Bookshelf

Czynniki naprawcze i sygnały rozpoznawcze

Modelowy system dla enzymatycznej terapii zastępczej powstał w wyniku badań hodowanych fibroblastów skóry pochodzących od pacjentów z chorobami spichrzeniowymi mukopolisacharydów (MPS). Fibroblasty te wykazywały nadmierne nagromadzenie glikozaminoglikanów, co interpretowano jako skutek niedostatecznej degradacji tych makrocząsteczek. Przypadkowo odkryto, że mieszanina fibroblastów pochodzących od pacjentów z MPS I (zespół Hurlera) i MPS II (zespół Huntera) miała normalny wzorzec metabolizmu glikozaminoglikanów (rysunek 1). Wiadomo, że te dwie choroby różnią się genetycznie, MPS I jest dziedziczony w sposób autosomalny recesywny, a MPS II jest zaburzeniem sprzężonym z chromosomem X, co doprowadziło Fratantoniego i wsp. do wysunięcia hipotezy, że fibroblasty o różnych genotypach dostarczają sobie nawzajem brakujący produkt genu. Dalsze badania wykazały, że nie jest konieczne, aby genetycznie odrębne komórki miały ze sobą kontakt w celu takiej korekcji krzyżowej, ponieważ pożywka uwarunkowana przez jedną z nich może być korygująca dla drugiej. Strategia wzajemnej korekcji mogłaby być rozszerzona na pokrewne choroby – komórki, które się wzajemnie korygowały miałyby inny genotyp, podczas gdy komórki, które się nie korygowały miałyby ten sam genotyp (ale zobacz ważny wyjątek poniżej).

As Hurler syndrome had been postulated to be a lysosomal storage disease based on observation of the dramatically swollen liver lysosomes in affected patients , Fratantoni et al. hypothesized that the 'corrective factors’ in conditioned medium might be lysosomal enzymes that were secreted by one cell line and endocytosed by the other. Czynniki korygujące nie odpowiadały jednak żadnemu znanemu wówczas enzymowi lizosomalnemu (sytuacja ta zmieniła się kilka lat później, kiedy odkryto niedobór β-glukuronidazy MPS). Podjęto się oczyszczania czynników korekcyjnych Hurler i Hunter nie z pożywki kondycjonowanej, lecz z moczu, płynu ustrojowego stosunkowo bogatego w enzymy lizosomalne. Funkcja została przypisana oczyszczonym czynnikom przy użyciu różnych metod biochemicznych, w wyniku czego czynniki korygujące Hurlera i Huntera zostały nazwane odpowiednio α-l-iduronidazą i sulfatazą iduronianu .

Komórki, które wymagały czynnika korygującego Hurlera do normalizacji ich metabolizmu glikozaminoglikanów (od pacjentów z zespołem Hurlera i z zespołem Scheie ) były również pozbawione aktywności α-l-iduronidazy ). Korekcji fibroblastów Hurler towarzyszył wychwyt α-l-iduronidazy. Jako dobry prognostyk dla enzymatycznej terapii zastępczej, absorpcja była niezwykle wydajna i tylko bardzo mała ilość α-l-iduronidazy musiała być zinternalizowana w celu zapewnienia pełnej korekcji.

To mógł być koniec historii, z wyjątkiem małej rozbieżności we wzorze elucji aktywności enzymatycznej i aktywności korygującej z kolumny hydroksyapatytowej, sugerując, że dwie aktywności czynnika korygującego Hurler nie były dokładnie identyczne. Podążając za tą rozbieżnością, Shapiro i wsp. rozdzielili α-l-iduronidazę na frakcje korekcyjne i niekorekcyjne na kolumnie heparyna-Sepharose, wskazując, że czynnik korekcyjny miał pewną cechę, która nie była potrzebna do aktywności katalitycznej, ale była potrzebna do wychwytu. Podobnie, znaleziono wiele form β-glukuronidazy, różniących się wychwytem i aktywnością korekcyjną .

Istnienie specyficznego sygnału dla wychwytu enzymu lizosomalnego zostało zasugerowane przez wyniki badań nad nowo odkrytym zaburzeniem przypominającym MPS – nazwanym chorobą inkluzyjno-komórkową (choroba I-komórkowa) z powodu widocznych gęstych inkluzji fazowych w hodowanych fibroblastach. Podczas gdy te fibroblasty miały liczne niedobory enzymów lizosomalnych, otaczające je podłoże zawierało duży nadmiar enzymów lizosomalnych. Jednakże enzymy wydzielane przez fibroblasty z chorobą I-cell nie były endocytowane przez inne komórki i nie były korygujące; przypuszczalnie brakowało im sygnału do wychwytu do lizosomów. Ponieważ defekt pojedynczego genu dotyczył wielu enzymów lizosomalnych (choroba I-cell jest dziedziczona w sposób autosomalny recesywny), postulowano, że sygnał jest potranslacyjną modyfikacją białek enzymów. Postulowano również, że ma on charakter węglowodanowy, ponieważ może być zniszczony przez łagodne traktowanie periodanem. Na koncepcję systemu rozpoznawania opartego na węglowodanach duży wpływ miały odkrycia Ashwella i współpracowników dotyczące roli węglowodanów we wchłanianiu krążących glikoprotein przez wątrobę .

Obecność specyficznego rozpoznawalnego sygnału implikowała nasycalny, pośredniczący przez receptor proces i sugerowała, że wchłanianie enzymów lizosomalnych będzie przebiegać zgodnie z kinetyką Michaelisa-Mentena. Oczekiwano, że analogi sygnałów rozpoznawczych będą zachowywać się jak konkurencyjne inhibitory wychwytu. To oczekiwanie zostało zbadane poprzez wychwyt α-l-iduronidazy i β-glukuronidazy przez odpowiednie fibroblasty z niedoborem. Odkrycie przez Kaplana i wsp., że najlepszym inhibitorem wychwytu β-glukuronidazy był mannozo-6-fosforan (M6P), oraz ich sugestia, że M6P był (lub był częścią) długo poszukiwanego sygnału rozpoznawczego, było zaskakujące, ponieważ wcześniej nie odnotowano istnienia żadnego fosforylowanego węglowodanu na glikoproteinach ssaków. Został on natychmiast potwierdzony dla wychwytu α-l-iduronidazy i innych enzymów lizosomalnych, przy użyciu różnych metod biochemicznych; ostateczny dowód pochodzi z analizy strukturalnej fosforylowanych grup węglowodanowych. Sygnał odkryty poprzez endocytozę okazał się również sygnałem do kierowania rodzących się hydrolaz do lizosomów .

Wada w chorobie komórek I, która uniemożliwia komórkom syntezę sygnału rozpoznawania M6P, została wykazana jako niedobór pierwszego z dwóch enzymów biorących udział w syntezie sygnału M6P . Odkryto dwa receptory dla M6P; chemia i biologia receptorów M6P oraz ich rola w handlu komórkami stały się szeroką i bardzo aktywną dziedziną biologii komórki. Tematy te są przedmiotem wielu przeglądów, w tym rozdziałów 3 i 5 niniejszego tomu. Znaczenie systemu M6P dla enzymatycznej terapii zastępczej zostanie omówione poniżej.

Współbieżnie z tymi badaniami w hodowlanych fibroblastach, system in-vivo doprowadził do znalezienia innego sygnału dla wychwytu enzymów lizosomalnych. Kilka enzymów lizosomalnych, wstrzykiwanych dożylnie szczurom, zostało szybko usuniętych z krążenia; jednak utrzymywały się one znacznie dłużej, jeśli były wstępnie traktowane periodate lub jeśli były współwystępowały z agalaktoglikoproteiną. Ponownie, postulowano, że węglowodany dostarczają sygnałów do specyficznego rozpoznania. W tym przypadku, kluczowym cukrem dla rozpoznania była mannoza, a wychwyt następował do komórek siateczkowo-śródbłonkowych wątroby. Wykazano, że receptor mannozy, który rozpoznaje N-acetyloglukozaminę i l-fukozę, jak również mannozę, występuje na powierzchni makrofagów. Historycznie interesujące jest to, że eksperymenty z wychwytem inwertazy, które zajmowały poczesne miejsce w pierwotnej propozycji enzymatycznej terapii zastępczej (patrz wyżej), zakończyły się sukcesem, ponieważ inwertaza jest glikoproteiną z łańcuchami mannanu, które są rozpoznawane przez receptor mannozy .

.