji DNA. Credit: Shawn Hempel /

Jak działa sekwencjonowanie SMRT?

Jak w przypadku innych technologii sekwencjonowania DNA, pierwszym krokiem po ekstrakcji DNA jest przygotowanie „biblioteki”. Proces ten przygotowuje DNA do sekwencjonowania; w tym przypadku, adaptory są dodawane do obu końców dwuniciowej cząsteczki DNA, co efektywnie umożliwia przekształcenie DNA w jednoniciowy kolisty szablon. Oznacza to, że DNA może być sekwencjonowane w sposób ciągły.

Ta biblioteka DNA, lub szablon DNA, jest następnie umieszczana w sekwenatorze DNA, który zawiera „falowody trybu zerowego”, które mają polimerazę DNA unieruchomioną na jednym końcu. Pojedyncza cząsteczka DNA jest następnie unieruchomiona w tych falowodach z trybem zerowym, a polimeraza DNA zaczyna dodawać nowe nukleotydy do zsyntetyzowanej de novo nici DNA komplementarnej do szablonowego DNA. Zasady w tych nukleotydach są znakowane, a włączenie tych zasad do rosnącej nici DNA powoduje emisję światła. Ta emisja światła jest następnie odczytywana w czasie rzeczywistym, a ponieważ emisja z każdej zasady jest inna, pozwala to na identyfikację konkretnej zasady.

Główną zaletą sekwencjonowania SMRT jest generowanie długich odczytów sekwencjonowania o wysokiej dokładności, co poprawia składanie całych genomów. Dzieje się tak dlatego, że dłuższe odczyty sekwencjonowania oznaczają mniej „budowania” wymaganego do złożenia genomu.

Studying DNA Methylation in Bacteria; an Application of SMRT Sequencing

What is DNA methylation?

Dodanie grupy metylowej do DNA, znane również jako metylacja, występuje we wszystkich królestwach życia. U bakterii występują trzy metylowane nukleotydy: m5C (C5-metylo-cytozyna, która występuje również u eukariotów), m6A (N6-metylo-adenina) i m4C (N4-metylo-cytozyna, która występuje tylko u bakterii). Metylacja występuje po syntezie nowych nici DNA, i dzieje się na specyficznych nukleotydów.

Grupy metylowe wystają z podwójnej helisy DNA, a zatem może wpływać na wiązanie między DNA i białek wiążących DNA. To z kolei wpływa na procesy, w tym replikacji chromosomów, naprawy niedopasowania DNA, jak również czas transkrypcji genów i tworzenie epigenetycznych lineages.

Mechanizmy epigenetyczne: metylacja lub acetylacja dna może aktywować lub nie transkrypcję genów. Image Credit: ellepigrafica /

Dlaczego metylacja DNA jest ważna u bakterii?

Bakterie są zakażane przez wirusy, dlatego potrzebują mechanizmu ochronnego, aby pokonać infekcje wirusowe. Jest to miejsce, gdzie systemy modyfikacji restrykcyjnej wchodzą do gry; system ten składa się z enzymu restrykcyjnego, który rozbija DNA w określonych miejscach, oraz metylotransferazy DNA, która dodaje grupę metylową do adeniny (A) lub cytozyny (C).

W większości systemów modyfikacji restrykcyjnej, metylotransferaza DNA działa w celu ochrony bakteryjnego DNA przed enzymem restrykcyjnym. Obecność metylotransferazy DNA oznacza, że bakteryjne DNA staje się metylowane, podczas gdy zakaźne wirusowe DNA nie jest. To z kolei oznacza, że wirusowe DNA jest degradowane przez enzym restrykcyjny, podczas gdy bakteryjne DNA jest chronione dzięki temu, że enzym restrykcyjny nie działa na zmetylowane DNA. Należy jednak zauważyć, że istnieją enzymy restrykcyjne, które działają na zmodyfikowanym DNA.

Następne badania sugerują, że mogą istnieć dodatkowe role dla systemów modyfikacji restrykcji. Na przykład, znokautowanie pewnych systemów restrykcyjno-modyfikacyjnych spowodowało zmianę w ekspresji genów, co jest związane z różnicą w metylacji DNA. Systemy modyfikacji restrykcyjnej mogą również powodować pęknięcia podwójnej nici i mutacje C-T, wpływając w ten sposób na ewolucję bakterii. Ostatnio opracowano technologie, które są w stanie określić metylację całego genomu bakteryjnego, znanego jako „metylom”.

Jak określić metylom przy użyciu sekwencjonowania SMRT?

Jako że sekwencjonowanie SMRT daje wyniki w czasie rzeczywistym, może być stosowane do wykrywania modyfikacji DNA, w tym metylacji. Polimeraza DNA wbudowuje nukleotydy ze stałą szybkością, ale szybkość ta może ulec zmianie, jeśli nukleotyd w szablonie został zmodyfikowany. Można to zauważyć podczas procesu sekwencjonowania.

Blow at al. użył sekwencjonowania SMRT do mapowania modyfikacji DNA w 230 mikroorganizmach. Poszukiwane modyfikacje obejmowały m5C, m6A i m4C. Autorzy stwierdzili, że 93% tych mikroorganizmów wykazało metylację DNA, a także znaleźli 834 motywy, które były metylowane. Pozwoliło to autorom zidentyfikować, które motywy są celem dla 620 metylotransferaz DNA.

Co ciekawe, autorzy zauważyli, że podczas gdy 48% badanych organizmów posiadało metylotransferazę DNA, nie było dowodów na obecność enzymu restrykcyjnego. Dlatego możliwe jest, że metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji genomu lub inną ważną rolę u mikroorganizmów, która nie została jeszcze zidentyfikowana.

Further Reading

• All DNA Sequencing Content
• Sekwencjonowanie DNA
• DNA Sequence Assembly
• Mikromacierze DNA
• High-throughput DNA Sequencing Techniques

Written by

Dr Maho Yokoyama

Dr Maho Yokoyama jest badaczką i pisarką naukową. Tytuł doktora uzyskała na Uniwersytecie w Bath, w Wielkiej Brytanii, po napisaniu pracy w dziedzinie mikrobiologii, w której zastosowała genomikę funkcjonalną do Staphylococcus aureus. Podczas studiów doktoranckich Maho współpracowała z innymi naukowcami nad kilkoma pracami, a nawet opublikowała niektóre z własnych prac w recenzowanych czasopismach naukowych. Przedstawiła również swoją pracę na konferencjach akademickich na całym świecie.

Ostatnia aktualizacja Sep 3, 2019

Cytaty

Proszę użyć jednego z następujących formatów, aby zacytować ten artykuł w swoim eseju, pracy lub raporcie:

• APA

  Yokoyama, Maho. (2019, September 03). Czym jest sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki (SMRT)? News-Medical. Retrieved on March 26, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx.

• MLA

  Yokoyama, Maho. „Czym jest sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym pojedynczej cząsteczki (SMRT)?”. News-Medical. 26 marca 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx>.

• Chicago

  Yokoyama, Maho. „Czym jest sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym pojedynczej cząsteczki (SMRT)?”. News-Medical. https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx. (dostęp 26 marca 2021 r.).

• Harvard

  Yokoyama, Maho. 2019. What is Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing? News-Medical, przeglądane 26 marca 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx.

.