-
Door Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Reviewed by Christian Zerfaß, Ph.D. Skip naar:
- Hoe werkt SMRT Sequencing?
- Studying DNA Methylation in Bacteria; an Application of SMRT Sequencing
DNA sequencing werkt door het gebruik van DNA polymerase om nucleotiden toe te voegen aan een template. Er zijn verschillende technologieën beschikbaar voor DNA-sequencing. Een voorbeeld hiervan is Single-Molecule Real-Time sequencing, of SMRT sequencing.
Onderzoeker onderzoekt DNA-sequentie transparant dia. Credit: Shawn Hempel /How does SMRT Sequencing Work?
Zoals bij andere DNA-sequencingtechnologieën, is de eerste stap na DNA-extractie het voorbereiden van een “bibliotheek”. Dit proces bereidt het DNA voor op de sequencing; in dit geval worden adaptors toegevoegd aan beide uiteinden van een dubbelstrengs DNA-molecule, waardoor het DNA in feite een enkelstrengs circulair sjabloon wordt. Dit betekent dat het DNA continu kan worden gesequeneerd.
Deze DNA-bibliotheek, of het template-DNA, wordt vervolgens in een DNA-sequencer geplaatst die “nulmodus-golfgeleiders” bevat waarin aan één uiteinde DNA-polymerase is geïmmobiliseerd. Een enkel DNA-molecuul wordt dan geïmmobiliseerd in deze nulmodus-golfgeleiders, en het DNA-polymerase begint nieuwe nucleotiden toe te voegen aan een de novo gesynthetiseerde DNA-streng die complementair is aan het template-DNA. De basen in deze nucleotiden zijn gelabeld, en incorporatie van deze basen in de groeiende DNA-streng veroorzaakt lichtemissie. Deze lichtemissie wordt vervolgens in real-time afgelezen, en aangezien de emissie van elke base verschillend is, kan zo de specifieke base worden geïdentificeerd.
Het belangrijkste voordeel van SMRT-sequencing is het genereren van lange sequencing-lezingen van hoge nauwkeurigheid, wat de assemblage van volledige genomen verbetert. Dit komt omdat langere sequencing leest betekent dat minder “bouwen” nodig is om het genoom te assembleren.
Het bestuderen van DNA-methylering in Bacteriën; een toepassing van SMRT Sequencing
Wat is DNA-methylering?
De toevoeging van een methylgroep aan DNA, ook wel bekend als methylering, komt voor in alle koninkrijken van het leven. Er zijn drie gemethyleerde nucleotiden aanwezig in bacteriën; m5C (C5-methyl-cytosine, dat ook in eukaryoten voorkomt), m6A (N6-methyl-adenine) en m4C (N4-methyl-cytosine, dat alleen in bacteriën voorkomt). Methylering vindt plaats na de synthese van nieuwe DNA-strengen, en wel op specifieke nucleotiden.
De methylgroepen steken uit de DNA-dubbele helix, en kunnen daardoor van invloed zijn op de binding tussen DNA en DNA-bindende eiwitten. Dit beïnvloedt op zijn beurt processen zoals chromosoomreplicatie, DNA-mismatchreparatie, evenals timing van gentranscriptie en vorming van epigenetische lineages.
Epigenetische mechanismen: de methylering of acetylering van het dna kan de gentranscriptie activeren of niet. Image Credit: ellepigrafica /Waarom is DNA-methylering belangrijk bij bacteriën?
Bacteriën worden geïnfecteerd door virussen en hebben daarom een beschermingsmechanisme nodig om virale infecties te overwinnen. Dit is waar restrictie-modificatiesystemen in het spel komen; dit systeem bestaat uit een restrictie-enzym, dat DNA op specifieke plaatsen afbreekt, en een DNA-methyltransferase, dat een methylgroep toevoegt aan adenine (A) of cytosine (C).
In de meeste restrictie-modificatiesystemen fungeert het DNA-methyltransferase om het bacteriële DNA te beschermen tegen het restrictie-enzym. De aanwezigheid van het DNA-methyltransferase betekent dat het bacteriële DNA gemethyleerd wordt, terwijl het infecterende virale DNA dat niet wordt. Dit betekent op zijn beurt dat het virale DNA door het restrictie-enzym wordt afgebroken, terwijl het bacteriële DNA wordt beschermd doordat het restrictie-enzym niet op gemethyleerd DNA inwerkt. Er moet echter worden opgemerkt dat er restrictie-enzymen zijn die op gemodificeerd DNA werken.
Recente studies hebben erop gewezen dat er mogelijk nog andere rollen zijn weggelegd voor restrictie-modificatiesystemen. Zo heeft het uitschakelen van bepaalde restrictie-modificatiesystemen geleid tot een verandering in de genexpressie, die in verband wordt gebracht met het verschil in DNA-methylering. Restrictie-modificatiesystemen kunnen ook dubbelstrengsbreuken en C-T-mutaties veroorzaken en zo de evolutie van bacteriën beïnvloeden. Meer recent zijn er technologieën ontwikkeld die in staat zijn om de methylering van een volledig bacterieel genoom te bepalen, bekend als het “methyloom”.
Hoe bepaal je het methyloom met behulp van SMRT-sequencing?
Omdat SMRT-sequencing real-time resultaten geeft, kan het worden gebruikt om DNA-modificaties, waaronder methyleringen, te detecteren. Het DNA-polymerase neemt nucleotiden op met een constante snelheid, maar deze snelheid kan worden gewijzigd als de nucleotide in de template is gemodificeerd. Dit kan worden opgemerkt tijdens het sequencingproces.
Blow e.a. gebruikten SMRT-sequencing om DNA-modificaties in 230 micro-organismen in kaart te brengen. De modificaties waarnaar zij zochten waren m5C, m6A en m4C. De auteurs vonden dat 93% van deze micro-organismen DNA-methylering vertoonden, en zij vonden ook 834 motieven die gemethyleerd waren. Dit stelde de auteurs in staat om te identificeren welke motieven de doelwitten zijn voor 620 DNA-methyltransferases.
Interessant is dat de auteurs opmerkten dat, hoewel 48% van de bestudeerde organismen een DNA-methyltransferase had, er geen bewijs was dat er ook een restrictie-enzym aanwezig was. Het is dus mogelijk dat DNA-methylering een belangrijke rol speelt bij de regulering van het genoom, of een andere belangrijke rol in micro-organismen die nog moet worden geïdentificeerd.
Bronnen
- PacBio. SMRT sequencing brochure www.pacb.com/…/…-long-reads-to-drive-discovery-in-life-science.pdf
- PacBio. SMRT sequencing – hoe het werkt www.pacb.com/…/Infographic_SMRT-Sequencing-How-it-Works.pdf
- Sánches-Romero, M. A. et al., DNA methylation in bacteria: from the methyl group to the methylome. Current Opinion in Microbiology 2015, 25, 9-16. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369527415000399
- PaBio. SMRT Sequencing: Epigenetics https://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/epigenetics/
- Blow, M. J. et al. The Epigenomic Landscape of Prokaryotes. PLOS Genetics 2016, 12 (2), e1005854. journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1005854
Verder lezen
- Alle DNA Sequencing Content
- DNA Sequencing
- DNA Sequence Assembly
- DNA microarray
- High-throughput DNA Sequencing Techniques
Geschreven door
Dr. Maho Yokoyama
Dr. Maho Yokoyama is onderzoeker en wetenschapsschrijver. Zij promoveerde aan de Universiteit van Bath, UK, op een proefschrift op het gebied van de microbiologie, waar zij functionele genomica toepaste op Staphylococcus aureus . Tijdens haar doctoraalstudies werkte Maho samen met andere academici aan verschillende papers en publiceerde ze zelfs enkele van haar eigen werken in wetenschappelijke tijdschriften met collegiale toetsing. Ze presenteerde haar werk ook op academische conferenties over de hele wereld.
Last bijgewerkt 3 sep 2019Citaties
Gebruik een van de volgende formaten om dit artikel in uw essay, paper of verslag te citeren:
-
APA
Yokoyama, Maho. (2019, september 03). Wat is Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing? Nieuws-Medisch. Retrieved on March 26, 2021 from https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx.
-
MLA
Yokoyama, Maho. “Wat is Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing?”. Nieuws-Medisch. 26 maart 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx>.
-
Chicago
Yokoyama, Maho. “Wat is Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing?”. Nieuws-Medisch. https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx. (accessed March 26, 2021).
-
Harvard
Yokoyama, Maho. 2019. Wat is Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequencing? Nieuws-Medisch, bekeken 26 maart 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/What-is-Single-Molecule-Real-Time-(SMRT)-Sequencing.aspx.