Żywnościowy kationowy antybakteryjny ε-poliglizyna przejściowo zmienia społeczność mikrobiomu jelitowego i przewidywaną funkcję metagenomu u myszy CD-1 mice

A cationic antimicrobial biopolymer influences murine gut community diversity

40 samic i 40 samców 6-tygodniowych myszy CD-1 zostało losowo podzielonych na cztery grupy i posegregowanych według płci (tj.(tj. 10 samic i 10 samców w każdej grupie) i karmiono 20% dietą wysokotłuszczową uzupełnioną (i) samą maltodekstryną (MD), która służyła jako kontrola, (ii) maltodekstryną + ε-poliglotyną (PL), (iii) maltodekstryną + pektyną (P) oraz (iv) maltodekstryną + ε-poliglotyną + pektyną (PL-P). Poprzednie badania wykazały, że myszy trzymane razem wykazują podobne zbiorowiska mikroorganizmów jelitowych.38, 39 Dlatego też w 24-godzinnych klatkach metabolicznych zbierano zbiorcze granulki kału z każdej klatki i analizowano je w trzech punktach: tydzień 1 (faza podstawowa), tydzień 5 (faza pośrednia) i tydzień 9 (faza końcowa) (ryc. 1). Masa ciała i spożycie pokarmu nie różniły się niezależnie od grupy leczenia i w całym okresie eksperymentalnym.

W celu scharakteryzowania różnorodności filogenetycznej, fragment V3/V4 genu 16S rRNA był sekwencjonowany w celu uzyskania 15 739 734 wysokiej jakości odczytów po filtrowaniu.40 Zapewniło to średnią głębokość próbki 327 911 odczytów sekwencjonowania dla każdej społeczności bakteryjnej. Aby ocenić α-różnorodność w obrębie danej społeczności, liczbę obserwowanych operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) obliczono przy użyciu ważonego UniFrac.41 Krzywe rzadkości dla obserwowanych OTU (Ryc. S1) zbliżyły się do asymptoty niezależnie od diety, punktu pobierania próbek i płci, co wskazuje, że głębokość sekwencjonowania w wystarczającym stopniu pokryła różnorodność OTU obecnych w społecznościach wyodrębnionych z próbek kału.

Na poziomie azylu, suma Actinobacteria, Bacteroidetes, Deferribacteres, Firmicutes, Proteobacteria, Verrucomicrobia stanowiła ponad 99% OTU zidentyfikowanych we wszystkich analizowanych próbkach. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami,42,43 mikrobiom jelitowy myszy składa się z relatywnie dużego wkładu dostarczanego przez gromady Bacteroidetes i Firmicutes (Ryc. 2). Jest to zgodne z innymi zbiorowiskami jelitowymi ssaków, w tym ludzi i naczelnych.44, 45 Jednakże względna liczebność Bacteriodetes (p < 0,05) i Firmicutes (p < 0,05) była zmieniona w odpowiedzi na konkretny biopolimer diety (wielokierunkowa ANOVA) (ryc. 2). Co ciekawe, u myszy karmionych kompleksem ε-polizyna-pektyna zaobserwowano wzrost liczby Bacteriodetes o 8,82% (p < 0,05, wielokierunkowa ANOVA Tukey HSD post-hoc) przy jednoczesnym spadku liczby OTU przypisanych do Firmicutes o 11,13% (p < 0,05, wielokierunkowa ANOVA Tukey HSD post-hoc). Jest to relatywne do struktury zbiorowiska oznaczonego w grupie kontrolnej karmionej maltodekstryną (Tabela S1). Co więcej, myszy karmione ε-poliglatyną (tj. bez kompleksu pektyn) wykazywały w pośredniej fazie (tj. 5 tygodni) badania zbiorowisko stosunkowo ubogie w Firmicutes. Co godne uwagi, OTU Firmicute powróciły do swojego początkowego stężenia w 9-tygodniowym punkcie pobierania próbek (poziom podstawowy: 55,24%, pośredni: 34,71%, końcowe: 59,01%, linia bazowa vs. pośrednia: p < 0,05, pośrednia vs. końcowa: p < 0,05, wielokierunkowa ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Fig. 2 i Tabela S3). Wykazując tę samą reakcję adaptacyjną, względna frakcja Bacteriodetes OTUs przejściowo wzrosła po 5 tygodniach karmienia i zbliżyła się do początkowych stężeń w końcowym punkcie czasowym (poziom wyjściowy: 35,40%, pośredni: 51,18%, końcowy: 28,82%, bazowy vs. pośredni: p < 0,05, pośredni vs. końcowy: p < 0,05, wielokierunkowa ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Ryc. 2 i Tabela S3). Podobny przejściowy wzrost Verrucomicrobia wystąpił u myszy karmionych samą pektyną, aby spaść do pierwotnego poziomu w końcowym punkcie pobierania próbek (linia podstawowa: 0,59%, pośrednia: 5,46%, końcowy: 1,01%, linia bazowa vs. pośrednia: p < 0,05, pośrednia vs. końcowa: p < 0,05 wielokierunkowa ANOVA Tukey HSD post-hoc) (Figura 2 i Tabela S4). Łącznie, wyniki te wskazują, że specyficzne biopolimery spożywcze przejściowo kierują reprezentacją filogenów w jelitach myszy. Zaobserwowano to, gdy zarówno ε-poliglicyna, jak i pektyny były włączane pojedynczo. Natomiast, gdy ε-poliglicyna była skompleksowana z anionową pektyną, zjawisko to nie było obserwowane. Warto zauważyć, że znaczące przepływy populacji w obrębie Actinobacteria, Deferribacteres, i Proteobacteria nie były obserwowane niezależnie od diety (Tabela S5).

W uzupełnieniu do zaburzenia społeczności na poziomie azylu, kilka rodzajów bakterii przesunięte w odpowiedzi na biopolimery diety. Obejmuje to członków rodzaju Bacteroides, którzy byli najczęściej spotykanym taksonem w jelitach myszy (14.32 ± 9.58% we wszystkich próbkach). W sumie (dla obu płci i punktów pobierania próbek), reprezentacja Bacteroides różniła się w zależności od grupy odżywiania biopolimerami. Odzwierciedlając odpowiedź azylu Bacteroidetes, ε-polilicyna (p < 0,05, wielokierunkowa ANOVA Tukey HSD post-hoc) i ε-polilicyna-pektyna złożone leczenie (p < 0,05, wielokierunkowa ANOVA Tukey HSD post-hoc) zwiększyły populacje Bacteroides spp. o 7,95 i 7,46%, odpowiednio, w porównaniu do grupy kontrolnej maltodekstryny (Fig. 3 i Tabela S6). Inne populacje bakterii, które były modulowane przez reżim żywieniowy to Adlercreutzia, Lactobacillus, Turicibacter i Ruminococcus (wielokierunkowa ANOVA, p < 0,05). W szczególności, liczebność Adlercreutzia zmniejszyła się niezależnie od biopolimeru w stosunku do grupy żywionej maltodekstryną. Ich względna populacja zmniejszyła się odpowiednio o 0,18%, 0,22%, 0,24% u myszy karmionych ε-poliglityną, pektyną i kompleksem ε-poliglityna-pektyna. Ponadto rodzaj Ruminococcus uległ znacznemu zmniejszeniu o 1,39% w odpowiedzi na ε-polizynę i o 1,44% w grupie pektyn. Co więcej, dieta z kompleksem ε-polilicyna-pektyna istotnie zmniejszyła zawartość Lactobacillus o 4,95%, odzwierciedlając ogólne zmniejszenie liczby Firmicutes w tej grupie. W przeciwieństwie do diety pektynowej, która wzbogaciła się o Turicibacter w stosunku do pozostałych trzech diet. Pełny katalog rodzajów różniących się w odpowiedzi na warunki biopolimerowe jest podany w Tabeli S6.

Maltodekstryna jest powszechnie stosowana jako środek zagęszczający lub wypełniacz w różnych zastosowaniach żywieniowych. Ten polisacharyd był stosowany w składzie wszystkich diet leczniczych, a zatem służył jako kontrola do określenia czy sama maltodekstryna wzbogaci bakterie zdolne do hydrolizy wiązań α-1-4 glikozydowych między resztami d-glukozy. Jako taka, względna liczebność Coprococcus w jelitach myszy została wzbogacona podczas spożywania maltodekstryny zawartej w pożywieniu. Trajektoria odpowiedzi obejmowała znaczący wzrost między punktem wyjściowym a pośrednimi punktami pobierania próbek oraz między punktem wyjściowym a końcowym punktem czasowym (punkt wyjściowy: 0,56%, pośredni: 0,98%, końcowy: 0,91%, linia bazowa vs. pośredni: p < 0,05, linia bazowa vs. końcowy: p < 0,05) (Fig. 3 i Tabela S7).

W grupie leczonej ε-polilicyną, względna obfitość Bacteroides przejściowo wzrosła, zgodna z oscylacją na poziomie azylu (linia bazowa: 8,85%, pośredni: 34,40%, końcowa: 8,74%, linia bazowa vs. pośrednia: p < 0,05, pośrednia vs. końcowa: p < 0,05). Podobną odpowiedź zaobserwowano dla Oscillospira (linia podstawowa: 4,96%, pośrednia: 2,51%, końcowa: 6,13%, bazowa vs. pośrednia: p < 0,05, pośrednia vs. końcowa: p < 0,05). Kontrastuje z tym przejściowy spadek liczby OTU przypisanych do Ruminococcus (baseline: 2,17%, intermediate: 0,97%, końcowy: 2,10%, bazowy vs. pośredni: p < 0,05, pośredni vs. końcowy: p < 0,05), oraz Adlercreutzia (bazowy: 0,49%, pośredni: 0,24%, końcowa: 0,34%, linia podstawowa vs. pośrednia: p < 0,05) (Ryc. 3 i Tabela S8). Ponadto, Coprococcus spp. wykazywały trwałe wzbogacenie podczas karmienia, ze znaczącym wzrostem między punktem bazowym a końcowym punktem czasowym (linia bazowa: 0,47%, pośrednia: 0,71%, końcowy: 0,91%, linia podstawowa vs. końcowa: p < 0,05) (Fig. 3 i Tabela S8). Jest to zgodne z tym samym trendem obserwowanym w grupie kontrolnej maltodekstryny. Jednak populacje Coprococcus pozostają stosunkowo statyczne w kompleksach pektyny i ε-polizyny-pektyny podawanych myszom.

Pektyna przejściowo wzbogacona dla rodzaju Akkermansia (linia podstawowa: 0,59%, pośrednia: 5,46%, końcowe: 1,01%, baseline vs. intermediate: p < 0,05, intermediate vs. final: p < 0,05) przyczyniając się do obserwowanego pośredniego wzrostu Verrucomicrobia. W przeciwieństwie do tego, populacje Adlercreutzia zostały zmniejszone w pośrednim punkcie pobierania próbek i pozostały obniżone w końcowej obserwacji (Adlercreutzia baseline: 0.48%, intermediate: 0,23%, końcowa: 0,26%, linia bazowa vs. pośrednia: p < 0,05). Reprezentacja OTU rodzaju kandydującego rc4-4 zmniejszyła się proporcjonalnie, choć wykazywała niepełny powrót do stanów wyjściowych (rc4-4 baseline: 1,94%, intermediate: 1,04%, końcowy: 1,62%, baseline vs intermediate: p < 0,05) (ryc. 3 i tab. S9). Co ciekawe, Ruminococcus spp. utrzymywał malejącą trajektorię w trakcie całego badania żywieniowego, z istotnymi różnicami pomiędzy punktem wyjściowym i końcowym (wyjściowy: 2,32%, pośredni: 1,63%, końcowy: 1,14%: linia bazowa vs. końcowa: p < 0,05) (Fig. 3 i Tabela S9).

Ale większość rodzajów nie uległa zmianie w odpowiedzi na kompleksy ε-polizyna-pektyna, Ocscillospira przejściowo wzrosła przed spadkiem poniżej poziomów początkowych (linia bazowa: 3,56%, pośrednia: 4,70%, końcowy: 2,44%, pośredni vs. końcowy: p < 0,05). W przeciwieństwie do tego, populacje Parabacteroides były generalnie hamowane przez każdy z zabiegów dietetycznych (linia podstawowa: 3.44%, pośrednia: 0,79%, końcowe: 0,55%, linia bazowa vs. pośrednia: p < 0,05, linia bazowa vs. końcowa: p < 0,05). Jest to podobne do rc4-4 (linia podstawowa: 2,82%, pośrednia: 0,77%, końcowy: 0,48%, linia bazowa vs. pośrednia: p < 0,05, linia bazowa vs. końcowa: p < 0,05). W sumie, rodzaje mikrobioty jelitowej reagują na dodatki do żywności na poziomie rodzaju, w szczególności ε-polilicyny (ryc. 3 i tabela S10).

Oprócz biopolimerów pokarmowych wpływających na określone taksony, skład strukturalny społeczności miał dostrzegalne i nielosowe zmiany w agregacie. ANOSIM46 z 999 permutacjami został użyty do testowania znaczących różnic między grupami próbek w oparciu o ważony UniFrac.41 Zgodnie z oczekiwaniami, maltodekstryna nie zmieniła znacząco społeczności mikrobiomu jelitowego myszy karmionych tą kontrolą ani u samic, ani u samców myszy (ryc. 4a, ANOSIM z 999 permutacjami, p > 0,05). Odpowiednio, pektyny (ryc. 4c, ANOSIM z 999 permutacjami, p > 0,05) i kompleksy ε-polizyny-pektyny (ryc. 4d, ANOSIM z 999 permutacjami, p > 0,05) nie promowały znaczących zmian w społeczności. Jest to wyraźny kontrast z mikrobiomem jelitowym, który był przejściowo zmieniony przez samą ε-polilizę. Jak zaobserwowano w przypadku określonych grup taksonomicznych na poziomie azylu i rodzaju, struktura społeczności została zaburzona w punkcie 5 tygodni, aby następnie zostać rozwiązana w końcowym okresie pobierania próbek. Sugeruje to, że skład populacji został skorygowany do stanu początkowego poprzez adaptację do stale podawanego biopolimeru (Rys. 4b, ANOSIM z 999 permutacjami, p < 0.05). Nie zaobserwowano tego u myszy leczonych kompleksem ε-polizyna-pektyna, co wskazuje na osłonową interakcję ze środowiskiem mikrobiologicznym.

ε-polilicyna przejściowo przesuwa przewidywaną funkcję metagenomu

Potencjał metagenomiczny właściwy dla mikrobiomu jelitowego został wywnioskowany przez Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) w oparciu o dane filogenetyczne 16S rRNA. W sumie 6,854,103,780 obserwacji zostało przewidzianych w 6909 grupach ortologicznych (KO) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) w obrębie 48 społeczności jelitowych, które zostały sprofilowane przez PICRUSt. Dane wynikowe zostały skategoryzowane w 254 funkcjonalnych ścieżkach obejmujących wszystkie z 48 społeczności.

Gdy przewidywane metagenomy odpowiedziały na dietetyczną ε-poliglinę, nie wykryto znaczących różnic w pozostałych trzech grupach żywieniowych. Obejmuje to myszy karmione ε-poliglotyny kompleksowane z pektyny, zapewniając dalsze wsparcie dla elektrostatycznego ekranowania złagodzić antybakteryjny wpływ ε-poliglotyny. Sama pektyna nie zmienia struktury społeczności ani przewidywanej funkcji.

Płeć gospodarza wpływa na mikrobiom podstawowy, ale nie na trajektorię odpowiedzi

Zarówno samce, jak i samice myszy były obserwowane w celu określenia, czy aktywność biopolimerów w mikrobiomie jest zależna od płci. Odpowiednio, kilka taksonów bakterii kolonizowało samce i samice zwierząt asymetrycznie i w sposób nielosowy. Obejmuje to azyl Verrucomicrobia, który stwierdzono w wyższych stężeniach u samic myszy niż u samców łącznie (samice: 4,96% z 24 próbek, samce: 2,63% z 24 próbek, p < 0,05, wielokierunkowa ANOVA) (Tabela S11). Wiele z tego może wynikać z różnic w populacjach Akkermansia (samice: 4,50%, samce: 2,63% p < 0,05). Ponadto, samice myszy były siedliskiem istotnie większych populacji bakterii z rodzaju Parabacteroides (samice: 2,47%, samce: 0,5%, p < 0,05) i Bilophila (samice: 2,13%, samce: 0,01%, p < 0,05). Z kolei samce myszy były kolonizowane przez większe stężenia Odoribacter (samica: 0%, samiec: 0,92%, p < 0,05), Turicibacter (samica: 0,02%, samiec: 0,21%, p < 0,05), Clostridium (samica: 0,01%, samiec: 0,10%, p < 0,05) oraz kandydata rodzaju rc4-4 (samica: 0.16%, samiec: 2,46%, p < 0,05) (Tabela S12).

Oprócz różnic taksonomicznych, istnieją strukturalne różnice w społeczności przypisywane płci zwierząt, widoczne w odległości UniFrac wizualizowanej przez główną analizę współrzędnych (PCoA) na Ryc. 6a. Odpowiednio, mikrobiota jelitowa obserwowana u samic i samców myszy grupuje się razem według płci, i to w sposób bardziej podobny w obrębie swojej płci niż do siebie nawzajem (Ryc. 6a, ANOSIM z 999 permutacjami, p < 0,05). Ponadto, hierarchiczne grupowanie mikrobiomów i rodzajów bakterii na podstawie ich względnej liczebności wykazało podobny wzór w tym, że społeczności bakteryjne w obrębie tej samej płci mają tendencję do grupowania się (Fig. S2 i S3). Średnia różnorodność filogenetyczna w obrębie grupy u samic myszy jest mniejsza niż u samców (ryc. 6b, test t, p < 0,05), podczas gdy nie zaobserwowano różnic między samicami i samcami myszy w całkowitej liczbie obserwowanych OTU i indeksie Chao 1 (ryc. S4).

W przeciwieństwie do różnic strukturalnych między mikrobiomami utrzymywanymi przez samice i samców, tylko trzy przewidywane ścieżki metagenomiczne różniły się istotnie. Należą do nich operacje związane z transkrypcją (kobieta: 0,0092%, mężczyzna: 0,0051%, p < 0,05), biosynteza antybiotyków aminoglikozydowych (kobieta: 0,087%, mężczyzna: 0,080%, p < 0,05) i metabolizm glicerofosfolipidów (kobieta: 0,55%, mężczyzna: 0,52%, p < 0,05). Nie jest jasne, czy leżą one u podstaw wyrażonych różnic metabolicznych między dwiema płciami gospodarza. Zachowanie funkcji pomimo zróżnicowania taksonomicznego jest zgodne z redundancją potencjału genetycznego obserwowaną wcześniej w innych społecznościach mikrobiologicznych.46, 47

Pomimo cech zależnych od płci, specyficzny efekt obróbki biopolimerów pozostaje niezależny od płci, jak wskazuje analiza PCoA (Ryc. 3). W szczególności, ε-polilicyna przejściowo zmienia mikrobiom myszy w pośrednim punkcie pobierania próbek, niezależnie od płci. Podczas gdy pektyna lub pektyna skompleksowana z ε-polizyną nie zmienia mikrobioty samic i samców myszy. Podobna ścieżka odpowiedzi jest widoczna w przepływach na poziomie azylu, jako że reprezentacja Bacteriodes i Firmictues jest tymczasowo przesunięta w odpowiedzi na ε-poliglicynę u obu płci (Fig. S5). Ponadto, mikrobiom jelitowy pochodzący od obu płci wykazywał tę samą zmianę w Verrucomicrobia po podaniu pektyny (Rys. S5). Co więcej, w stosunku do grupy karmionej maltodekstryną, dieta z kompleksem ε-polilicyna-pektyna spowodowała wzrost Bacteriodetes i zmniejszenie Firmicutes niezależnie od płci. Wyniki te wskazują, że zależne od płci cechy (np. hormony) nie działać synergistycznie lub antagonistycznie z biopolimerów diety do zmiany struktury społeczności ogólnie, a w ramach głównych phyla.

Co ciekawe, biopolimery diety może zmienić reprezentacji rodzaju, który jest nieco zależny od płci. Względna liczebność Parabacteroides (płeć*treatment p < 0,05, wieloczynnikowa ANOVA), Clostridium (płeć*treatment p < 0,05, wieloczynnikowa ANOVA), Coprococcus (płeć*treatment, p < 0,05, wieloczynnikowa ANOVA) i Bilophila (płeć*treatment p < 0,05, wieloczynnikowa ANOVA) wykazywała umiarkowaną zależność od płci gospodarza (ryc. S6). U samic myszy zawartość Coprococcus była wyższa w grupie pektyn w porównaniu z pozostałymi trzema grupami u samic myszy (MD: 0,69%, PL: 0,63%, P: 0,98%, PL+P: 0,65%, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Jednakże, u samców myszy, Coprococcus OTUs grupy pektynowej były zmniejszone w mikrobiomie w porównaniu do pozostałych trzech grup (MD: 0,94%, PL: 0,77%, P: 0,45%, PL+P: 0,78%, MD vs. P: p < 0,05, PL vs. P: p < 0,05, P vs. PL+P: p < 0,05). Również, Bilophila była zredukowana u samic myszy karmionych ε-polilicyną w stosunku do diety z kompleksem ε-polilicyna-pektyna (MD: 0.51%, PL+P: 1.63%, p < 0.05), podczas gdy mikrobiom samców myszy nie wykazywał tej zależnej od płci fluktuacji populacji. Ponadto, interakcje płci, punktów pobierania próbek i biopolimeru wpłynęły na obserwowaną względną liczebność rodzaju Turicibacter (p < 0.05), Clostridium (p < 0.05), Coprococcus (p < 0.05) i kandydującego rodzaju rc4-4 (p < 0.05).