Wyniki
Biotypowanie izolatów Shewanella według dwóch odrębnych schematów dało podobne wyniki (Tabela 1). Większość izolatów klinicznych (74%) należała do biotypu 2 Gilardi (CDC biotype 2), wykazując negatywny wpływ na sacharozę i maltozę podczas wzrostu na agarze SS oraz na podłożach zawierających wysokie stężenia NaCl. Jedyną istotną różnicą odnotowaną pomiędzy schematem klasyfikacji Gilardi (6) i Weyant et al. (22) było to, że izolaty biotypu 3 (sacharozo-, maltozo-, SS- i NaCl-ujemne) nie były grupowane przez system biotypowania CDC. W przeciwieństwie do izolatów ludzkich, wśród szczepów nie-ludzkich dominował biotyp 1 (CDC biotype 1) (67%). Szczepy te zazwyczaj wytwarzały kwas z maltozy i/lub sacharozy i nie rosły na agarze zawierającym duże ilości soli lub na agarze SS. W oparciu o ostatnie propozycje taksonomiczne Nozue i innych (15), szczepy biotypu 2 (CDC biotyp 2) zostałyby zidentyfikowane jako S. alga, podczas gdy wszystkie szczepy biotypu 1 (CDC biotyp 1) i 6 z 7 szczepów biotypu 3 zostałyby oznaczone jako S. putrefaciens; pozostały szczep biotypu 3 został następnie zidentyfikowany jako S. alga. Stwierdzono, że klinicznie dominuje S. alga (77%), podczas gdy większość izolatów niepochodzących od ludzi (89%) została potwierdzona jako S. putrefaciens (Tabela 1).
- View inline
- View popup
Biovar, biotyp i oznaczenia gatunkowe izolatów Shewanella według różnych schematów
Wszystkie 10 izolatów Shewanella, podczas badań na systemach API 20E, API NFT, RapID NF Plus i Vitek, zostało zidentyfikowanych jakoS. putrefaciens, z jednym wyjątkiem. Cztery z pięciu izolatów S. putrefaciens dały niedopuszczalne numery profilu w systemie API 20E (nr 0602026 i 0602006); piąty szczep wygenerował rzadki numer biotypu dla S. putrefaciens. Wszystkie szczepy S. alga uzyskały doskonałą identyfikację jako S. putrefaciens w systemie API 20E. System API NFT zidentyfikował wszystkie 10 izolatów Shewanella jako S. putrefaciens z identyfikacją od dobrej do doskonałej, z jednym wyjątkiem, również będącym szczepem S. putrefaciens (niska wartość dyskryminacyjna, 48 h). RapID NF Plus zidentyfikował wszystkie 10 izolatów Shewanella jako S. putrefaciens, z dokładnością 99,9%. Podobnie, wszystkie szczepy zostały zidentyfikowane przez Vitek (dokładność od 97 do 99%) jako S. putrefaciens, chociaż trzy szczepy S. putrefaciens wymagały od 5 do 9 godzin inkubacji przed ostateczną identyfikacją, w przeciwieństwie do 4-godzinnych wyników dla pozostałych 7 szczepów. Reakcje węglowodanowe (arabinoza i maltoza) w systemach API 20E, API NFT i Vitek pozwalają jednak na prawidłowe przypisanie większości szczepów do odpowiednich taksonów (S. putrefaciens i S. alga), jeśli odczytywane są ręcznie po ostatecznej identyfikacji jako S. putrefaciens.
Porównanie właściwości biochemicznych i enzymatycznych gatunków Shewanella ujawniło szereg różnic (Tabela 2). Hemolizę na agarze z krwią owczą, jak podali Nozue i wsp. (15), wykryto u wszystkich szczepów S. alga, ale tylko u kilku izolatów S. putrefaciens. Większość szczepów S. alga wykazywała ten fenotyp dopiero po dłuższej inkubacji (48 do 72 h), a obszar hemolizy był często nieregularny i trudny do wykrycia. Potwierdzono inne aktywności, które wcześniej uznano za pomocne w rozdzieleniu S. alga i S. putrefaciens, takie jak wzrost w temperaturze 42°C, wzrost na podłożach zawierających wysokie stężenia soli (6,5%) oraz wytwarzanie kwasu z l-arabinozy, sacharozy i maltozy. Stwierdziliśmy znacznie większą liczbę szczepów S. putrefaciens, które rosły na podłożu SS agar niż wcześniej opisywano; większość z nich pochodziła ze źródeł pozaludzkich. Z wyjątkiem rybozy, produkcja kwasu w wyniku utleniania węglowodanów była unikalnie związana z S. putrefaciens. Wzorce cukrowe różniły się jednak znacząco wśród tych izolatów, niektóre były pozytywne na arabinozę, maltozę i sacharozę, podczas gdy inne były pozytywne tylko na maltozę lub były asacharolityczne (szczepy biowar 3). Wśród wybranych izolatów Shewanella wykryto kilka nowych aktywności enzymatycznych, które według naszej wiedzy nie były wcześniej opisywane. Należały do nich tyrozynaza, alkilosulfataza, chitynaza i elastaza (Tabela 2); większość z tych enzymów wykryto w niehumanitarnych izolatach S. putrefaciens. Większość szczepów S. alga i S. putrefaciens wytwarzała siderofor, jak określono w testach Chrome Azurol S. Aktywność ta była słaba, a pięć izolatów S. putrefaciens wytwarzało siderofor. Aktywność ta była słaba, a pięć izolatów (trzy S. alga i dwa S. putrefaciens) nie rosło na tym podłożu.
- View inline
- View popup
Właściwości biochemiczne i enzymatyczne S. alga i S. putrefaciens
Wyselekcjonowane izolaty Shewanella, które dobrze rosły w 35°C były dalej charakteryzowane pod kątem aktywności enzymatycznej przy użyciu API-ZYM (Tabela 3) oraz pod kątem komórkowych profili kwasów tłuszczowych przy użyciu systemu MIDI. Spośród dziewięciu substratów atakowanych przez jeden lub oba gatunki Shewanella za pomocą API-ZYM, wyższe ogólne aktywności dla siedmiu z tych enzymów były związane z S. alga. Jedyną aktywnością, która okazała się silniejsza u S. putrefaciens była arylamidaza waliny, chociaż aktywność ta była wyjątkowo słaba nawet u tych szczepów. Oba gatunki wytwarzały jednakowo silną aktywność fosfatazy alkalicznej. Dodatkową obserwacją było to, że wszystkie szczepy S. alga konsekwentnie wytwarzały osiem z tych dziewięciu enzymów, jedynym wyjątkiem była arylamidaza walinowa. Z kolei S. putrefaciens był bardziej heterogenny, przy czym cztery z dziewięciu wykrytych enzymów nie były powszechnie obecne we wszystkich izolatach. Analiza 14 szczepów Shewanella wykazała, że dominującymi kwasami tłuszczowymi były i-15:0, 17:1ω8c i 16:0; niektóre szczepy wytwarzały duże ilości 16:1ω7c (od 9 do 18%), podczas gdy inne produkowały znikome ilości. Podczas gdy większość pików kwasów tłuszczowych była dość spójna wśród badanych szczepów S. alga i S. putrefaciens, zauważono kilka różnic (Tabela 4). Wyższe średnie wartości kwasu pentadekanowego i kwasu cis-9-heptadecenowego (17:1ω8c) odnotowano dla S. alga, podczas gdy odwrotnie było w przypadku S. putrefaciens, jeśli chodzi o kwasy heksadekanowy i dodekanowy. Dla kwasu heksadekanowego nie zaobserwowano nakładania się zakresu całkowitych kwasów tłuszczowych między S. alga i S. putrefaciens; dla kwasu pentadekanowego i 17:1ω8c tylko jeden izolat S. putrefaciens lub S. alga wytworzył wartość, która mieściła się w zakresie drugiego. Chociaż żaden pojedynczy pik nie był diagnostyczny, wykorzystanie wszystkich czterech pików razem wyraźnie rozdzieliło 14 szczepów Shewanella na dwie grupy wzdłuż linii gatunkowych.
- View inline
- View popup
Właściwości enzymatyczne Shewanellaspecies określone za pomocą testu API-ZYM
- View inline
- View popup
Separacja S. alga i S. putrefaciens poprzez analizę kwasów tłuszczowych
Stwierdzono, że 23 szczepy S. putrefaciensc można podzielić na trzy odrębne grupy w oparciu o kilka cech fenotypowych (Tabela 5). Grupa 1, w skład której wchodziło osiem szczepów, w tym ATCC 8073, wytwarzała kwas z maltozy, sacharozy i arabinozy oraz wykorzystywała kwas urokaninowy. Szczepy grupy 1 były równomiernie podzielone między izolaty kliniczne i izolaty niepochodzące od ludzi. Szczepy grupy 2 (n = 6), w tym ATCC 8071, różniły się od szczepów grupy 1 przede wszystkim niezdolnością do utleniania sacharozy i maltozy. Ponownie, połowa tych szczepów pochodziła z materiału klinicznego. Szczepy z grupy 3 (n = 9), wszystkie pochodzenia środowiskowego (okolice jeziora Michigan), różniły się znacznie od szczepów z grup 1 i 2. Rosły słabo lub nie rosły w temperaturze 35°C, wytwarzały chitynazę i nie były wybarwione na agarze tryptofanowym. Wszystkie dziewięć szczepów z grupy 3 początkowo wytwarzało α-glukozydazę, ale przy ponownym badaniu tylko trzy szczepy były stale pozytywne. Maltoza była utleniana, ale nie sacharoza czy arabinoza. W przeciwieństwie do grup 1 i 2, kwas urokaninowy nie był wykorzystywany jako źródło energii.
- View inline
- View popup
Biogrupy S. putrefaciens
Ostatnio Vogel i współpracownicy (21) zauważyli różnice pomiędzy S. alga i S. putrefaciens w ich wrażliwości na niektóre środki przeciwbakteryjne, w tym penicylinę, ampicylinę i tetracyklinę. To, w połączeniu z raportem łączącym aktywność hemolityczną z S. alga i jej widocznym związkiem z chorobami człowieka, sugeruje możliwe różnice w patogenności między tymi dwoma gatunkami (Tabela6). Wybraliśmy zatem 10 szczepów (po 5 z każdego gatunku) do dalszej analizy. Chociaż nie zauważyliśmy większych różnic we wrażliwości na penicylinę, ampicylinę i tetracyklinę między tymi dwiema grupami w zależności od kategorii wrażliwości (wrażliwa, pośrednia lub oporna), zauważyliśmy, że średnie MIC dla S. alga dla penicyliny, ampicyliny i tetracykliny (odpowiednio ∼200, 56 i 5.2 μg/ml, odpowiednio) były większe niż odpowiednie MIC dla S. putrefaciens (odpowiednio 3, 1,3, i 1,1 μg/ml).
- View inline
- View popup
Właściwości wirulencji gatunków Shewanella
Cztery z pięciu szczepów S. putrefaciens przylegały słabo (+) do silnie (+++) (Tabela 6) do komórek HEp-2 w testach adherencji; w przeciwieństwie do nich, żaden ze szczepów S. alga nie wykazywał podobnych właściwości adhezyjnych, chociaż cztery szczepy silnie wiązały się z podłożem szkiełek szklanych. Aktywności inwazyjnej nie wykryto u żadnego szczepu S.hewanella. Chociaż w przypadku wszystkich pięciu szczepów S. alga zaobserwowano opóźnioną reakcję hemolityczną na agarze z krwią owczą (Tabela 2), nie wykryto hemolizy beta przy użyciu techniki nakładania agaru lub testów bulionowych (Tabela 6); kontrolne szczepy E. tarda uzyskały wynik pozytywny w ciągu 1 h w obu testach. W przypadku wszystkich pięciu szczepów S. alga (i jednego izolatu S. putrefaciens), podczas badań adhezji i inwazji obserwowano niekiedy słabą reakcję cytotoksyczną. Ta reakcja cytotoksyczna objawiała się pojawieniem się komórek HEp-2 o nieprawidłowej morfologii komórkowej, w tym szczątków komórkowych (ghosts). Stwierdzono jednak różnice w patogenności dla myszy między tymi dwoma gatunkami, ponieważ średnia LD50 u myszy Swiss Webster dla S. algawas 1,9 × 108 CFU, podczas gdy dla S. putrefaciens wynosiła 8,4 × 108 CFU (P < 0,02).
.