I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.: 9001-99-4
Enzymatische reactie (afbeelding wordt in een nieuw venster geopend)
Pancreatisch ribonuclease (RNase) is een endoribonuclease. Het katalyseert de splitsing van de fosfodiesterbinding tussen de 5′-ribose van een nucleotide en de fosfaatgroep verbonden aan de 3′-ribose van een aangrenzend pyrimidine nucleotide. Deze splitsing vormt een 2′-,3′-cyclisch fosfaat, dat vervolgens wordt gehydrolyseerd tot het overeenkomstige 3′-nucleosidefosfaat.
RNase wordt in de grootste hoeveelheid aangetroffen in pancrease van herkauwers (Barnard 1969). Het belangrijkste bestanddeel van het kristallijne enzym is RNase A; een minder belangrijk bestanddeel is RNase B. RNase B is de geglycosyleerde vorm van RNase A (Beintema et al. 1976).
Geschiedenis:
Het werk van Jones in 1920 wordt meestal genoemd als het “begin” van pancreas ribonuclease (Richards en Wycoff 1971). RNase werd geïsoleerd door Dubos en Thompson in 1938 en gekristalliseerd door Kunitz in 1940.
In 1947 was Worthington de eerste onderneming die sterk gezuiverd kristallijn RNase vervaardigde. In het begin van de jaren 1950 bereidde het bedrijf Armour ruw kristallijn enzym, en bood het aan tegen een zeer betaalbare prijs. In de jaren 1960 en 1970 was RNase A favoriet om te bestuderen, vooral omdat het opmerkelijk thermostabiel is en in hoge concentratie aanwezig is in een toegankelijke bron, namelijk runderpancreas. Deze studies leidden tot de opheldering van de kristalstructuur (Anfinsen 1959, Groves 1966, en Scheraga 1967), de bepaling van de aminozuursequentie (Smyth et al. 1963), de identificatie van het katalytisch mechanisme (Beers 1960), en de opheldering van de vouwingstrajecten (Hantgan et al. 1974). RNase A was het eerste enzym en derde eiwit waarvoor een correcte aminozuursequentie werd bepaald (Raines 1998).
Vier Nobelprijzen zijn toegekend voor werk in verband met studies van RNase (Anfinsen, Moore, Stein, en Merrifield). De uitgebreide literatuur en talrijke studies hebben RNase tot het meest uitvoerig bestudeerde enzym van de 20e eeuw gemaakt (Raines 1998).
Recent werk gaat door met het onderzoeken van de synthese en maturatie van RNase in het endoplasmatisch reticulum van levende cellen (Geiger et al. 2010). Veel werk wordt ook nog steeds gewijd aan het bestuderen van de vouwing en aggregatie van RNase (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008, en Arai et al. 2010). De rol van het enzym bij de ontwikkeling van kanker en de regulering van genen wordt bestudeerd (Shlyakhovenko 2009), en het wordt ontwikkeld tot chemotherapeutische middelen tegen kanker (Chao et al. 2010).
Specificiteit:
RNase A is specifiek voor pyrimidine nucleoside-verbindingen (Volkin en Cohn 1953). Aangenomen wordt dat de reactie in twee stappen plaatsvindt. In de eerste stap wordt de 3′,5′-fosfodiesterbinding gesplitst, waarbij een 2′,3′-cyclisch fosfodiesterintermediair wordt gevormd. In de tweede stap wordt het cyclische fosfodiester gehydrolyseerd tot een 3′-monofosfaatgroep. De eerste stap is niet-specifiek ten aanzien van de stikstofhoudende base van het substraat; de tweede stap is echter absoluut specifiek voor pyrimidine-nucleotiden met eindstandige 2′,3′-cyclische fosfaten. RNase B heeft dezelfde specificiteit als RNase A voor zowel cyclisch cytidylaat als gist-RNA (Plummer en Hirs 1963). RNase A vertoont een voorkeur voor grotere substraten (Nogués et al. 1995).
Het enzym klieft tweemaal zo snel op cytidineresten als op uridylresiduen (Richards en Wyckoff 1971). Thr45 blijkt het belangrijkst te zijn voor het mediëren van de pyrimidine specificiteit, zowel door het vormen van waterstofbruggen met pyrimidine basen als door het sterisch uitsluiten van purine basen (del Cardayré en Raines 1994). De zijketen van Asp83 is belangrijk voor het stabiliseren van de overgangstoestand tijdens de splitsing van uridine-bevattende substraten; dit residu heeft geen effect op de kinetiek van de cytidinesplitsing (del Cardayré en Raines 1995).
Compositie:
De vorm van het eiwit lijkt op een nier, waarbij de residuen van het actieve gebied in de spleet liggen (Richardson 1981, en Raines 1998). De secundaire structuur bevat lange vierstrengs anti-parallelle beta-sheets en drie korte alfa-helixen (Raines 1998). RNase A bevat vier disulfidebindingen, die cruciaal zijn voor de stabiliteit van het natieve enzym. Twee van deze disulfidebindingen liggen tussen een alfa-helix en een bèta-helix en dragen meer bij tot de thermische stabiliteit dan de andere twee (Klink et al. 2000). RNase B is een glycoproteïne dat op Asn34 een enkel oligosaccharide bevat dat bestaat uit zes residuen mannose en twee residuen N-acetylglucosamine (Tarentino et al. 1970).
Moleculaire kenmerken:
RNase A is een klein eiwit, het rijpe enzym heeft slechts 124 aminozuurresiduen, zonder aangehecht koolhydraat. RNase A bevat 19 van de 20 aminozuren, waarbij alleen tryptofaan ontbreekt (Nogués et al. 1995, en Raines 1998). De driedimensionale structuur van RNase A wordt volledig gecodeerd door zijn aminozuursequentie (White en Anfinsen 1959, en Raines 1998). Alle acht menselijke RNase A-achtige genen bevinden zich op chromosoom 14. Elk gen codeert voor een secretorische signaalsequentie en bevat een onveranderlijke katalytische triade van twee histidines en één lysine met een geconserveerd motief (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
De aminozuursequenties van vele homologen van RNase A zijn geïdentificeerd, waardoor RNase A een modelsysteem is voor de moleculaire evolutie van vertebraten (Dyer en Rosenberg 2006). Uit de sequenties en hun verspreiding over een reeks van soorten is vastgesteld dat RNase A een modern eiwit is dat snel evolueert (Doolittle 1992, en Raines 1998).
Proteïne-accessienummer: P61823
CATH-classificatie (v. 3.2.0):
- Klasse: Alpha-Beta
- Architectuur: Roll
- Topologie: P-30 Eiwit
Moleculair gewicht:
- RNase A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNase B: 14,700 ± 0,3 (Plummer en Hirs 1963)
Optimale pH: RNase A: 7,0-7,5 (Brown en Todd 1955)
Isoëlektrisch Punt:
- RNase A: 9,3 (Ui 1971)
Extinctiecoëfficiënt:
- RNase A en B: 8.640 cm-1M-1 (Theoretisch)
- RNase A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNase B: E 1%, 280 = 5.77 (Theoretisch, RNase B)
Actieve Site Residuen:
- Histidine (H12, H119)
- Lysine (K41)
Activatoren:
- Natriumchloride (Weickmann et al. 1981)
- Sulfaat (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibitoren:
- Zware metaalionen
- Ribonuclease inhibitor (RI), een 50 kDa eiwit dat ≤ 0.01% van het eiwit in het cytosol van zoogdiercellen uitmaakt (Takahashi 1967)
- Uridine-vanadaat complexen (Lindquist et al. 1973)
Toepassingen:
- RNA-verwijdering tijdens DNA-isolatie
- RNA-sequentieanalyse
- RNase-beschermingsassays
- RNA-kwantificering of -kartering
- Verwijdering van plasmide-DNA
- Genomisch DNA-isolatie
- Moleculairgewichtsmerker