Synthese en antimicrobiële resistentiemodulerende activiteit van 2,4-Dinitrophenylhydrazonederivaten als agentia tegen sommige ESKAPE humane pathogenen

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Resistentiemodulerende activiteiten van producten (zowel natuurlijke als synthetische) ten opzichte van standaardantibiotica hebben de laatste jaren aan wetenschappelijke belangstelling gewonnen. Dit is gericht op het maximaliseren van de antimicrobiële potentie met grote stappen in het beteugelen van microbiële resistentie en dus leidend tot potentiële ontdekking van geneesmiddelen. Een belangrijke klasse van dergelijke synthetische middelen met een veelbelovend effect op de resistentiemodulatie zijn hydrazonen. Hydrazonen en hun analogen bezitten de azomethine functionaliteit, een belangrijke groep van verbindingen met een breed spectrum van biologische activiteiten. Hydrazonen werden gekozen vanwege hun brede scala van farmacologische activiteiten, zoals anticonvulsieve, anti-inflammatoire, antimicrobiële, antiprotozoaire, en antikanker activiteiten. Zij spelen niet alleen een cruciale rol in de biologie, maar ook op het gebied van de fotochemie, de analytische scheikunde en de anorganische scheikunde. Hydrazonen zijn verwant aan ketonen en aldehyden door substitutie van zuurstof met -NNH2 functionele groep. Door verschillende synthetische protocollen en gedetailleerde structuur-activiteitsrelaties (SAR) studies zijn er verschillende hydrazonederivaten ontwikkeld en ontdekt die farmacologisch werkzaam zijn op verschillende doelwitten. Sommige hydrazonederivaten van isonicotinoyl bleken antituberculaire activiteit te bezitten. Verder bleek het benzoëzuur hydrazonederivaat 4-hydroxybenzoëzuur -hydrazide (nifuroxazide) werkzaam te zijn tegen intestinale wormen, en het derivaat 4-fluorobenzoëzuur -hydrazide vertoonde antibacteriële activiteit tegen Staphylococcus aureus ATCC 29213 bij 3,13 μg/mL en de gevoelige Mycobacterium tuberculosis stam H37RV ook bij 3,13 μg/mL . Recentelijk gesynthetiseerde hydrazonen, waaronder nifuroxazide, bleken actief te zijn tegen Mycobacterium tuberculosis stam H37RV bij een minimaal remmende concentratie van 0,78-6,25 μg/ml. Een nieuwe agent, 3, 5-dibenzoylvanillin hydrazone, en overgangsmetaalcomplexen bleken indrukwekkende antibacteriële activiteit te vertonen.

Hierom zijn in deze studie zes nieuwe fenylhydrazonederivaten met succes gesynthetiseerd door nucleofiele condensatiereactie, met hun antimicrobiële activiteiten en resistentie modulatie effecten onderzocht.

2. Materialen en Methoden

2.1. Synthese: Algemene materialen en methoden

Een rondbodemkolf (100 mL) voorzien van een magnetische roerstaaf werd gevuld met 2,4-dinitrofenylhydrazine (1 eq.) in methanol (10 mL) dat in een ijsbad werd gehouden. De resulterende suspensie werd geroerd en afgekoeld tot 0°C alvorens druppelsgewijs geconcentreerd H2SO4 (98% v/v, 2 mL) toe te voegen, wat een lichtgele oplossing opleverde. Na afkoeling tot kamertemperatuur werd een aldehyde- of ketonderivaat (1,04 eq.) in methanol (5 mL) toegevoegd en werd het mengsel geroerd tot zich geleidelijk een neerslag vormde dat 24 uur bleef staan. Het verloop van de chemische reacties werd gevolgd met dunnelaagchromatografie (TLC), waarbij met tussenpozen aluminiumplaten met een coating van silicagel (60 GF254) werden gebruikt. De platen werden gevisualiseerd onder UV-licht bij 254 nm en 366 nm, gevolgd door verstuiving met anisaldehyde voor bevestiging van de identiteit van de vlek. Het ruwe product werd gefiltreerd door afzuigen en geherkristalliseerd uit hete absolute ethanol (96% v/v). Het vaste product werd verkregen door afzuigen filtratie, gedroogd, en opgeslagen bij kamertemperatuur.

De structuren van de gesynthetiseerde verbindingen werden vastgesteld met smeltpuntbepalingen, massaspectroscopie, 1D NMR (proton en koolstof-13), en 2D NMR (DEPT-Q) spectroscopie met de ondersteuning van infrarood (IR) en ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectroscopie technieken.

2.1.1. 1-(2,4-Dinitrofenyl)-2-(difenylmethyleen) hydrazine

2, 4-Dinitrofenylhydrazine (0,50 g, 2,74 mmol, 1 eq.) in aanwezigheid van benzofenon (0,53 g, 1,04 eq., 2,64 mmol) leverde het ruwe product op dat werd gezuiverd door herkristallisatie uit hete ethanol om het product (0,84 g, 85%) als een lichtoranje vaste stof te verkrijgen. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,90. Mpt: 141-143°C; UV-V is (MeOH): 382 nm. Infrarood (zuiver) υmax cm-1: 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09-9,10 (1H, H-C3, s, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH), 8,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7.66-7.72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7.35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7.57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155,7, 145,1, 136,5, 131,9, 130,5, 130,4, 130,1, 129,9, 128,6, 128,2, 127,9, 123,4, 116,6 ppm.

2.1.2. 1-Benzylideen-2-(2,4-dinitrofenyl)hydrazine

2, 4-dinitrofenylhydrazine (0,90 g, 4,53 mmol, 1 eq.) in aanwezigheid van benzaldehyde (0,50 g, 1,04 eq., 4,71 mmol) leverde het ruwe product op dat werd gezuiverd door herkristallisatie uit hete ethanol om het product (1,01 g, 78%) als een gele vaste stof te verkrijgen. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0.83. Mpt: 178-180°C; UV-V is (MeOH) : 224 nm en 378 nm. Infrarood (zuiver) υmax cm-1: 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09 (1H, H-C3, s, ArH), 8,30-8,31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,05 (1H, H-C5, m, ArH), 8. (1H, H-C6, s, ArH).02 (1H, H-C6, m, ArH), 7.41-7.69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7.40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147,9, 145,8, 144,9, 144,7, 131,0, 130,0, 129,0, 127,6, 123,5, 116,8 ppm.

2.1.3. 3-(2-2-(4-Dinitrofenyl) Hydrazono) Methylfenol

2, 4-Dinitrofenylhydrazine (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) in aanwezigheid van m-hydroxybenzaldehyde (0,50 g, 1,04 eq., 4,09 mmol) leverde het ruwe product op dat werd gezuiverd door herkristallisatie uit hete ethanol om het product (0,76 g, 64%) te verkrijgen als een donkerrode vaste stof. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0,74. Mpt: 277-280°C. UV-Vis (MeOH): 392 nm. Infrarood (zuiver) υmax cm-1: 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,56 (1H, H-C1, s, NH), 10,04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8,88 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35-8,37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8.08-8.34 (1H, H-C6), d, J = 12.0, ArH), 8.05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7.66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7.14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6.87-6.89 (1H, H-C3′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160,5, 150,5, 144,9, 137,1, 130,2, 129,8, 129,5, 125,2, 123,6, 117,1, 116,4 ppm.

2.1.4. 4-(2-(2,4-Dinitrofenyl) Hydrazono) Methyl)-2-methoxyfenol

2, 4-Dinitrofenylhydrazine (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) in aanwezigheid van 4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde (vanilline) (0,50 g, 1,04 eq, 4,09 mmol) leverde het ruwe product op dat werd gezuiverd door herkristallisatie uit hete ethanol om het product (0,91 g, 70%) te verkrijgen als een helderrode vaste stof. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0.66. Mpt: 270-273°C. UV-Vis (MeOH): 218 nm en 394 nm. Infrarood (zuiver) υmax cm-1: 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,58 (1H, s, NH), 10,11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9,94 (1H, H-C3, s, ArH), 8,87 (1H, H-C5, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7,97 (1H, H-C2′, d, J = 4,0, ArH), 7,66-7,76 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH), 6,38-6,35 (1H, H-C5′, d, J = 12,0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150,7, 150,2, 148,6, 144,9, 137,1, 130,2, 125,6, 123,6, 123,1, 117,2, 116,1, 110,3, 56,2 ppm.

2.1.5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrofenyl) Hydrazono) Methyl Fenol

2, 4-Dinitrofenylhydrazine (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) in aanwezigheid van salicylaldehyde (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 eq.) leverde het ruwe product op dat werd gezuiverd door herkristallisatie uit hete ethanol om het product (1,09 g, 92%) als een helder oranje vaste stof te verkrijgen. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH): 386 nm. Infrarood (zuiver) υmax (cm-1): 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9.98 (1H (C1), s, NH), 9.11 (1H H-C3, s, ArH), 8.34-8.36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C5, d, J = 4.0, ArH), 7.61-7.58 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7.25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.24 (1H, H-C7, m, ArH), 6.95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157,9, 151,3, 132,9, 131,4, 130,6, 123,7, 120,3, 117,2, 116,9, 115,3 ppm. HRMS (ESI): m/z berekend voor + C13H10N4O5: 302.2400, gevonden: 301.0000.

2.1.6. 4-(2-(2, 4-Dinitrophenylhydrazono) Methyl) Benzeen-1, 3-diol

2, 4-Dinitrophenylhydrazine (0,69 g, 3,48 mmol, 1 eq.) in aanwezigheid van 2, 4-dihydroxybenzaldehyde (0,50 g, 1,04 eq, 3,62 mmol) leverde het ruwe product op dat werd gezuiverd door herkristallisatie uit hete ethanol om het product (0,66 g, 2,07 mmol, 60%) als een donkerrode vaste stof te verkrijgen. (Pet. ether 70%: EtOAc 30%): 0,51. Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH): 403 nm. Infrarood (zuiver) υmax (cm-1): 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11,58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10,11 (1H, H-C1, s, NH), 9,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8.36 (1H, H-C5, d, J = 12.0, ArH), 7.95-7.97 (1H, H-C6, d, J = 8.0, ArH), 7.54 (1H, H-C7, m, ArH), 6.38 (1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161,8, 159,1, 148,2, 144,6, 136,7, 130,1, 129,3, 128,8, 123,6, 116,9, 112,0, 108,7, 102,1 ppm.

2.2. Antimicrobiële evaluatie van de verbindingen

2.2.1. Bron van testorganismen

Pure cultures van Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), Escherichia coli (EC) (ATCC 25922), en Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) werden verkregen van de afdeling Microbiologie van de faculteit Farmacie en Farmaceutische Wetenschappen, Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST), Kumasi. Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA), en Streptococcus pneumoniae (SP) waren echter klinische stammen verkregen van het Komfo Anokye Teaching Hospital, Kumasi, en gekweekt in de afdeling Farmaceutische Wetenschappen, KNUST.

2.2.2. De microbroth-verdunningsmethode werd gebruikt voor de bepaling van de minimale remmende concentraties (MIC’s) van de hydrazonederivaten en de referentiegeneesmiddelen ciprofloxacine en fluconazol. Microtiterplaten met 96 putjes werden gevuld met 125 µL dubbelsterke nutriëntenbouillon, waaraan verschillende concentraties van de hydrazonederivaten werden toegevoegd. De referentiegeneesmiddelen in het bereik 12..5 µL/mL tot 40 µL/mL werden op dezelfde manier behandeld. Aan elk putje werd een aliquot van 1 × 105 kve/ml testorganismen toegevoegd. De controleplaat werd gevuld met nutriëntenbouillon en alleen testorganismen. De test- en controleplaatjes werden geïncubeerd bij 37°C (24 uur voor bacteriën en 48 uur voor schimmels), waarna 20 µL van 1,25 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) in elk putje werd gebracht. Na 20 minuten werd er gekeken of er een paarse verkleuring optrad, wat wijst op groei. De minimumconcentraties van de hydrazonederivaten en de referentiegeneesmiddelen die geen kleurverandering vertoonden in de putjes, werden beschouwd als de MIC-waarden. De bepalingen werden uitgevoerd in herhalingen.

2.2.3. Resistente modulatiestudies

Voor de modulatiestudies werden de 96-wells-platen gevuld met 125 µL dubbelsterke nutriëntenbouillon, en werd hetzelfde volume van 40 µL fenylhydrazonen toegevoegd. Verschillende concentraties in het bereik van 50 µL/ml tot 7,812 µL/ml en 15,625 µL/ml tot 7,812 µL/ml van respectievelijk ciprofloxacine en fluconazol werden toegevoegd. Aan elk putje werd 25 µL met 1 × 105 kve testorganismen toegevoegd en de platen werden geïncubeerd bij 37°C (gedurende 24, respectievelijk 48 uur voor bacteriën en schimmels), waarna aan elk putje 20 µL MTT werd toegevoegd. Het verschijnen van een kleurverandering van troebele putjes naar paars werd geregistreerd en vergeleken met MIC’s van alleen de referentiegeneesmiddelen. De bepalingen werden uitgevoerd in herhalingen.

3. Resultaten en Discussie

3.1. Structural Analysis of the Phenylhydrazones

De synthetische route gebruikt voor de synthese van de verbindingen werd gevolgd door de standaard condensatiereactie tussen aldehyden of ketonen en hydrazines, rekening houdend met de commerciële beschikbaarheid van de bouwstenen (Schema 1). Een retrosynthetische ontkoppelingsaanpak maakte het mogelijk verschillende aldehyden en een keton te identificeren als belangrijke tussenproducten voor de synthese van de gewenste verbindingen. Het proces omvat een aromatische nucleofiele aanval van 2, 4-dinitrofenylhydrazine op het carbonyl in een aangezuurde oplossing. Dit werd gevolgd door dehydratie van het reactieve tussenproduct om het eindproduct 2, 4-dinitrofenylhydrazonederivaat te verkrijgen.

De gegevens voor de synthetische procedures zijn opgenomen in het experimentele gedeelte en worden geïnterpreteerd volgens de volgorde: smeltpuntbereik (Mpt.) in graden Celsius (°C), golflengte van de maximale absorptie van het ultraviolet-zichtbare spectrum, infraroodspectrum, 1H NMR , 13C NMR, en HRMS als bevestigingsmiddel voor SA5 (verbinding 5) (een van de meest actieve verbindingen).

3.1.1. UV-Vis spectroscopie

De spectra voor alle zes verbindingen werden zowel in het ultraviolet als in het zichtbare golflengtegebied (200-800 nm) bepaald als bevestigingsmiddel voor BP1 in de aanvullende informatie met methanol als blanco. De absorptiebanden bij 203 nm en 403 nm, die werden verkregen in de elektronische spectra van de gesynthetiseerde fenylhydrazonen, kunnen worden toegeschreven aan overgangen, die worden bijgedragen door de verschillende auxochromen van de substituenten op de fenylhydrazonen. Van fenylhydrazonen is bekend dat ze bij verschillende golflengten in het UV-zichtbare bereik absorberen.

Bijvoorbeeld, verbinding BP1, opgelost in methanol en gescand in het UV-zichtbare gebied, vertoonde absorptie bij 203 nm, 314 nm, en 382 nm, wat kan worden toegeschreven aan uitgebreide conjugatie in de fenylhydrazonen na de koppeling van benzofenon en 2,4-dinitrofenylhydrazine. Verbinding BP1 vertoonde echter maximale absorptie bij 382 nm, en dit zou kunnen worden toegeschreven aan een toename van de conjugatie. Ook de verbindingen BA2, MHB3, VL4, SA5, en DHB6 vertoonden maximale absorptie bij respectievelijk 378 nm, 392 nm, 394 nm, 386 nm, en 403 nm, zoals waargenomen in de ondersteunende informatie.

De uitgebreide conjugatie kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van chromoforen in de fenylhydrazonen, waaronder BP1 (twee aromatische ringchromoforen), MHB3 (meta hydroxy auxochroom), VL4 (een hydroxy en methoxy auxochroom), SA5 (ortho hydroxy auxochroom), en DHB6 (twee hydroxy auxochromen). Dit suggereert dat de hydrazonen met auxochromen en extra chromofoor een uitgebreide conjugatie hadden die leidde tot een verschuiving naar rechts (badochromische verschuiving).

3.1.2. Infraroodspectroscopie

Het infraroodspectrum geeft een idee van de functionele groepen in een verbinding. Uit het infraroodspectrum van verbinding 5 als monster blijkt de aanwezigheid van een brede band die zich uitstrekt van ongeveer 3300 cm-1 en afloopt naar het alifatische CH-gebied van ongeveer 3000 cm-1, wat wijst op de aanwezigheid van een hydroxy-functiegroep, in dit geval die van een fenol, zoals waargenomen in de ondersteunende informatie.

In het IR-spectrum (aanvullende informatie) is ook waargenomen dat verbindingen als MHB3, VL4, SA5, en DHB6 een scherpe sterke piek vertonen van hun C = C-strekkingsband in de regio van 1138-1620 cm-1 in vergelijking met BP1 en BA2 die geen hydroxy-functie hebben, zoals blijkt uit tabel 1. De aanwezigheid van de C = N, die gevormd wordt door de condensatiereactie tussen hydrazine en de carbonylen, werd overlapt door aromatische sp2 gehybridiseerde carbons (C = C) in het benzeen die trillen bij 1138-1640 cm-1 afhankelijk van de substituent toevoegingen. Aangezien de C = N trillingsfrequenties binnen 1580-1600 cm-1 vallen, kunnen hun banden niet duidelijk worden onderscheiden in aanwezigheid van hun aromatische C = C tegenhangers zoals blijkt uit de experimentele gegevens.

Compounds Code Color Mol. For. Mol. Gewicht. (g/mol) Rendement (%) BP1 Licht oranje C19H14N4O4 362.34 85 BA2 Donkergeel C13H10N4O4 286.24 78 MHB3 Donkerrood C13H10N4O5 302.24 92 VL4 Glanzend rood C14H12N4O6 332.27 70 SA5 Glans oranje C13H10N4O5 302.24 64 DHB6 Donkerrood C13H10N4O6 318.24 60

Tabel 1

Chemische structuren en fysische gegevens van de gesynthetiseerde fenylhydrazonen.

3.1.3. Nucleaire Magnetische Resonantie (NMR) Spectroscopie

NMR-bepalingen werden uitgevoerd voor alle zes gesynthetiseerde fenylhydrazonen met behulp van een eendimensionale (1D) NMR-techniek (1H en 13C) en een tweedimensionale NMR-techniek, distortionless enhancement by polarization transfer for quaternary carbons (DEPT-Q). Deze gegevens zijn toegewezen aan elke verbinding in het experimentele gedeelte. De structuren werden bevestigd met 1H NMR, 13C NMR, en DEPT-Q spectrale gegevens zoals weergegeven in de aanvullende informatie voor de verbindingen BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5, en DHB6, respectievelijk. Voor DHB6 (verbinding 6), (Figuur 2, Tabel 1), en van de proton NMR (aanvullende informatie), een chemische verschuiving met resonantie ver beneden het veld betekende de aanwezigheid van het hydroxy proton met een singlet signaal. Het resoneerde verder naar beneden dan het secundaire amineproton vanwege het verhoogde afschermingseffect van de elektronegatieve zuurstof. Deze chemische verschuiving was iets hoger dan die van de hydroxylgroep ( 9,94 ppm) omdat eerstgenoemde dichter bij de chemische omgeving van het elektronegatieve stikstofatoom in de iminebinding ligt. Vandaar dat het eerste hydroxyl singlet signaal bij 11.54 ppm gevolgd werd door een singlet signaal secundair amino proton bij 10.11 door de electronegativiteit van de stikstofgroep vóór het andere hydroxyl signaal. Het aromatische proton ingeklemd tussen twee elektronegatieve nitrogroepen was het volgende signaal dat beneden het veld resoneerde bij 8.86 ppm. Dit werd gevolgd door het proton dicht bij de tertiaire aminogroep. De tertiaire aminogroep aan het imineproton veroorzaakte afscherming en resoneren van de imineprotonen op 8,86 ppm met een singlet-signaal. Het lone proton dat zich het dichtst bij de nitrogroep op de para-positie bevindt, was het volgende signaal met een doubletpiek bij 7,95-7,97 ppm. Het andere lone proton dat zich het dichtst bij de minder elektronegatieve secundaire aminogroep bevindt, gaf ook een doublet signaal bij 7,64-7,66 ppm. De twee andere lone protonen (één tussen de diol en de andere ortho van de imine binding) gaven een multiplet signaal bij 7.52-7.54 ppm, terwijl het proton het dichtst bij de para hydroxy groep en twee koolstofbruggen verwijderd van de imine groep een doublet signaal gaf bij 6.38 ppm.

Figuur 2

Chemische structuur van DBH6 (verbinding 6) .

DEPT-Q wordt gebruikt voor de differentiatie van de primaire, secundaire, tertiaire, en quaternaire koolwaterstoffen. In DEPT-Q verschijnen de methyl- (CH3) en methine- (CH) signalen omhoog in de positieve fase, terwijl methyleen- (CH2) en quaternaire signalen omlaag in de negatieve fase verschijnen. Het DEPT-Q spectrum van DHB6 (aanvullende informatie) onthult de aanwezigheid van opwaartse koolstofsignalen die in dit geval slechts zes methine-koolstoffen vertegenwoordigen en die zich voordoen op 161,8, 159,1, 148,2, 136,7, 130,1 en 112,0 ter bevestiging van de aromatische methine-koolstoffen en zeven quaternaire koolstoffen die zich voordoen op 148,2, 130,1, 129,2, 123,6, 116,9, 108,7 en 102,9. De DEPT-Q voor de andere verbindingen zijn te vinden in de aanvullende informatie.

3.1.4. Massaspectroscopie

Massaspectroscopie wordt gebruikt voor de bepaling van nauwkeurige molecuulgewichten en fragmentatie van verbindingen met behulp van ionisatietechnieken . Samenstelling SA5 fenylhydrazone was een van de meest actieve verbindingen na antimicrobiële evaluatie. Uit het massaspectrum van de elektrospray-ionisatie (ESI) bleek dat de molecuulionpiek in negatieve modus 301,0000 (M-H+) bedroeg, wat de feitelijke massa is met een tolerantiebereik van 0,24 (0,41%) ten opzichte van de theoretische massa van 302,2400. Dit bevestigde het molecuulgewicht van verbinding SA5.

De massaspectroscopie werd gebruikt om het molecuulgewicht van een van de meest actieve verbindingen te bevestigen en werd daarom niet toegepast op de andere.

4. Antimicrobiële Evaluatie

4.1. Minimale remmende concentraties (MIC’s)

Minimale remmende concentratie (MIC) is de laagste concentratie van een antimicrobiële stof die de zichtbare groei van de ziekteverwekker na 24 uur (bacteriën) en 48 uur (schimmels) incubatie remt. De MIC’s van de fenylhydrazonen en twee standaardantibiotica (ciprofloxacine en fluconazol) werden geëvalueerd met de microbroth-verdunningstest tegen een panel van zes pathogene micro-organismen: Gram-negatieven , Gram-positieven , en C. albicans (schimmel, klinische stam).

Alle verbindingen vertoonden zwakke antimicrobiële activiteit tegen testorganismen bij testconcentraties zoals waargenomen in tabel 2. Van de zes verbindingen vertoonde BP1 de hoogste antimicrobiële activiteit tegen de geselecteerde testorganismen. BA2 daarentegen had de minste antimicrobiële activiteit met een MIC van 699 µM tegen alle testorganismen. MHB3 had een MIC van 562 µM tegen C. albicans en 662 µM en meer tegen de rest van de testorganismen. VL4 registreerde een MIC van 602 µM tegen alle testorganismen behalve S. pneumoniae (MIC = 300 µM). De MIC’s van SA5 tegen S. pneumoniae en K. pneumoniae bedroegen respectievelijk 165 µM en 331 µM, terwijl het voor S. aureus, E. coli, P. aeruginosa en C. albicans een hogere MIC had van 662 µM. DHB6 vertoonde activiteit tegen S. pneumoniae, K. pneumoniae, en C. albicans met een MIC van 314 µM, terwijl het voor S. aureus, E. coli, en P. aeruginosa een MIC had van 628 µM en hoger. Het gebruikte antibacteriële referentiegeneesmiddel was ciprofloxacin, en de MIC’s waren 2,36 µM tegen P. aeruginosa, S. pneumoniae, en K. pneumoniae, terwijl 4,72 µM werd geregistreerd tegen S. aureus en E. coli. Het gebruikte referentie-antischimmelmiddel was fluconazol, en de verkregen MIC was 327 µM tegen C. albicans. De MIC van de fenylhydrazonen tegen de twee Gram-negatieve organismen varieerde van 552 µM tot 699 µM, terwijl de standaard ciprofloxacine op respectievelijk 4,72 en 2,36 µM lag (tabel 2).

Testorganismen Minimale remmende concentraties (µM) van de fenylhydrazonen BP1 BA2 MHB3 VL4 SA5 DHB6 CPR FLZ Staphylococcus aureus (+) >552 699 >662 602 662 >628 4.72 Nd Streptococcus pneumoniae (+) 552 699 >662 300,96 165 314 2.36 Nd Escherichia coli (-) >552 699 >662 602 662 628 4.72 Nd Pseudomonas aeruginosa (-) >552 >699 >662 602 662 628 2.36 Nd Klebsiella pneumoniae (-) 138 699 >662 602 331 314 2.36 Nd Candida albicans 552 699 >562 602 662 314 Nd 327

BP1 , BA2 , MHB3 , VL4 , SA5 , DHB6 ; standaard antibiotica: CPR en FLZ . Nd . Alle tests werden uitgevoerd in drievoud (n = 3).

Tabel 2

Antimicrobiële activiteit van de verbindingen tegen het panel van organismen.

4.2. Resistente Modulatie Activiteit

De neiging van de fenylhydrazonen op sub-MICs om de activiteiten van sommige commerciële antibiotica tegen bekende resistente stammen te verbeteren werd onderzocht door middel van de resistente modulatie test. Uit de tabellen 2 en 3 blijkt dat BP1 (verbinding 1) met een sub-MIC van 50 µM tegen S. pneumoniae de MIC van ciprofloxacine verlaagde van 2,36 tot 1.078 µM, wat neerkomt op een verlaging van de MIC van ciprofloxacine met 54,32%. BP1 verbeterde ook de werking van ciprofloxacine bij een sub-MIC van 50 µM tegen K. pneumoniae van 2,36 µM tot 1,078 µM, wat neerkomt op een verlaging van de MIC van het antibioticum met 54,32%. BP1 wijzigde de activiteit van fluconazol tegen C. albicans van 327 tot 2,156 µM, wat een vermindering van 99,34% van de MIC van fluconazol vertegenwoordigt. Evenzo verbeterde BA2 de activiteit van ciprofloxacine tegen S. pneumoniae en verminderde de MIC van ciprofloxacine van 2,36 tot 1,36 µM, wat een vermindering van 42,37% betekent. Bovendien moduleerde BA2 ook de activiteit van fluconazol bij sub-MIC van 50 µM tegen C. albicans en veroorzaakte een verlaging van zijn MIC van 327 tot 1,23 µM, wat duidt op een verlaging van 99,6% van de MIC.

Testorganismen Minimale remmende concentraties (µM) van de fenylhydrazonen BP1 BA2 MHB3 VL4 SA5 DHB6 CPR FLZ Staphylococcus aureus (+) >138 87.3 165 >150 >165 >157 4.72 – Streptococcus pneumoniae (+) 1,078 1,36 1,29 1,176 1.29 1.23 2.36 – Escherichia coli (-) >138 >175 >165 >150 >165 >157 4.72 – Pseudomonas aeruginosa (-) >17,2 87,3 82,7 75,2 2,58 39,3 2.36 – Klebsiella pneumoniae (-) 1.078 5.46 1.29 1.176 1,29 1,23 2,36 – Candida albicans 2.156 273 5.109 1.176 1.29 1.23 – 327

Tabel 3

Resistente modulerende activiteit van de verbindingen tegen het panel van organismen.

MHB3 moduleerde de activiteit van ciprofloxacine tegen S. pneumoniae en Klebsiella pneumoniae en veroorzaakte een verlaging van de MIC van de antibiotica van 2,36 tot 1,29 µM. Deze verlaging van de MIC wijst op een reductie van 45,33%. MHB3 vertoonde ook de modulatie van de activiteit van fluconazol bij sub-MIC van 50 µM tegen Candida albicans en verlaagde de MIC van 327 µM tot 5,109, wat duidt op een maximale verlaging met 98,43%. VL4 verbeterde de werking van ciprofloxacine bij een sub-MIC van 50 µM tegen S. pneumoniae en K. pneumoniae. De MIC van het antibioticum daalde van 2,36 tot 1,176 µM. in beide gevallen. Deze daling van de MIC vertegenwoordigde een vermindering van 50,17%. VL4 moduleerde opnieuw de werking van fluconazol bij sub-MIC van 50 µM tegen C. albicans en verlaagde de MIC tot 1,176 µM van 327 µM, wat een maximale reductie van 99,64% liet zien.

Daarnaast moduleerde verbinding 5 (SA5) de werking van de ciprofloxacine bij sub-MIC van 50 µM tegen S. pneumoniae en K. pneumoniae. De MIC werd in beide gevallen verlaagd van 2,36 tot 1,29 µM, wat resulteerde in een vermindering van 45,34%. SA5 moduleerde opnieuw de werking van fluconazol bij sub-MIC van 50 µM tegen C. albicans en onderdrukte de MIC van 327 tot 1,29 µM, wat een goede reductie van 99,61% aangeeft. DHB6 (verbinding 6) moduleerde ook de activiteit van ciprofloxacine bij een sub-MIC van 50 µM tegen S. pneumoniae en K. pneumoniae en verlaagde de MIC van 2,36 naar 1,23 µM in beide gevallen, wat een verlaging van 47,88% van de MIC vertegenwoordigt. DHB6 moduleerde ook de activiteit van fluconazol bij een sub-MIC van 50 µM tegen C. albicans en verlaagde de MIC van 327 µM tot 1,23 µM, wat neerkomt op een verlaging van de MIC met 99,62%. SA5 en BP1 waren beter dan de andere vier fenylhydrazonen in resistentiemodulerende activiteit samen met ciprofloxacine dat een MIC had van 2,58 µM tegen P.aeruginosa, gevolgd door BP1 (17,2 µM). Vandaar dat de aanwezigheid van een orthohydroxygroep in SA5 en een aromatische ketongroep essentieel zou kunnen zijn voor de resistentiemodulerende activiteit in combinatie met ciprofloxacine tegen Gram-negatieve P.aeruginosa en E.coli. Bovendien verbeterden de aanwezigheid van een meta-hydroxygroep (MHB3), een hydroxy en methoxy (VL4), en de afwezigheid van een substituent op het benzaldehydegedeelte van BA2 ook de activiteit en deze zouden in aanmerking kunnen komen voor toekomstige geneesmiddelenontwikkeling. K. pneumoniae, de andere Gram-negatieve tegenhanger die ernstige infecties veroorzaakt, was gevoeliger voor de fenylhydrazonen bij 138 tot 699 µM. Door de combinatie van subinhibitoire concentraties van de fenylhydrazonen met ciprofloxacine werd de resistentiebarrière van K. pneumoniae verlaagd waardoor een veel lagere MIC van 1,078 van 5,46 µM mogelijk werd, een trend die indrukwekkender is dan die van P. aeruginosa en E.coli.

De fenylhydrazonen hadden een vergelijkbare activiteit tegen de Gram-positieve organismen, variërend van 87,3 tot 699 µM, wat ook duidelijk is van de resistente eigenschappen van Staphylococcus aureus en Streptococcus pneumoniae.

5. Conclusie

Een bibliotheek van zes nieuwe fenylhydrazonen werd met succes gesynthetiseerd en gekarakteriseerd: 1-(2, 4-dinitrofenyl)-2-(difenylmethyleen) hydrazine , 1-benzylideen-2-(2, 4-dinitrofenyl) hydrazine , 3-(2-2-(4-dinitrofenyl) hydrazono) methylfenol, 4-(2-(2, 4-dinitrofenyl)hydrazono) methyl)-2-methoxyfenol , (Z)-2-(2, 4-dinitrofenyl)hydrazono) methylfenol , en 4-(2-(2, 4-dinitrofenyl)hydrazono) methyl)benzeen-1,3-diol.

Als onderdeel van toekomstige drug design en optimalisatie, kunnen de fenylhydrazonen worden beschouwd als structurele backbones als gevolg van hun synthetische haalbaarheid en goede opbrengst. De verbindingen vertoonden zwakke antimicrobiële eigenschappen, maar toonden een sterke resistentie modulerende werking wanneer ze gecombineerd werden met de standaard geneesmiddelen. De activiteiten van de standaarden verbeterden aanzienlijk met een goede verlaging van de MIC-waarden.

Afkortingen

MRSA:	Methicilline-resistente Staphylococcus aureus
ATCC:	American type culture collection
NTCC:	National collection of type cultures
MTT:	(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromide
MIC:	Minimale remmende concentratie
TLC:	Dunnelaagchromatografie
Cfu:	Kolonievormende eenheden
Eq.	Equivalent
DEPT-Q:	Vermindering van polarisatieoverdracht voor quaternaire koolstoffen
HRSMS:	Hogeresolutie massaspectrum.

Beschikbaarheid

De gegevens van het onderzoek zijn beschikbaar in de archieven van het Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Kwame Nkrumah University of Science and Technology.

Conflicts of Interest

De auteurs verklaren geen belangenconflicten met betrekking tot de publicatie van dit paper.

Authors’ Contributions

A.A., A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A., and B.K.H. conceived the research work and prepared the manuscript. C.D.K.A., A.B., en A.A. ontwierpen en voerden de synthese van de verbindingen uit. C.D.K.A., A.A., en I.A. hebben het conceptuele kader ontwikkeld en het manuscript voorbereid. C.D.K.A. en B.K.H. hebben de spectrale resultaten geïnterpreteerd en de structuuropheldering uitgevoerd. Y.D.B. en A.A. voerden de in vitro antimicrobiële assay uit en leverden de experimentele gegevens en interpretatie van de resultaten.

Acknowledgments

De auteurs zijn alle medewerkers en technici van het Department of Pharmaceutical Chemistry, Faculty of Pharmacy, KNUST, Kumasi, Ghana, zeer erkentelijk voor hun steun. De auteurs erkennen de heer Francis Amankwah van de afdeling Farmacie (afdeling Microbiologie), KNUST, voor de technische ondersteuning.

Aanvullende materialen

Het aanvullend bestand bevat alle spectra. (Aanvullende Materialen)