The clonogenic assay has been used in numerous studies to quantify clonogenic growth and its abrogation by cytotoxic stimuli, including radiation, chemotherapeutic drugs, and/or molecularly targeted agents, in vitro. De huidige standaardprocedure om overlevingsfracties te bepalen is gebaseerd op de veronderstelling dat de klonogene groei in behandelde celculturen kan worden genormaliseerd ten opzichte van de onbehandelde controles via deling door een cellijnspecifieke, constante PE.
Hieruit blijkt echter dat dit niet universeel toepasbaar is. Onze gegevens geven daarentegen duidelijk aan dat de correlatie tussen het aantal in een kweekschaal gezaaide cellen en het aantal verkregen kolonies lang niet altijd lineair is. Voor cellijnen met coöperatief gedrag leverde de op PE gebaseerde analyse van klonogene overlevingsgegevens resultaten op met grote tot enorme assay-intrinsieke fouten. Zelfs als alleen kweekschaaltjes met redelijke aantallen kolonies (C = 5 tot 100) voor de analyse werden gebruikt, verschilden de klonogene overlevingsfracties bij een gegeven dosis veel meer dan een orde van grootte voor cellijnen met een hoge mate van cellulaire samenwerking. Van nota, vrijwel elke overlevingskromme (steil of vlak, matig of sterk gebogen, lineair, kwadratisch, of onregelmatig) kan worden afgeleid uit dit bereik van resultaten berekend uit de gegeven dataset-een observatie die van bijzonder belang voor straling biologists.
Taken samen, onze gegevens tonen aan dat conventionele PE-gebaseerde analyse van klonogene overlevingsgegevens ongepast presteert zodra cellulaire samenwerking optreedt onder een of meer omstandigheden binnen een experiment, en geëxtraheerde overlevingsresultaten zal variëren binnen een onbevredigend groot bereik. In het bijzonder, zullen de resultaten sterk scheef als slechts een of enkele vergelijkbare celdichtheden worden uitgezet. Deze praktijk genereert assay-intrinsieke fouten die een direct gevolg zijn van de gekozen celdichtheden en derhalve niet vatbaar zijn voor statistische foutenanalyses. Voor coöperatief groeiende cellijnen kunnen onze waarnemingen gedeeltelijk de gerapporteerde inter-test, inter-onderzoeker, en inter-laboratorium incongruenties van behandelingsrespons gegevens verklaren. Een meta-analyse van A549 kolonievormingstestgegevens ondersteunt deze hypothese verder: Binnen een panel van 156 verschillende studies, rapporteerden Nuryadi et al. SF4 waarden voor deze specifieke cellijn variërend van 5 tot 90% met een SF4 interkwartiel bereik van meer dan 25%. Hoewel diverse andere parameters de gegevens over de respons op de behandeling zeker kunnen beïnvloeden, concluderen wij uit onze gegevens dat cellulaire samenwerking een belangrijke factor is die de inter-studie variabiliteit verklaart. Omdat zelfs kleine verschillen in clonogene overlevingsfracties onderzoekers ertoe kunnen aanzetten nieuwe wetenschappelijke hypothesen te postuleren en te bestuderen die uiteindelijk op valse precisie gebaseerd zouden kunnen zijn, hebben wij een nieuwe analysebenadering ontwikkeld die minder gevoelig is voor de invloed van celdichtheid – vooral maar niet alleen voor coöperatief groeiende cellijnen. Deze methode houdt rekening met niet-lineaire relaties tussen celaantallen gezaaid en kolonie aantallen verkregen door het scoren van cultuur schalen met een breed scala van celaantallen gezaaid voor alle behandeling conditions.
Mathematisch, onze aanpak maakt gebruik van macht regressie en interpolatie van gematchte aantallen kolonies bij verschillende bestralingsdoses. Toegepast op dezelfde dataset die werd gebruikt voor berekeningen op basis van PE, leverde dit duidelijk stabielere, celdichtheidsonafhankelijke resultaten op. Oplettende lezers hebben wellicht opgemerkt dat de overlevingsfractieberekeningen die volgens de hier gepresenteerde methode zijn uitgevoerd, uitsluitend berusten op de coëfficiënt a en de exponent b zoals die door vermogensregressie worden verkregen. Hoewel dit duidelijk de effecten van cellulaire samenwerking compenseert, bevat het een andere foutkwaliteit die voortvloeit uit de onnauwkeurigheid van regressie en die niet kwantitatief kan worden vergeleken met de soortgelijke foutkwaliteit in op PE gebaseerde overlevingsfractieberekeningen. Dienovereenkomstig moet deze fout worden geminimaliseerd door te zorgen voor een zorgvuldige experimentele opzet met een voldoende aantal onafhankelijke replicaten. Bovendien moeten overlevingsfractieberekeningen alleen worden uitgevoerd met power regressieresultaten van goede prestaties zoals aangegeven door de regressiecoëfficiënt R.
Onze wiskundige benadering vervangt in feite op PE gebaseerde clonogene overlevingsberekeningen door de vraag:
Hoeveel keer meer cellen moeten in een behandelde kweekschaal worden gezaaid om hetzelfde aantal kolonies op te leveren als in een controlegerecht?
De exponent b is in dit verband van bijzonder belang. Deze geeft aan of de correlatie tussen het aantal ingezaaide cellen en het aantal getelde kolonies lineair is (b ≈ 1) of niet. Hoge b-waarden, zoals voor BT20- en SKLU1-cellen, wijzen erop dat de celgroei in vitro wordt vertraagd (of geheel wordt gestaakt) als het volume van het kweekmedium per cel wordt vergroot – hetzij door gebruik van grote testvolumes, hetzij door vermindering van het aantal cellen dat is uitgezaaid. Benadrukt moet worden dat b-waarden geenszins specifiek zijn voor een bepaalde cellijn, maar veeleer een gevolg zijn van het gekozen kweekmedium, verschillende incubatieparameters voor de bepaling en de experimentele procedure, met inbegrip van vrijwel elk aspect dat van invloed kan zijn op de klonale uitgroei van cellen die zich in een extreme stresssituatie bevinden wanneer zij als afzonderlijke cellen worden uitgezet, zoals de samenstelling van het medium, de toevoeging van voedingsstoffen en groeifactoren, de voor celscheiding gebruikte methoden, het plasticwerk, enz. Bijvoorbeeld, het gebruik van geconditioneerde media van bijna-confluente BT20-cellen verzwakte sterk het coöperatieve gedrag van BT20 afzonderlijke cellen, terwijl deze procedure geen invloed had op de clonogene groei van nietcoöperatief groeiende MDA-MB231-cellen. Bovendien was de verdubbelingstijd van coöperatieve BT20 cellen afhankelijk van zowel de assay incubatietijd als de celdichtheid in de well, waardoor een voor de hand liggende biologische verklaring wordt gegeven voor onnauwkeurige clonogene overlevingsfracties verkregen door PE-gebaseerde berekeningen: De groeisnelheid van een prolifererende celcluster kan gewoon te traag zijn om de drempel van 50 cellen per kolonie binnen de assay-incubatietijd te bereiken. Vandaar dat de schijnbare “niet-klonaliteit” van een cluster van bijvoorbeeld 35 langzaam prolifererende cellen op het stoppunt is slechts een onvermijdelijk gevolg van de assay incubatietijd die – althans tot op zekere hoogte – willekeurig gekozen. In dit verband hebben wij bovendien de invloed van de incubatietijd op de verkregen klonogene overlevingsfracties geanalyseerd en geconstateerd dat het onvoldoende is om het stoptijdstip alleen door inspectie van de controleschotels te bepalen, zoals door anderen wordt gesuggereerd: een voortijdige beëindiging van de incubatietijd kan leiden tot buitengewoon lage overlevingsfracties op platen met een agressievere behandeling, waar herstel van de schade vóór voortzetting van de celgroei extra tijd vergt.
Belangrijk is dat onze gegevens volledig in overeenstemming zijn met de baanbrekende bevindingen van baanbrekende celcultuuronderzoekers in de jaren veertig en vijftig van de vorige eeuw en gewoon een weerspiegeling zijn van een fenomeen dat in die tijd uitgebreid werd onderzocht. Puck en collega’s waren de eersten die in 1956 een overlevingscurve van bestraalde afzonderlijke cellen publiceerden. De grootste wetenschappelijke uitdaging voor deze fundamentele prestatie was echter een in die tijd onopgelost probleem van de zoogdiercelcultuur: cellijnen stopten met groeien in vitro zodra de cellen bij lage dichtheid werden uitgezet. Een poging om dit probleem te overwinnen werd in 1948 ondernomen door Sanford e.a., die erin slaagden uit één cel afgeleide fibroblastkolonies te kweken in kleine capillairen waar de diffusie van de van de cel afgeleide factoren in het medium sterk werd beperkt, zodat voldoende autocriene groeistimulatie mogelijk werd. Zij wezen op het belang van pre-conditionering van het kweekmedium door gekweekte cellen en concludeerden dat een celkweekmedium dat voldoende is om een oneindige groei van cellen met hoge dichtheid mogelijk te maken, in feite “verre van optimaal is voor de groei van een enkele cel”. In het verlengde hiervan beschreven Earle et al. dat het uitplaten van het desbetreffende celtype bij zeer lage dichtheid resulteerde in celdood , en dit werk vormde de basis voor de eerste publicatie over klonogene groei van zoogdiercellen in vitro door Puck en Marcus in 1955 . Geïnspireerd door de behoefte aan geconditioneerd kweekmedium om de groei van afzonderlijke cellen te vergemakkelijken, gebruikten zij een co-cultuursysteem van afzonderlijke HeLa-cellen en een laag zwaar bestraalde voedingscellen van hetzelfde type. In overeenstemming met de voorgaande studies concludeerden zij dat de remming van de eencellige groei in grote testvolumes te wijten was aan het “verlies van een kortlevende, diffusibele factor”. In latere publicaties, zoals die met de eerste overlevingscurve van bestraalde zoogdiercellen, lieten Puck en collega’s het gebruik van voedingslagen vaak achterwege, aangezien zij geavanceerde kweektechnieken hadden ontwikkeld die eencellige groei met 100% PE zonder groeifactorsuppletie door voedingscellen mogelijk maakten. Zij verklaarden dat zorgvuldige was- en trypsinisatieprotocollen in dit verband essentieel waren en bedachten de term “coöperatieve actie” om te beschrijven dat cellen in een kweekschaal zowel qua genotype als qua fysiologische toestand kunnen verschillen. Onze bevindingen zijn een herhaling van deze waarnemingen: Binnen een panel van 50 kankercellijnen hebben wij vastgesteld dat suboptimale groei van afzonderlijke cellen in moderne, gestandaardiseerde kweekmedia, aangevuld met FCS, nog steeds een veel voorkomend verschijnsel is, zoals kan worden afgeleid uit de bevinding dat meer dan de helft van de cellijnen coöperatief groeigedrag vertoonde. Als dus voor een bepaalde cellijn suboptimale PE’s worden gevonden, zal de clonogene assay waarschijnlijk tegelijkertijd zowel de invloed van de behandeling van belang als de impact van cellulaire samenwerking detecteren. Het lag niet in het bestek van deze studie om specifieke groeiondersteunende factoren te identificeren die de PE van de geanalyseerde cellijnen zouden kunnen beïnvloeden. Wij stellen echter de hypothese voorop dat suboptimale groeiomstandigheden voor afzonderlijke cellen van een bepaalde cellijn het gevolg kunnen zijn van zeer uiteenlopende parameters, zoals lage concentraties van klassieke groeifactoren en/of hormonen (bv. epidermale groeifactor of oestrogeen), maar ook verschillende laag- en hoogmoleculaire metabolieten waarvoor ten minste een fractie van de afzonderlijke cellen auxotrofie vertoont. Bovendien zal de voedingssuppletie van afzonderlijke cellen in een kweekschaaltje waarschijnlijk worden beïnvloed door fysisch-chemische parameters van het omringende medium en het plastic, met inbegrip van de mate van eiwitbinding van de respectieve auxotrofe factoren of hun adsorptie aan het plastic oppervlak. In theorie zou dit probleem kunnen worden aangepakt door maatregelen te nemen die de maximale PE in omstandigheden met lage dichtheid herstellen, zodat (opnieuw) een lineaire correlatie tussen S en C tot stand komt (b = 1). De aanbevelingen van Puck voor het gebruik van voedingscellen, geconditioneerde media en/of het inbedden van afzonderlijke cellen in zachte agar kunnen volstaan om dit voor bepaalde cellijnen te bereiken en zouden de robuustheid van de op PE gebaseerde berekeningen dienovereenkomstig moeten verhogen. Het is echter duidelijk dat het meer dan een uitdaging kan zijn om de testomstandigheden te verfijnen en te standaardiseren zodat de overlevings- en groeisnelheden van de afzonderlijke cellen optimaal zijn voor elk afzonderlijk celtype dat van belang is. Wij hebben besloten suboptimale testcondities voor eencellige celgroei te aanvaarden en in plaats daarvan een computationele methode voor de analyse van clonogene overlevingsgegevens ontwikkeld die rekening houdt met dit goed beschreven verschijnsel. Het is duidelijk dat onze aanpak met behulp van macht regressie en interpolatie was buiten de technische mogelijkheden van de jaren 1950, toen overlevingsgegevens werden gemonteerd op het oog. Maar op de een of andere manier is de relevantie van cellulaire samenwerking in de loop van de volgende decennia uit het oog verloren. Hoewel een paar rapporten over niet-lineariteit in kolonievorming assays werden gemeld in de tijd, werd de beperkte prestaties van PE-gebaseerde analyses niet aangepakt .
Interessant is dat deze studies gemeld op een minder-dan-lineaire toename van kolonie aantallen met toenemende aantallen gezaaid cellen voor bepaalde celtypes onder specifieke omstandigheden. In overeenstemming hiermee hebben we voor een paar cellijnen in ons panel ook b-waarden verkregen die iets onder 1,0 lagen. Drie verschillende scenario’s kunnen deze waarneming verklaren, waarvan er twee te wijten zijn aan methodologische artefacten: Ten eerste kunnen b-waarden iets onder 1,0 het resultaat zijn van het tellen van wells met een groot aantal overgroeide kolonies waarbij kleine kolonies door de onderzoeker over het hoofd worden gezien (zie wells met “nd” in Fig. 1a). Ten tweede kan de celgroei van schotels met hoge aantallen cellen in een vrij vroeg stadium worden geremd door een snelle daling van de voedingsstofconcentratie, wat resulteert in afbrekende kolonies. Een derde – en biologisch minder intuïtieve – optie is competitief gedrag van de celgroei, bijvoorbeeld door afscheiding van groeiremmende factoren. Belangrijk is dat elk van deze verschijnselen in aanmerking wordt genomen door de regressie- en interpolatiebenadering, omdat deze elke afwijking van lineariteit beschouwt zoals die tot uiting komt in de b-waarde.
Het is bovendien opmerkelijk dat de b-waarden van verschillende cellijnen voor onbehandelde vergeleken met bestraalde omstandigheden niet identiek zijn. In de meeste van deze gevallen neigen de b-waarden van bestraalde cellen hoger te zijn dan de respectieve b-waarden van onbehandelde controles, hetgeen erop wijst dat de cellulaire samenwerking bij bestraling toeneemt. Bijgevolg wordt het bereik van de waarden van de overlevingsfractie die voor C = 5 tot 100 kolonies worden verkregen, groter dan in het geval van bijna identieke b-waarden (zie cellijnen HCC1806 en A549). Dit impliceert dat het technisch niet mogelijk is preciezere overlevingswaarden te extraheren door middel van de clonogene testprocedure – tenzij een vast aantal kolonies (C) voor analyse werd geselecteerd. Bovendien kunnen cellijnen met zeer hoge b-waarden voor behandelde cellen van bijzonder belang zijn voor studies naar therapieresistentie. Bijvoorbeeld, straling geïnduceerde overlevingsfactor (en) afgescheiden door een bepaald celtype zou kunnen worden geïdentificeerd als gevolg van een overeenkomstig hoge b-value.
In samenvatting, onze gegevens tonen de noodzaak om zorgvuldig analyseren van gegevens van kolonievorming experimenten en om de onderschatte impact van cellulaire samenwerking op overlevingsfractie berekeningen te overwegen. Dit kan de betrouwbaarheid van de clonogene assay-en de veerkracht van elke hypothese gebaseerd op het sterk verhogen.