Abstract
Od czasu początkowego odkrycia, że podgrupa pacjentów z czerniakiem skóry jest nosicielem mutacji BRAF, znaczące badania koncentrowały się na określeniu patologicznych konsekwencji mutacji BRAF, optymalizacji technik diagnostycznych w celu identyfikacji tych mutacji oraz opracowaniu interwencji terapeutycznych w celu zahamowania funkcji tego celu w guzach noszących mutacje. Ostatnio poczyniono postępy, które rewolucjonizują standard opieki nad pacjentami z czerniakiem zmutowanym w BRAF. W niniejszej pracy przedstawiono przegląd patogenetycznych konsekwencji zmutowanej sygnalizacji BRAF, najnowsze metody badań molekularnych w celu wykrycia mutacji BRAF oraz najnowsze dane kliniczne dotyczące inhibitorów szlaku BRAF u pacjentów z czerniakiem i mutacjami BRAF. Na koniec omówiono pojawiające się mechanizmy oporności na inhibitory BRAF oraz sposoby przezwyciężania tej oporności.
1. Wprowadzenie
Melanoma jest obecnie 5. i 7. najczęściej występującym nowotworem u amerykańskich mężczyzn i kobiet, odpowiednio. Ponadto, częstość występowania czerniaka wzrosła dramatycznie w ciągu ostatnich 60 lat, rosnąc szybciej niż wszystkie inne guzy lite. Chociaż pacjenci we wczesnym stadium mogą być skutecznie leczeni chirurgiczną resekcją u większości z nich, u wielu rozwinie się choroba rozsiana. Rokowanie dla pacjentów z odległymi przerzutami czerniaka jest fatalne i pomimo standardowego leczenia, ponad 95% pacjentów z czerniakiem w stadium IV umrze w ciągu pięciu lat, a większość pacjentów ulegnie w ciągu jednego roku.
Ostatnio odkrycia przedkliniczne doprowadziły do znacznego postępu w zrozumieniu kluczowych zdarzeń sygnalizacji molekularnej leżących u podstaw patogenezy czerniaka. Przede wszystkim wykazano, że duży odsetek guzów pochodzenia melanocytowego jest nosicielem mutacji aktywujących BRAF, które prowadzą do jego konstytutywnej aktywności. Około 70-80% nabytych znamion melanocytowych i 40-60% czerniaka złośliwego zawiera mutację BRAF, z których zdecydowana większość skutkuje pojedynczą zmianą aminokwasu w kodonie 600 (BRAFV600E). Wynikająca z tego nieoparta, konstytutywna aktywacja kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) prowadzi do promowania wzrostu komórek i przeciwstawiania się apoptozie, a ostatecznie do transformacji w czerniaka. Ta wzmocniona sygnalizacja sprawia jednak, że zmutowane komórki są podatne na działanie inhibitorów małych cząsteczek, które celują w różne mediatory szlaku BRAF. 2. Sygnalizacja RAF i patogeneza czerniaka
Interakcja między receptorem czynnika wzrostu a jego ligandem zwykle wywołuje serię zdarzeń, które promują wzrost i przeżycie komórek. Członkowie rodziny RAS są GTPazami, które działają jako krytyczni mediatorzy w transdukcji takich sygnałów. Chociaż RAS odgrywa ważną rolę w homeostazie normalnego obrotu komórkowego, śmierci i przeżycia, mutacje aktywujące w członkach rodziny RAS (HRAS, KRAS i NRAS) zostały zidentyfikowane i powiązane z różnymi nowotworami u ludzi. W czerniaku, mutacje NRAS zostały zidentyfikowane w 10-25% próbek nowotworów i są uważane za ważny czynnik onkogenezy u tych pacjentów. Onkogeneza jest pośredniczona przez upregulation kilku mechanizmów sygnalizacyjnych, w szczególności mitogen-activated protein kinase (MAPK) i phophatidy-inositol-3-kinase (PI3K) pathways.
Aktywowany RAS wyzwala aktywację szlaku MAPK poprzez interakcje z onkoproteinami RAF (BRAF i CRAF) prowadzące do zapoczątkowania kaskady sygnałowej progresji. Nie jest jasne, czy to BRAF czy CRAF przekazuje sygnał od zmutowanego NRAS do MEK, ale przewaga dowodów sugeruje, że CRAF jest głównym mediatorem. RAF oddziałuje z kinazą MAPK/ERK (MEK), inicjując fosforylację MEK, co z kolei prowadzi do aktywującej fosforylacji ERK. Aktywacja ERK prowadzi do powstania sygnału progresji i transformacji, który wydaje się być krytyczny w patogenezie wielu nowotworów złośliwych. Ścieżka ta może być inicjowana przez izoformę RAF, BRAF lub CRAF, chociaż CRAF ma również działanie pro-odżywcze, częściowo poprzez upregulacji białek anty-apoptotycznych, czynnika jądrowego kappa B (NF-κB) i białaczki B-komórkowej 2 (BCL-2) . Co ciekawe, w przeciwieństwie do CRAF, aktywowany BRAF nie ma innych znanych substratów. Tak więc, zmutowane czerniaki BRAF sygnalizują wyłącznie poprzez MEK, a następnie ERK, prowadząc do onkogenezy. Ta cecha sprawia, że guzy te są wyjątkowo wrażliwe na silne inhibitory szlaku MAPK.
3. Diagnostyka/wykrywanie
Od czasu zidentyfikowania aktywujących mutacji BRAF w czerniaku, technologia wykrywania uległa znacznej poprawie. Standardowe badania mutacji BRAF w tkance nowotworowej zazwyczaj wykorzystują techniki takie jak dwukierunkowe bezpośrednie sekwencjonowanie fluorescencyjne i specyficzną dla alleli reakcję łańcuchową polimerazy, które są dostępne komercyjnie i oferują wysoką swoistość. Czułość tych testów jest jednak ograniczona, ponieważ są one w stanie wykryć mutację tylko wtedy, gdy komórki nowotworowe stanowią >5-10% próbki przesłanej do analizy genetycznej. Podczas gdy ten stopień czułości jest zazwyczaj wystarczający do wykrycia obecności mutacji BRAFV600E w jednorodnym guzku nowotworowym, to prawdopodobnie nie jest wystarczająco czuły, aby wykryć kilka komórek nowotworowych na tle wysokiego odsetka elementów zrębu lub limfatycznych, naciekających limfocytów lub komórek krwi obwodowej.
Jedną z obaw dotyczących wykorzystania technik wykrywania mutacji o zwiększonej czułości jest to, że pozytywny test może faktycznie odzwierciedlać wykrywanie małego podzbioru zmutowanych komórek. Chociaż może to mieć interesujące konsekwencje naukowe, znaczenie kliniczne guza zawierającego niewielką ilość zmutowanych komórek BRAF jest żadne, ponieważ nie oczekuje się, że pacjenci ci odniosą korzyści z inhibitorów BRAF. Obawa ta jest uzasadniona, ponieważ heterogenność guza została opisana w pierwotnych czerniakach . Ponadto, podczas gdy mutacje BRAF są widoczne w znacznej większości znamion melanocytowych, czerniaków o pionowej fazie wzrostu i czerniaków przerzutowych, są one rzadko wykrywane w czerniakach o promienistej fazie wzrostu (10%), które uważa się za początkową zmianę złośliwą przed zmianą prawdziwie inwazyjną. Sugeruje to, że mutacja BRAF może być w rzeczywistości nabytym zdarzeniem we wczesnym czerniaku, które prowadzi do ekspansji klonalnej i progresji guza. Taka poliklonalność nie została zaobserwowana w pojedynczych guzach przerzutowych, ani gdy pobierane są próbki guzów z wielu miejsc od poszczególnych pacjentów. Niemniej jednak, zastosowanie analizy mutacyjnej o zwiększonej czułości może być nie tylko badaniem próbek guza, ale wykrywaniem małych liczb reprezentatywnych komórek guza w tle komórek niezłośliwych, takich jak w węzłach chłonnych i krwi obwodowej.
Rozwinięto bardziej zaawansowane techniki i oznaczenia, które albo zapewniają zwiększoną czułość, albo eliminują potrzebę zwiększonej czułości. Te testy nowej generacji pozwalają na dokładniejsze badanie próbek, które zawierają tylko niewielką ilość guza, jak również na wykrywanie mutacji w różnych składnikach krwi obwodowej (tj. limfocyty, komórki jednojądrzaste, osocze, surowica). Użyteczność wielu z tych testów została zbadana w próbkach pochodzących od pacjentów z czerniakiem, z różnymi wynikami.
Systemy mutacji opornych na amplifikację (ARMSs) są ostatnio opisaną, specyficzną dla alleli techniką, która ma zwiększoną czułość (zdolną do wykrycia próbki mutacji zawierającej 1% zmutowanych komórek) w porównaniu ze standardowym sekwencjonowaniem DNA tkanek utrwalonych w formalinie, z zatopionymi parafinami (FFPE). Innym podejściem, które znacznie zwiększa czułość dla wykrywania mutacji jest wykorzystanie testów, które selektywnie amplifikują zmutowane DNA/RNA w próbce. Wykorzystując kombinację primerów specyficznych dla alleli oraz primerów zablokowanych kwasów nukleinowych, zostało opisane wykrywanie 10 komórek czerniaka w 1 mL krwi. Trzecie podejście do zwiększenia czułości wykrywania mutacji jest zgłaszane, aby być w stanie wykryć jedną zmutowaną komórkę w tysiącu niezmutowanych komórek, wykorzystując unikalne miejsce enzymu restrykcyjnego w allelach typu dzikiego, które pozwala na trawienie alleli typu dzikiego, a tym samym wzbogacenie zmutowanych alleli. Wreszcie, włączenie COLD-PCR prowadzi do prawie podwojenia czułości w wykrywaniu mutacji BRAF z tkanki FFPE przy użyciu standardowego sekwencjonowania i pirosekwencjonowania .
W uzupełnieniu do nowych technologii (ARMS) i modyfikacji rutynowych technik, które prowadzą do większej czułości wykrywania mutacji, zastosowanie standardowych testów na wcześniej nie badanych próbkach również zmienia sposób, w jaki podchodzimy do badania BRAF. Analiza BRAF na wolnym DNA w surowicy i osoczu została opisana, podobnie jak wykrywanie mutacji BRAF z izolowanych, krążących komórek nowotworowych (CTCs). Chociaż analiza BRAF w CTC, surowicy i osoczu wydaje się możliwa, nie wiadomo jeszcze, czy będzie rutynowe zastosowanie kliniczne dla jednego lub więcej z tych testów, czy też pozostanie to jedynie podejściem eksperymentalnym.
Podczas gdy rola standardowej i eksperymentalnej diagnostyki molekularnej jest wykorzystywana do identyfikacji specyficznych mutacji zainteresowania (tj., BRAFV600E), zarówno w tkankach jak i we krwi, może być również warte przetestowania dla innych mutacji i anomalii, ponieważ mogą one wskazywać na wrażliwość na konkretne leczenie. Na przykład technologia Sequenom MassARRAY jest wykorzystywana do badania większych paneli mutacji onkogennych, wykorzystując reakcję przedłużenia primera, po której następuje spektrometria mas w celu wykrycia produktów i identyfikacji mutacji o potencjalnych konsekwencjach klinicznych. Array comparative genome hybridization (aCGH) oferuje możliwość zbadania całego genomu pod kątem zmian liczby kopii, w tym zarówno amplifikacji, jak i delecji, które mogą nadawać wrażliwość na terapię celowaną. Jednak wszystkie te technologie są oczywiście ograniczone, ponieważ mogą zidentyfikować tylko znane, wcześniej wybrane anomalie. Analiza całego genomu (WGA) ma potencjał, aby nie tylko skonsolidować wszystkie lub większość z tych metod i testów na jednej platformie technologicznej, ale także zidentyfikować dodatkowe zmiany genetyczne poza parametrami projektowymi tych innych testów. WGA oferuje również możliwość odkrycia wcześniej nieznanych (być może specyficznych dla pacjenta) mutacji w genomach czerniaka i zbadania, czy określone profile mutacji lub polimorfizmów mogą być predykcyjne dla korzyści z określonej terapii (np. inhibitory BRAF, HD IL-2). Nadal jednak kliniczna użyteczność tych testów „następnej generacji” w opiece nad pacjentami z czerniakiem jest całkowicie nieznana.
4. Inhibitory sygnalizacji RAF (mniej lub bardziej specyficzne inhibitory zmutowanego BRAF, CRAF, MEK, być może inhibitory ERK)
Opracowano serię małych inhibitorów cząsteczkowych, które z różną selektywnością celują w BRAF typu dzikiego, BRAFV600E, inne zmutowane BRAF (w pozycji 600 i 601) oraz CRAF. Ponadto opracowywane są również inhibitory mediatorów aktywacji RAF, czyli MEK i ERK. W tej części omówiono tylko leki, które zostały przebadane klinicznie i przedstawione publicznie.
5. Inhibitory BRAF
5.1. Sorafenib
Sorafenib, wielocelowy inhibitor kinazy tyrozynowej BRAF, CRAF, receptora płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGFR), receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR) 2, p38 i CKIT, był pierwszym inhibitorem RAF aktywnie badanym u chorych na czerniaka, ponieważ był dostępny do badań II fazy w tym samym roku, w którym po raz pierwszy zgłoszono mutacje BRAF. Niestety, pomimo licznych badań I, II i III fazy jako pojedynczego leku i w połączeniu z chemioterapią, przydatność kliniczna sorafenibu jest rozczarowująca. Na przykład, w badaniu z zastosowaniem sorafenibu jako pojedynczego leku, mediana przeżycia wolnego od progresji choroby u pacjentów z czerniakiem wynosiła 11 tygodni. Sześciu pacjentów (16%) miało stabilną chorobę w ciągu 6 miesięcy, która w niektórych przypadkach utrzymywała się przez ponad 12 miesięcy. Jednak tylko jeden z 37 pacjentów w badaniu miał rzeczywistą odpowiedź guza zdefiniowaną przez kryteria oceny odpowiedzi w guzach litych (RECIST-).
Po tym badaniu nastąpiło kilka prób sorafenibu w połączeniu z różnymi środkami cytotoksycznymi, chociaż kombinacją, która była najlepiej zbadana, był sorafenib, karboplatyna i paklitaksel. Wstępne obietnice dotyczące tego schematu zostały opisane w badaniu I fazy sorafenibu w połączeniu z karboplatyną i paklitakselem u pacjentów z guzami litymi, do którego włączono 24 pacjentów z zaawansowanym czerniakiem. Dziesięciu pacjentów z czerniakiem (42%) uzyskało obiektywną odpowiedź, a dodatkowych 11 pacjentów (46%) miało stabilną chorobę wg RECIST. Mediana przeżycia wolnego od progresji choroby wyniosła 43,7 tygodnia. Te obiecujące wyniki doprowadziły do rozpoczęcia badania III fazy porównującego karboplatynę/paklitaksel ± sorafenib u pacjentów z czerniakiem, u których nastąpiła progresja po terapii temozolomidem lub DTIC. Do tego badania (badanie PRISM) włączono 270 pacjentów i nie wykazano korzyści z dodania sorafenibu do karboplatyny/paklitakselu w tej populacji pacjentów drugiej linii. Połączenie karboplatyny/paklitakselu i sorafenibu było również porównywane z karboplatyną/paklitakselem w populacji pacjentów z zaawansowanym czerniakiem, u których nie stosowano leczenia, w kontrolowanym placebo randomizowanym badaniu III fazy przeprowadzonym w ramach United States Intergroup (E2603). Do tego badania włączono 800 pacjentów i nie stwierdzono korzyści z dodania sorafenibu ani w odniesieniu do mediany PFS, ani OS .
5,2. Inhibitory BRAF o większej sile działania (PLX4032, GSK2118436)
Jednym z głównych wyjaśnień nieskuteczności sorafenibu jako pojedynczego leku u pacjentów z czerniakiem jest jego niezdolność do całkowitego zahamowania BRAF, a w szczególności BRAF zawierającego mutację V600E. Opracowano inne inhibitory BRAF, takie jak PLX-4032 i GSK2118436, które są silniejszymi i bardziej selektywnymi inhibitorami zmutowanego BRAF niż sorafenib. To zwiększone hamowanie BRAFV600E w sposób przewidywalny doprowadziło do zwiększenia aktywności klinicznej tych środków w porównaniu z sorafenibem.
5.3. Wemurafenib
Wemurafenib był pierwszym inhibitorem BRAF o większej sile działania, który ukończył badanie I fazy i wykazał znaczące korzyści kliniczne. W badaniu I fazy PLX4032, u 11 z 16 pacjentów z guzami zawierającymi mutację BRAFV600E, którzy otrzymywali dawkę ≥240 mg dwa razy na dobę w fazie eskalacji dawki, wystąpiły odpowiedzi nowotworowe, podczas gdy u pięciu pacjentów z guzami zawierającymi BRAF typu dzikiego nie zaobserwowano żadnych odpowiedzi klinicznych. Ponadto u 26 z 32 (81%) pacjentów z czerniakami ze zmutowaną mutacją BRAFV600E, leczonych w kohorcie rozszerzającej w zalecanej dawce fazy II wynoszącej 960 mg dwa razy na dobę, wystąpiła odpowiedź kliniczna, w tym u dwóch pacjentów uzyskano całkowitą odpowiedź (CR). Oszacowana mediana PFS wyniosła siedem miesięcy, co wypada korzystnie w porównaniu z wcześniej dostępnymi terapiami dla przerzutowego czerniaka. Ponadto leczenie wemurafenibem prowadzi do zmniejszenia poziomu fosforylowanej ERK (pERK) w guzach zawierających mutację BRAFV600E, co jest związane z odpowiedzią kliniczną. Prawdopodobnie to zahamowanie pERK zwiększa splicing proapoptotycznego członka rodziny BCL-2 – BIM, promując w ten sposób apoptozę komórek BRAFV600E.
Te ustalenia szybko doprowadziły do szybkiej rekrutacji zarówno do badania fazy II z pojedynczym lekiem (BRIM2), jak i randomizowanego kontrolowanego badania fazy III (BRIM3). Do badania fazy II zakwalifikowano 132 pacjentów z zaawansowanym czerniakiem, którzy otrzymali jedną wcześniejszą terapię. Wskaźnik obiektywnej odpowiedzi (ORR) wyniósł 53%, wskaźnik CR 5%, a czas przeżycia wolny od progresji choroby wyniósł 6,7 miesiąca. W badaniu III fazy 675 pacjentów z zaawansowanym czerniakiem było randomizowanych do leczenia wemurafenibem lub dakarbazyną jako terapią pierwszej linii. W pierwszej analizie okresowej leczenie wemurafenibem wiązało się z istotnym zmniejszeniem ryzyka zgonu i ryzyka zgonu (redukcja o 63%) lub progresji choroby (redukcja o 74%), a także ze znacznie wyższym ORR (48% w porównaniu z 5%). Wyniki te stanowiły podstawę do zatwierdzenia wemurafenibu przez FDA w sierpniu 2011 roku.
5.4. GSK2118436
GSK2118436 to drugi inhibitor BRAF o większej sile działania, który wykazuje znaczną aktywność kliniczną. W badaniu fazy I/II, podobnie jak w przypadku PLX4032, u pacjentów z mutacją BRAFV600E leczonych dwoma najwyższymi dawkami (150 mg dwa razy na dobę i 200 mg dwa razy na dobę) wystąpił wysoki odsetek odpowiedzi (10/16 pacjentów, 63%). U ośmiu pacjentów z mutacjami innymi niż BRAFV600E (V600K, V600G i K601E) leczonych dawką ≥100 mg dwa razy na dobę, u trzech wystąpiła częściowa odpowiedź. U obu pacjentów z mutacją BRAFK601E doszło do progresji po pierwszym ponownym oznaczeniu, co sugeruje, że tylko pacjenci z mutacją BRAF w pozycji 600 odpowiedzą na leczenie.
6. Inhibitory MEK
Inhibitory MEK, mediatora aktywacji RAF i jedynego znanego substratu BRAF, okazały się obiecujące w badaniach przedklinicznych w czerniaku i zaczęły być badane w klinice z pewnymi zachęcającymi wynikami. Inhibitory MEK mogą być również najbardziej użyteczne u pacjentów z mutacją BRAFV600E, ponieważ status mutacyjny silnie koreluje z odpowiedzią na inhibicję MEK w modelach ksenograftów czerniaka myszy .
6.1. AZD6244
Dwa badania I fazy AZD6244 z udziałem pacjentów z zaawansowanymi guzami litymi wykazały, że środek ten jest dobrze tolerowany i posiada pewną aktywność przeciwnowotworową u pacjentów z czerniakiem. W pierwszym badaniu, trzech z ośmiu pacjentów z zaawansowanym czerniakiem leczonych AZD6244 uzyskało częściową odpowiedź; status mutacyjny BRAF i NRAS był niedostępny. Podczas gdy w drugim badaniu fazy I, tylko jedna odpowiedź była widziana w czternastu pacjentów z czerniakiem, chociaż ten podmiot miał udokumentowaną mutację BRAF i pełną odpowiedź trwającą przez ponad dwa lata w czasie publikacji .
W dodatku, AZD6244 wykazał obiecujące wyniki w modelach mysich, szczególnie w połączeniu z chemioterapią, ustawiając scenę dla prób kombinacji . Opierając się na tym, przeprowadzono pilotażowe badanie AZD6244 w połączeniu z dakarbazyną, docetakselem lub temsirolimusem u pacjentów z zaawansowanym czerniakiem. Leczono 18 pacjentów, u których znany był status mutacyjny BRAF i NRAS. Odpowiedź kliniczną zaobserwowano u pięciu z dziewięciu pacjentów (55%) z mutacją BRAF, natomiast nie zaobserwowano odpowiedzi u żadnego z dziewięciu pacjentów bez mutacji BRAF, w tym u czterech pacjentów z mutacją NRAS. Ponadto, czas do progresji choroby był znacząco dłuższy u pacjentów z mutacją BRAF w porównaniu z pacjentami bez mutacji (mediana 31 tygodni w porównaniu z 8 tygodniami).
6.2. GSK1120212
GSK1120212 jest odwracalnym, selektywnym inhibitorem MEK1/MEK2, który w badaniu fazy I wykazał skuteczność pojedynczego leku u pacjentów z zaawansowanym czerniakiem zmutowanym w BRAFV600E. W szczególności, ośmiu z 20 pacjentów z czerniakiem zmutowanym w BRAF, leczonych produktem GSK2110212 miało potwierdzoną odpowiedź, a dwóch pacjentów osiągnęło CR. Co ciekawe, dwóch z 22 pacjentów z BRAF typu dzikiego miało PR podczas leczenia, co sugeruje, że niektóre guzy czerniaka są zależne od sygnalizacji kinazy ERK/MAP pomimo braku mutacji BRAF.
6.3. PD-0325901
Do badania fazy I PD-0325901 włączono 48 pacjentów z zaawansowanym czerniakiem, z których 3 (6%) miało potwierdzoną PR, 10 (21%) miało stabilną chorobę przez ≥4 miesiące, a łącznie 15 (31%) pacjentów wykazało zmniejszenie barwienia guza Ki-67 . Dane dotyczące analizy mutacyjnej tych pacjentów nie zostały dostarczone.
6.4. AS703026
Podobne wyniki uzyskano ostatnio w przypadku produktu AS703026, który jest silnym inhibitorem MEK1/2. W badaniu I fazy u trzech z ośmiu pacjentów uzyskano częściową odpowiedź po zastosowaniu leczenia w jednym z dwóch schematów leczenia. Status mutacyjny pacjentów z czerniakiem nie został zgłoszony.
Choć dane kliniczne dotyczące inhibitorów MEK są zachęcające, są one dość wstępne. Prawdziwa wartość tych leków musi poczekać na badania II i III fazy u pacjentów z czerniakiem zmutowanym w BRAF. Jednym z takich badań, które obecnie trwa, jest randomizowane badanie III fazy GSK1220212 w porównaniu z chemioterapią (dakarbazyną lub paklitakselem) u chorych na czerniaka z mutacją BRAF (NCIT01245062).
7. Pojawiające się mechanizmy oporności na inhibicję BRAF
Co ważne, wydaje się, że u znacznej większości pacjentów leczonych pojedynczym lekiem PLX-4032 w końcu wystąpi progresja choroby, pomimo skutecznego zahamowania BRAFV600E i wysokiego odsetka obiektywnych odpowiedzi we wczesnym okresie leczenia. Wstępne badania sugerują, że oporność na PLX-4032 nie jest związana z rozwojem drugiej mutacji, która upośledza wiązanie leku leczniczego z BRAF, co jest mechanizmem oporności odnotowanym w przypadku terapii celowanej w innych nowotworach złośliwych, takich jak niedrobnokomórkowy rak płuc, przewlekła białaczka szpikowa i nowotwór podścieliskowy przewodu pokarmowego. Zamiast tego, oporność jest pośredniczona przez reaktywację ścieżki MAPK w większości guzów poprzez alternatywne środki.
To z badań in vitro komórek zmutowanych w BRAFV600E, które zostały wygenerowane, aby wykazać nabytą oporność na inhibitory BRAF, doprowadziło do pierwszych wskazówek, w jaki sposób zmutowane komórki BRAF są w stanie przetrwać inhibicję BRAF. Wydaje się jasne, że przywrócenie sygnalizacji MAPK jest kluczową zmienną w nabytej oporności na inhibicję BRAF. Może to być osiągnięte poprzez upregulation receptorowych kinaz tyrozynowych (tj. PDGFRB, ERBB2), aktywację RAS, upregulation CRAF, aktywację kinaz Ser/Thr MAPK (COT) oraz rozwój wtórnej aktywującej mutacji w MEK. Ponadto, sygnalizacja poprzez szlak PI3K inicjowana przez receptor 1 insulinowego czynnika wzrostu (IGF-1R) jest alternatywnym mechanizmem nabytej oporności, który również został opisany. Należy zauważyć, że każdy z tych mechanizmów został zbadany i potwierdzony w niewielkiej liczbie próbek guza od pacjentów, którzy mieli biopsje wykonane w czasie oporności, a zależność od tych wyregulowanych lub zmutowanych mediatorów sygnalizacyjnych nie została wykazana.
Pierwotną oporność na inhibicję BRAF obserwuje się u mniej niż 10% pacjentów z czerniakiem z mutacją BRAF leczonych wemurafenibem. Chociaż nie ma danych z próbek klinicznych, które pomogłyby określić, którzy pacjenci prawdopodobnie nie odniosą korzyści z inhibitorów BRAF, badania przedkliniczne sugerują, że podwyższone poziomy CRAF przed leczeniem, jak również podstawowa amplifikacja CCND1 w guzach, prowadząca do nadekspresji cykliny D1 i zwiększonej ekspresji CDK4, są obiecującymi biomarkerami przed leczeniem, wartymi dalszych badań.
W komórkach czerniaka typu dzikiego BRAF (BRAFWT), ścieżka kinazy MAPK jest aktywowana przez wemurafenib (i analogiczny PLX4720), co prowadzi do upregulacji MEK i ERK oraz zwiększonej proliferacji. Wydaje się to być wtórne do aktywacji CRAF z następującą po niej sygnalizacją poprzez MEK i ERK z oczekiwanymi konsekwencjami onkogennymi w komórkach BRAFWT. Ponadto, ta aktywacja CRAF wydaje się być pośredniczona przez tworzenie heterodimeru z białkiem BRAFWT i/lub homodimeru CRAF, co jest najbardziej widoczne w komórkach zmutowanych w RAS. Ponadto PLX4720 zwiększa poziom antyapoptotycznego białka MCL-1 będącego członkiem rodziny BCL-2 w komórkach czerniaka zmutowanego w NRAS poprzez zwiększoną sygnalizację poprzez ścieżkę MAPK. Chociaż jest jasne, że aktywacja CRAF i zwiększona sygnalizacja szlakiem MAPK występują w komórkach czerniaka BRAFWT (szczególnie tych, które posiadają mutację NRAS) leczonych inhibitorami BRAF, takimi jak wemurafenib i PLX4720, znaczenie kliniczne tego faktu jest niepewne. W szczególności, nie uważa się, że klinicznie nabyta oporność na wemurafenib, na przykład, występuje wyłącznie z powodu wzrostu podgrupy komórek czerniaka BRAFWT, ponieważ utrzymywanie się mutacji BRAFV600E zostało zidentyfikowane we wszystkich guzach analizowanych i zgłaszanych do tej pory. W rzeczywistości wydaje się, że specyficzne zmiany w komórkach zmutowanych w mutacji BRAFV600E umożliwiają adaptacje, które prowadzą do ponownego wzrostu pomimo ciągłego hamowania BRAF.
8. Przyszłe kierunki
Ustalenie skuteczności pojedynczych leków selektywnych inhibitorów BRAF, a w mniejszym stopniu inhibitorów MEK, stanowi istotny przełom w leczeniu pacjentów z czerniakiem BRAF dodatnim pod względem mutacji BRAF. Chociaż przewiduje się, że u większości chorych leczonych tymi lekami dojdzie do progresji choroby, to wyjaśnienie opisanych powyżej mechanizmów oporności pomoże ukierunkować przyszłą terapię sekwencyjną i skojarzoną. W oparciu o odkrycie, że aktywność szlaku MAPK jest reaktywowana w czerniaku po selektywnym zahamowaniu BRAF, trwają pierwsze badania nad połączeniem selektywnego inhibitora BRAF (GSK2118436) z inhibitorem MEK (GSK1120212), które wydają się tolerowane przy podawaniu obu środków w standardowych dawkach pojedynczych. Oprócz tego połączenia, badania z selektywnymi inhibitorami BRAF w połączeniu z antagonistami IGF-R1 lub po nich oraz innymi inhibitorami receptorowej kinazy tyrozynowej mogą być przewidywane na podstawie wyników przedklinicznych modeli oporności.
Innym podejściem do zwiększenia skuteczności selektywnych inhibitorów BRAF i inhibitorów MEK jest dodanie środków, które mogą zwiększać apoptozę. Jednym z takich środków jest ABT-263, który jest BH3-mimetykiem będącym obecnie w fazie rozwoju klinicznego. W badaniach przedklinicznych, mniej biodostępny homologiczny BH3-mimetyk ABT-737 w połączeniu z inhibitorem MEK prowadził do zwiększonej śmiertelności w porównaniu z każdym z tych środków osobno. Nie wiadomo, czy ABT-263 w połączeniu z MEK lub selektywnymi inhibitorami BRAF poprawi wyniki kliniczne, choć być może warto to zbadać we wczesnej fazie badania klinicznego.
Oprócz terapii skojarzonej z lekami ukierunkowanymi molekularnie, które hamują sygnalizację wywołaną selektywnym hamowaniem BRAF lub promują apoptozę, innym obiecującym podejściem do maksymalizacji korzyści z inhibitorów BRAF lub MEK jest połączenie tych leków z immunoterapią. Ostatnio inhibitory punktów kontrolnych układu odpornościowego, w tym przeciwciało monoklonalne anty-CTLA-4 ipilimumab oraz przeciwciało monoklonalne anty-PD MDX-1106, wykazały skuteczność pojedynczego czynnika u chorych na przerzutowego czerniaka. Co ważne, wydaje się, że PLX4032 nie wpływa negatywnie na funkcję ludzkich limfocytów T (T-cells), podczas gdy inhibitory MEK tak. Ponadto wykazano, że wemurafenib poprawia rozpoznawanie immunologiczne przez komórki T swoiste dla antygenów w czerniaku. Wyniki te stanowią przesłankę do przeprowadzenia badania oceniającego bezpieczeństwo i skuteczność selektywnego hamowania BRAF w połączeniu z immunoterapią, w tym ipilimumabem, MDX1106 i ewentualnie dużą dawką IL2.
9. Wnioski
Od wielu lat istniała nadzieja, że rosnące zrozumienie szlaków molekularnych zaangażowanych w rozwój czerniaka oraz coraz większa dostępność specyficznych inhibitorów tych szlaków umożliwi racjonalny rozwój przyszłych terapii. Wraz z pojawieniem się wemurafenibu i GSK2118436, pierwszych leków ukierunkowanych molekularnie, które doprowadziły do odpowiedzi nowotworowej u dużego odsetka chorych, rozpoczęło się nowe podejście do leczenia czerniaka. W związku z tym wszyscy pacjenci z zaawansowanym czerniakiem powinni mieć wykonaną analizę mutacji BRAF przed rozpoczęciem terapii systemowej. U tych pacjentów, których guzy wykazują mutację BRAF, należy podjąć wszelkie próby leczenia jednym z dwóch silnie działających inhibitorów BRAF. Ponadto, w miarę poznawania mechanizmów oporności na inhibitory BRAF, można spodziewać się rozwoju badań kombinacji nowych terapii ukierunkowanych molekularnie; dalszą poprawę kliniczną można uzyskać tylko dzięki starannie prowadzonym badaniom przedklinicznym i klinicznym, które obejmują biopsje przed leczeniem i w trakcie leczenia. Ponieważ BRAF został uznany za pierwszy punkt wrażliwości w czerniaku, należy mieć nadzieję, że molekularne zrozumienie ograniczeń inhibicji BRAF doprowadzi do dalszych korzyści klinicznych.