A critical role of CD29 and CD49f in mediating metastasis for cancer-initiating cells isolated from a Brca1-associated mouse model of breast cancer

CSCs in Brca1-mutant cancer cells mediate cell migration in vitro

We have previously isolated CD24+CD29+ cells and CD24+CD49f+ cells that are enriched for cancer-initiating cells or CSCs from primary mammary tumors developed in Brca1-mutant mice or from a cultured cell line, (W0069), która została uzyskana z guza sutka z mutacją Brca1.39 W celu zbadania roli tych komórek w przerzutach, wyselekcjonowaliśmy komórki CD24+CD29+ (zwane dalej CSCs) i komórki CD24-CD29- (non-CSCs) z linii komórkowej W0069, która zawierała około 15% komórek CD24+CD29+, jak wykazano wcześniej,39 i zbadaliśmy zdolność do migracji przy użyciu zarówno testu gojenia ran, jak i testu transwaginalnego. Po 24 godzinach komórki CD24/CD29 podwójnie dodatnie wykazywały lepszą zdolność migracji w porównaniu z komórkami podwójnie ujemnymi, co wykazano na podstawie wielkości rany (Figura 1a). Test migracji Transwell ujawnił również znaczącą różnicę w liczbie migrujących komórek zarówno na dolnej powierzchni filtra (175,6±19 vs 54,2±18,1, **P<0,01), jak i w dolnej komorze transwella (82,3±5,5 vs 4,3±2,1 kolonii, **P<0,01) (Figura 1b). Podobne wyniki uzyskano badając różne subklony pochodzące z tej samej linii komórkowej, zarówno pozytywne jak i negatywne na obecność CSCs (dane nie pokazane). Aby potwierdzić, że CSCs mają zwiększoną ruchliwość, zmieszaliśmy różne ilości komórek W0069 z podwójnie negatywnymi komórkami wysortowanymi z linii komórkowej W0069. Jak pokazano na Figurze 1c, zdolność migracji spadła wraz ze zmniejszeniem liczby podwójnie dodatnich komórek, chociaż całkowita liczba użytych komórek pozostała stabilna poprzez zwiększenie liczby komórek CD24-CD29-. Zaczynając od 5 × 104 komórek W0069, stwierdziliśmy, że migrujące komórki utworzyły 52,6±15,5 kolonii w dolnej komorze. Kiedy 4 × 104 komórki W0069 zmieszano z 1 × 104 komórkami podwójnie ujemnymi, liczba kolonii zmniejszyła się do 16±2,6. Liczba kolonii uległa dalszemu zmniejszeniu, gdy zmniejszaliśmy liczbę komórek W0069 i zwiększaliśmy liczbę komórek CD24-CD29- (Figura 1c). Takie same wyniki uzyskano, gdy komórki W0069 zmieszano z podklonem (W0069-202), który ma tylko komórki CD24-CD29- (Supplementary Figure 1a i b). I odwrotnie, wykazaliśmy, że liczba kolonii została zwiększona, gdy liczba użytych komórek CD24+CD29+ została stopniowo zwiększona (Supplementary Figure S1c). Aby dokładniej zweryfikować rolę CSCs w migracji, użyto komórek znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym W0069, pozytywnych na obecność CSCs, i zmieszano je z posortowanymi, nie znakowanymi komórkami CD24-CD29-. Zwiększając liczbę pozytywnych komórek, zauważyliśmy wzrost liczby kolonii utworzonych przez migrujące komórki, a wszystkie utworzone kolonie były zielone podczas sprawdzania pod mikroskopem fluorescencyjnym, co sugeruje, że migracja może być widoczna tylko wtedy, gdy komórki CD24+CD29+ są obecne w hodowli komórkowej (Figura 1d i e). Łącznie dane te sugerują, że CSCs wykazują zwiększoną ruchliwość w liniach komórkowych raka zmutowanego w Brca1.

CSCs in Brca1-mutant cancer mediate cancer metastasis in vivo

Następnie oceniliśmy potencjalną rolę CSCs w przerzutach in vivo. Świeżo posortowane komórki CD24+CD29+ i CD24-CD29-, jak również subklony pozytywne lub negatywne dla tych samych markerów z linii komórkowej W0069 zostały wszczepione do gruczołu sutkowego 6-8-tygodniowych dziewiczych myszy athymicznych (nagich). Po pierwsze, zauważyliśmy, że wzrost guza był wolniejszy, gdy posortowane komórki CD24-CD29- były porównywane z komórkami CD24+CD29+ (Figura 2a i b), co jest zgodne z poglądem, że ta populacja wzbogaca się o CSCs.39 Podobne wyniki uzyskano, gdy użyto subklonów zarówno pozytywnych, jak i negatywnych na obecność CSCs (dane nie pokazane). Chociaż myszy wstrzyknięte z komórkami CD24+CD29+ musiały być uśmiercone wcześniej (dzień 49-54) niż myszy wstrzyknięte z komórkami CD24-CD29- (dzień 60-69) z powodu większego obciążenia guza, nastąpił znaczący wzrost obecności przerzutów w grupie myszy wstrzykniętych z komórkami CD24+CD29+. W szczególności, 3/15 myszy wszczepionych z negatywnymi liniami komórkowymi miało jeden mały guzek nowotworowy w płucu na mysz (Figura 2c i d). W przeciwieństwie do tego, u 13/18 myszy wszczepionych z pozytywnymi liniami komórkowymi stwierdzono obecność guzków przerzutowych w płucach z całkowitą liczbą ponad 100 guzków (liczba ta może być niedoszacowana, ponieważ rozmiar większości guzków był znacznie większy, a guzki nie mogły być dokładnie policzone, gdy było ich zbyt wiele w jednym płucu) (Figura 2c i d). Ponieważ istniała około siedmiokrotna (5000mm3/700mm3) różnica w wielkości guza pierwotnego między guzami pozytywnymi i negatywnymi, rozważaliśmy możliwość, że różnica w przerzutach może być przypisana różnicy we wzroście guza. Wiadomo jednak, że przerzuty nowotworowe zaczynają się w początkowych stadiach, gdy guzy są małe, a nie w późnych stadiach, gdy są duże,40 co przemawia przeciwko tej możliwości. Co więcej, różnica w liczbie guzków jest około 33-krotna (100/3), a większość guzków pochodzących z komórek podwójnie dodatnich jest znacznie większa niż z komórek podwójnie ujemnych, co podkreśla różną zdolność do przerzutów tych dwóch subpopulacji. Jeśli chodzi o pochodzenie trzech guzków przerzutowych, możliwe jest, że populacja podwójnie ujemna może nadal zawierać niektóre komórki, które mają niższą zdolność do inicjowania raka i przerzutów. Alternatywnie, niektóre komórki CD24-CD29- mogą uzyskać te zdolności poprzez de-dyferencjację. Są to interesujące zagadnienia, które zasługują na dalsze badania.

CD29 i CD49f mają krytyczną rolę w pośredniczeniu w przerzutach nowotworowych

Co ciekawe, profilowanie tych guzów przerzutowych za pomocą analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją przy użyciu markerów CD24 i CD29 ujawniło, że te z podwójnie pozytywnych linii komórkowych miały podobny profil do guzów pierwotnych lub oryginalnej linii komórek nowotworowych (Figura 3a, po lewej). Ponieważ tylko CSCs w obrębie guza mogą odtworzyć heterogeniczność pierwotnego guza, wskazuje to, że CSCs przerzutują i napędzają powstawanie guzów przerzutowych. W przeciwieństwie do tego, żadnych komórek CD24 i CD29 podwójnie pozytywnych nie wykryto w guzach pochodzących z negatywnych linii komórkowych, nawet po ich przerzutach (Figura 3a, prawa), jak ujawniono w analizie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją. Co więcej, byliśmy w stanie wykryć komórki CD24+CD29+ przez barwienie immunofluorescencyjne w guzach przerzutowych w płucach z guzów zainicjowanych przez wszczepienie komórek CD24+CD29+ (Figura 3b), ale nie z guzów zainicjowanych przez wszczepienie komórek CD24-CD29- (dane nie pokazane). Zgodnie z obserwacją, że komórki CD24+CD29+ mają większą ruchliwość niż komórki CD24-CD29-, barwienie przeciwciałami do CD24 i CD29 również wykryło komórki CD24+CD29+ w migrujących komórkach podczas testu gojenia się rany (Figura 3c). Wyniki te wspierają koncepcję, że CSCs wykazują zwiększoną ruchliwość zarówno in vitro, jak i in vivo i odgrywają kluczową rolę w napędzaniu zdolności przerzutowej guzów sutka zmutowanych w Brca1.

Zarówno CD29 (integryna β1), jak i CD49f (integryna α6) są podjednostkami integryn, które służą jako receptory macierzy zewnątrzkomórkowej.41 Ponieważ macierz zewnątrzkomórkowa jest zaangażowana w mobilność komórek i przerzuty nowotworów,41 byliśmy zainteresowani ustaleniem, czy CD29 i CD49f służą jedynie jako markery dla CSCs, czy też faktycznie mają krytyczną rolę w pośredniczeniu w przerzutach nowotworów. Najpierw znokautowaliśmy CD29 w komórkach W0069 i CD24+CD29+ za pomocą indywidualnego małego interferującego RNA (siRNA) skierowanego na otwartą ramkę odczytu CD29, a nasze dane ujawniły zauważalną, ale nie statystycznie zmniejszoną migrację komórek siCD29 w porównaniu z komórkami kontrolnymi (Figura 4a i b). Ponieważ CD29 i CD49f tworzą heterodimery, podejrzewaliśmy, że CD49f może kompensować pewne funkcje, gdy ekspresja CD29 jest zaburzona. Aby to zbadać, następnie znokautowaliśmy CD49f przez siRNA w tych komórkach (Figura 4a). Nasze dane wskazują, że knockdown samego CD49f również nieznacznie zmniejszył zdolność migracji komórek do podobnego poziomu obserwowanego w komórkach traktowanych siCD29 (Figura 4b). Jednak wyraźne zmniejszenie migracji komórek, ale nie ich żywotności, zaobserwowano, gdy oba te czynniki zostały znokautowane w tym samym czasie (Figura 4a-d). Takie same wyniki uzyskano przy użyciu puli siRNA przeciwko czterem różnym regionom w otwartej ramce odczytu tych genów (Supplementary Figure 2a-c). Sprawdziliśmy również ekspresję czterech pokrewnych integryn (integryny α5 i 7 oraz integryny β2 i 3) po znokautowaniu CD29 i CD49f, a dane wskazują, że te siRNA nie zmieniły ekspresji innych integryn, wykluczając krzyżową aktywność hamującą tych siRNA do innych integryn (Supplementary Figure 2d). Podsumowując, wyniki te sugerują, że integryny α6 i β1 mogą mieć nakładającą się, ale krytyczną rolę funkcjonalną w migracji CSCs. Tak więc sortując komórki przy użyciu integryn α6 i β1 jako markerów, faktycznie wzbogacamy komórki, w których te białka mogą mieć funkcjonalną rolę w pośredniczeniu w migracji komórek in vitro i przerzutach nowotworowych in vivo.

CSCs exhibited epithelial to mesenchymal transition signature gene expression

Aby zrozumieć mechanizm leżący u podstaw zwiększonej zdolności CSCs do przerzutów, przeprowadziliśmy analizy morfologiczne i molekularne zarówno na komórkach CD24+CD29+, jak i CD24-CD29-. Nasza analiza wykazała, że komórki CD24-CD29- wykazywały bardziej widoczne wiązanie błonowe E-kadheryny, markera komórek nabłonkowych, niż komórki CD24+CD29+ (Figura 4e). Analiza qRT-PCR również wykryła wyższy poziom ekspresji E-kadheryny w komórkach CD24-CD29- niż w komórkach CD24+CD29+ (Figura 4f). Spójnie z obniżonym poziomem ekspresji E-kadheryny, komórki CD24+CD29+ wykazywały również wyższy poziom ekspresji kilku genów markerów dla komórek mezenchymalnych, jak ujawniono przez qRT-PCR (Figura 4f) i analizę western blot (Supplementary Figure 2e). Ponieważ oba typy komórek pochodziły z raka przewodowego sutka, wzmocniona mezenchymalna cecha komórek CD24+CD29+ sugeruje, że przeszły one transformację nabłonkową do mezenchymalnej, co stanowi molekularną podstawę ich zwiększonej ruchliwości in vitro i przerzutów nowotworowych in vivo.

Podsumowując, zbadaliśmy potencjał przerzutowy CSCs wzbogaconych w populację komórek CD24+CD29+ wyizolowanych z mysiego modelu raka piersi z mutacją Brca1, a nasze dane wskazują, że CSCs wykazywały znacznie wyższą zdolność migracji niż nie-CSCs w hodowli tkankowej i zwiększony potencjał przerzutowy u myszy allograft-nude. Wykazaliśmy, że komórki CD24+CD29+ zachowały zdolność do różnicowania się i odtwarzania heterogenności w guzach przerzutowych, podczas gdy komórki CD24-CD29- nie mogły tego robić. Jednak najbardziej intrygującym odkryciem jest to, że CD29 i CD49f, które zostały użyte jako markery do izolacji CSCs z mysich guzów sutka,39, 42, 43 mają nakładającą się, ale krytyczną rolę w pośredniczeniu w migracji CSCs. U myszy β1-integryna reprezentuje dominującą integrynę w komórkach nabłonka sutka i odgrywa kluczową rolę w progresji nowotworu.44 Natomiast w ludzkich rakach piersi integryna α6 ulega ekspresji na wysokim poziomie i służy jako niezależny czynnik prognostyczny, jak wykazano w badaniu z efektem zależnym od czasu, ograniczonym do pierwszych 2 lat obserwacji.45 Mimo to potencjalna rola obu genów w CSCs raka piersi pozostaje nieuchwytna. Nasze dane wskazują, że upośledzenie funkcji samej integryny β1 lub integryny α6 powoduje znacznie łagodniejszy efekt niż jednoczesne wybijanie obu genów. Odkrycie to jest zgodne z faktem, że obie integryny mogą łączyć się w pary, tworząc heterodimery dla składników macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak fibronektyna i laminina.41, 46, 47, 48, 49 Sugeruje się, że złośliwa sieć społeczna pośredniczy w adhezji komórka-komórka i komunikacji między CSCs i ich mikrośrodowiskiem.20, 21 Nasze badanie sugeruje ważną rolę integryn β1/α6 w pośredniczeniu w tej sieci. W szczególności, integryny β1/α6 mogą pośredniczyć w interakcji CSCs-stroma, przekazując sygnalizację macierzy zewnątrzkomórkowej do maszyn komórkowych i prowadząc do zwiększonej aktywności CSCs w zakresie żywotności, różnicowania i przerzutowania.

.