7 RAG Binding Genomewide
Gezien de directe DNA-bindende eigenschappen van RAG1, gecombineerd met de unieke overvloed aan RSSs aanwezig in de antigen receptor genen, was het redelijk om aan te nemen dat de plaats-specificiteit van V(D)J recombinatie eenvoudigweg wordt afgedwongen door preferentiële rekrutering van RAG1 op zijn geprefereerde DNA substraten. RAG2 zou, door zijn PHD en zijn gebrek aan intrinsieke katalytische activiteit, geen functionele beperkingen moeten vertonen op zijn lokalisatiepatronen. RAG2 bindt zich dan ook over het hele genoom van lymfocyten en bezet een groot deel (~ 60%) van de actieve TSS’s, die verrijkt zijn met H3K4me3 (Ji et al., 2010; Teng et al., 2015). RAG1 lokaliseert echter ook op duizenden plaatsen (~ 3500 in muis thymocyten en pre-B cellen) die gezamenlijk worden bezet door RAG2 en H3K4me3, en omvat een aanzienlijk deel van de zeer actieve, lineage-specifieke promotors en enhancers (Teng et al., 2015). Deze wijdverspreide lokalisatie wordt ook waargenomen voor een katalytische mutant van RAG1 (D708A), wat erop wijst dat de wijdverspreide binding van RAG1 geen postcleavage accumulatie weerspiegelt (Teng et al., 2015). De RAG1-bindingsplaatsen buiten de antigeen receptor genen vertoonden geen duidelijke correlatie met de aanwezigheid van RSS-achtige motieven (cryptische RSS’s, of cRSS’s), wat verder aangeeft dat sequentie-specifieke contacten en RAG-gemedieerde splitsingsactiviteit de patronen van RAG1-binding in het hele genoom niet konden verklaren. In plaats daarvan zijn markers van chromatine toegankelijkheid de beste voorspellers van RAG1 rekrutering: H3K4me3, H3K27Ac, verhoogd GC-gehalte, en verhoogd CpG-gehalte (Teng et al., 2015).
In feite tonen slechts een handvol voorbeelden specifieke RAG1-recruitment aan antigeenreceptorgenen aan via trans-factoren die interageren met zowel RAG1 als specifieke DNA-motieven. In elk geval hangt de locus specificiteit van de rekrutering niet af van de RSS op zich, maar van een transcriptiefactor bindend motief dat toevallig overlapt met een RSS. De Tcrb locus in de muis illustreert een geval waar gerichte RAG1 recrutering bijdraagt tot “beyond 12/23” restricties die helpen om de correcte volgorde van recombinatie te behouden (Dβ-Jβ voorafgaand aan Vβ-DJβ). De 3′ 23-RSSs die Dβ1 en Dβ2 flankeren bevatten geconserveerde bindingsplaatsen voor c-fos, een subeenheid van de AP-1 transcriptiefactor (Wang et al., 2008). Op een manier die onafhankelijk is van zijn transcriptionele activerende eigenschappen, rekruteert c-fos bij voorkeur RAG1 aan de 3′ Dβ RSSs, en bevordert zo de Dβ-Jβ recombinatie (Wang et al., 2008). In de B-lijn is de analoge antigen receptor locus het Igh gen, waar directe Vh-Dh recombinatie wordt afgeraden ten opzichte van Vh-DJh recombinatie. In dit geval lijkt de volgorde van recombinatie echter gereguleerd te worden door lokale verschuivingen in epigenetische markeringen die D-Jh recombinatie volgen, en het DJ product markeren voor preferentiële RAG1 binding en recombinatie ten opzichte van germline Dh gensegmenten (Subrahmanyam et al., 2012). Bovendien wordt directe Vh-Dh recombinatie onderdrukt door een sequentie-element dat bekend staat als IGCR1 en dat tussen de D en V genclusters ligt (Guo et al., 2011). IGCR1 bevat twee vitale CTCF-locaties en wordt verondersteld te functioneren als een ankerpunt voor chromatine-lussen die het DJ-gedeelte van de Igh-locus sequestreren van het V-gedeelte (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). De menselijke Tcrd locus biedt een ander voorbeeld van locus-specifieke RAG1 depositie, waar Runx1-afhankelijke RAG1 rekrutering op Dδ2 een Dδ2-Dδ3 herschikking bevordert die voorafgaat aan klassieke Dδ-Jδ recombinatie (Cieslak et al., 2014). Dit resulteert in mens-specifieke opname van twee D-gensegmenten in Tcrd-herschikkingen. Tenslotte is gesuggereerd dat Pax5 interageert met RAG en de rekrutering van RAG op Vh-gensegmenten vergemakkelijkt (Zhang et al., 2006), hoewel nog moet worden aangetoond dat dit mechanisme de endogene Igh-locusassemblage verbetert.
Behalve deze uitzonderingen lijkt de binding van RAG1 niet primair te beginnen met sequentiespecifieke rekruteringsevenementen. Zelfs binnen de Tcr en Ig genen, strekt de RAG1 binding zich uit voorbij de RSS grenzen, en bezet intronic gebieden die verrijkt zijn in H3K4me3 maar verstoken zijn van RSSs (Teng et al., 2015). Dit wil niet zeggen dat de RSSs geen secundaire rol spelen in het stabiliseren of versterken van RAG1 binding na rekrutering. De Tcra en Igk genen zijn de top recruiters van RAG1 binding in dubbel-positieve thymocyten en pre-B cellen, respectievelijk, en gedefinieerde pieken van RAG1 accumulatie worden duidelijk waargenomen over de RSSs in recombinatie centra (Teng et al., 2015). De uitzonderlijke dichtheid van RSS’s in de antigeenreceptorgenen is waarschijnlijk een van de belangrijkere kenmerken die hen onderscheidt van de rest van het genoom.
Het genoom in het algemeen vertoont echter RSS-onafhankelijke RAG1-recruitment, die waarschijnlijk plaatsvindt via niet-specifieke interacties tussen RAG1 en DNA die worden gemedieerd door verschillende domeinen in de RAG1-kern, waaronder de NBD (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Bovendien kan indirecte rekrutering van RAG1 aan chromatine plaatsvinden door zijn interactie met RAG2, hoewel de laatste niet volledig de RAG1-bindingspatronen kan verklaren, die gedeeltelijk worden gehandhaafd in de afwezigheid van RAG2, zij het met verminderde intensiteit (Teng et al., 2015).
Het genomische bereik van RAG1-bindingsplaatsen, hoewel breder dan voorspeld, breidt zich nog verder uit in de afwezigheid van niet-kerndomeinen van hetzij RAG1 of RAG2. In afwezigheid van de RAG2 C-terminale regio (die de PHD bevat), verspreidt RAG1 zich naar locaties met lagere dichtheden van H3K4me3, in plaats van zich te richten op de meest actieve TSSs (Teng et al., 2015). Eén mogelijkheid is dat dit het gevolg is van een ontmaskering van additionele niet-specifieke DNA-bindende activiteiten van RAG1, gezien de afwezigheid van het auto-inhibitorische domein dat in de RAG2 C-terminale regio ligt (Lu et al., 2015). Een andere mogelijkheid is dat bij afwezigheid van het RAG2 PHD domein, het RAG complex minder geneigd is zich te vestigen in regio’s met een hoog H3K4me3. Ook het feit dat deletie van het RAG2 C-terminale gebied leidt tot een verhoging van het RAG1 eiwitgehalte kan van belang zijn voor het bredere bindingspatroon van RAG1 (Teng et al., 2015). Core RAG1 bindt ook veel promiscuïger dan full-length RAG1, en vertoont, intrigerend genoeg, een verhoogde intensiteit van binding op veel niet-antigeen receptor sites, maar een verlaagde intensiteit op de Tcra locus, in vergelijking met full-length RAG1 (Teng et al., 2015). Dit zou een weerspiegeling kunnen zijn van veranderingen in de intrinsieke DNA-bindende eigenschappen van het afgeknotte RAG1 eiwit, of van de afwezigheid van activiteiten die gecodeerd zijn in de niet-kerntermini van RAG1 (zoals RING-gemedieerde histon ubiquitylatie of C-terminus-gemedieerde auto-inhibitie). Ook het feit dat core RAG1 tot expressie komt op aanzienlijk hogere niveaus dan full-length RAG1 kan van belang zijn.
Het RAG recombinase tolereert sequentie variatie niet alleen in zijn substraten, met name in de RSS spacer, maar ook in de heptamer en de nonamer (Hesse et al., 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Zelfs de RAG1-nonamer interactie gemedieerd door de NBD berust op relatief weinig sequentie-specifieke contacten (Yin et al., 2009). De RSSs die antigeen receptor genen bevolken zijn divers in hun sequentie inhoud (soms aanzienlijk afwijkend van de consensus heptamer en nonamer motieven), en substraat herkenning door RAG moet voldoende flexibel zijn om maximale repertoire diversiteit mogelijk te maken. Buiten de antigeenreceptorgenen vertonen RAG1-bindende sites geen cumulatieve voorkeur voor een bepaalde sequentiesignatuur (Teng et al., 2015).
Flexibele substraatherkenning door RAG creëert echter een probleem voor de rest van het genoom. De vrij minimale sequentie-eisen voor een functionele RSS (althans, volgens de regels die we momenteel begrijpen) maken het mogelijk dat cRSSs vrij vaak voorkomen in vertebrate genomen (Lewis et al., 1997). Het gevaar van toevallige cRSSs wordt duidelijk door hun deelname aan RAG-afhankelijke genetische herschikkingen die bijdragen aan lymfomagenese (Larmonie et al., 2013). Aangezien het merendeel van de RAG1 bindingen in het genoom wordt bepaald door niet-specifieke rekrutering aan DNA of toegankelijk chromatine, lijkt het biologisch gezien verstandig om de beschikbaarheid van sterke cRSSs in de nabijheid van RAG1-bindingsplaatsen te beperken en zo het potentieel voor off-target RAG activiteit te minimaliseren. Inderdaad, RAG1-bindende sites in menselijke en muislymfocyten zijn bij voorkeur verarmd van cRSSs (Teng et al., 2015), en wij stellen dat dit het gevolg is van selectieve druk opgelegd door genetische herschikkingen buiten de antigeen receptor genen. Het repertoire van RAG1-geassocieerde TSSs is dus beschermd tegen RAG-activiteit tijdens V(D)J recombinatie. Wij speculeren dat de zeldzame cRSS’s die activiteit behouden en blijven mediëren bij infrequente ectopische herschikkingen, in het genoom zijn gehandhaafd vanwege hun overlapping met regulerende of functionele sequenties in hun gastheerloci, of eenvoudigweg niet voldoende sterke negatieve gevolgen hebben gehad om tegen geselecteerd te worden.