Necrotrofe levensstijl van Rhizoctonia solani AG3-PT tijdens interactie met zijn waardplant aardappel zoals geopenbaard door transcriptoom analyse

Transcriptoom analyse

De interspecifieke interactie tussen R. solani AG3-PT isolaat Ben3 met de medium resistente aardappel cultivar ‘Arkula’ werd geanalyseerd op transcriptoom niveau met behulp van RNA sequenering. Om factoren te vinden die belangrijk zijn voor het tot stand komen van de interactie en het verdere verloop ervan, gebruikten we drie verschillende bemonsteringen: zuiver mycelium van R. solani AG3-PT isolaat Ben3 gekweekt zonder aangetrokken te worden door een groeiende aardappelplant (Ben3); aardappelscheuten op 3 dpi van de knollen met R. solani (vroeg) en 8 dpi (laat). Bij beide data van bemonstering van R. solani in interactie met de aardappelscheut werden alle opkomende scheuten geoogst en gebruikt in de analyse. Necrotische laesies op spruiten werden voor het eerst zichtbaar op 8 dpi. Vervolgens werden RNA-extractie, RNA-sequencing (RNAseq) en mapping van de gelezen data aan het genoom van isolaat Ben334 uitgevoerd om de reads per kilobase per miljoen gemapte reads (RPKM) waarden te berekenen. In het algemeen werd voor de geïnoculeerde monsters tussen 1 en 23% van elke dataset in kaart gebracht aan het Ben3-ontwerpgenoom. Voor de controlemonsters kon tussen 70 en 75% van deze datasets in het Ben3-genoom worden gekarteerd.

In alle drie de bemonsteringen kon een vergelijkbaar aantal genen als tot expressie komend worden gedetecteerd (tabel 1). In zuiver mycelium werden 11.206 genen van de geïdentificeerde 12.567 genen op het R. solani AG3-PT isolaat Ben3-genoom tot expressie gebracht, terwijl lezingen konden worden gekarteerd op 10.181 en 9.939 genen op 3 dpi en 8 dpi, respectievelijk. Samengevat, in alle transcriptomen binnen dit experiment kwamen 11.287 genen van de geïdentificeerde 12.567 genen op het R. solani AG3-PT isolaat Ben3-genoom tot expressie in elk van de geanalyseerde monsters.

Zoals duidelijk uit tabel 1, verschilden de hoeveelheden van de totale gemapte leest aanzienlijk. Dit is te wijten aan het feit dat in de Ben3 bemonstering het transcriptoom van het zuivere mycelium van R. solani AG3-PT isolaat Ben3 is gesequeneerd, terwijl in de vroege en late bemonsteringen (3 en 8 dpi) een tweeledige RNAseq benadering is gebruikt om gelijktijdig toegang te krijgen tot het transcriptoom van beide op elkaar inwerkende organismen30. Aangezien de grootte van de bibliotheken en de hoeveelheid sequenties die uit elke bibliotheek werden geproduceerd vergelijkbaar waren, konden bij de Ben3-bemonstering bijna alle gelezen sequenties aan het genoom van het Ben3-isolaat worden gekoppeld. In de dual RNAseq benaderingen van de bemonsteringen op 3 en 8 dpi, slechts een fractie van de geproduceerde gelezen kan worden gekoppeld aan de Ben3 genoom, terwijl de anderen voornamelijk gemapt aan het aardappelgenoom. Als gevolg van deze verschillende hoeveelheden van de totale gemapte reads aan het R. solani AG3-PT isolaat Ben3 genoom per bemonstering moet het volgende in overweging worden genomen: (1) genen met een lage RPKM waarde alleen in Ben3 niet noodzakelijk niet tot expressie komen wanneer de schimmel de plant uitdaagt, het kan gewoon te wijten zijn aan de grootte van de bibliotheek; (2) genen die tot expressie komen in alle drie de bemonsteringen kunnen worden toegewezen als zijnde algemeen tot expressie komend; (3) genen die alleen tot expressie komen in de veel kleinere bibliotheken van de 3 en 8 dpi bemonsteringen kunnen worden verondersteld als zijnde interactie-specifiek.

De samengevatte karteringsresultaten (Tabel 1) gaven reeds aan dat er veel genen moeten zijn die in alle drie de bemonsteringen gemeenschappelijk tot expressie komen. Daarom werd een Venn-diagram geconstrueerd om de drie bemonsteringen te vergelijken en het berekende aantal gemeenschappelijke genen te visualiseren tegenover het aantal genen dat de afzonderlijke bemonsteringen onderscheidt (Fig. 1). Meer dan 9.000 genen bleken tot expressie te komen in alle drie de bemonsteringen, terwijl 871 uitsluitend getranscribeerd werden in het mycelium zonder plantcontact. In de monsters van 3 en 8 dpi werden 29 genen gemeenschappelijk tot expressie gebracht, die alleen tot expressie komen in aanwezigheid van de levende aardappelplant. Bovendien kwamen bij 3 dpi 27 genen exclusief tot expressie, en sequentielezen die zich toe-eigenden aan een kleine set van 21 genen waren exclusief detecteerbaar bij 8 dpi. Lijsten van deze genen, samen met hun respectievelijke RPKM-waarden en beschrijvingen, worden gegeven in de aanvullende tabellen 1 – 4.

Van de 29 genen die algemeen tot expressie kwamen in aanwezigheid van de levende aardappelplant, coderen vier genen voor eiwitten die betrokken zijn bij de afbraak van de plantencelwand. Dit komt overeen met de virulentiestrategie van een necrotrofe ziekteverwekker met secretie van celwand-afbrekende enzymen om necrose van de gastheercel en lekkage van nutriënten te induceren21. Bovendien ondersteunt één gen dat codeert voor een eiwit dat betrokken is bij eiwitafbraak deze aanvalslijn. Bovendien staan twee genen die coderen voor eiwitten met DNA-bindende domeinen en een vermoedelijke functie in de transcriptieregulatie ook in deze lijst en spelen ze waarschijnlijk een rol in de transcriptieregulatie van het delict (bv. Ben3g4553, zie tabel 2). De meerderheid van de 27 genen die op 3 dpi exclusief tot expressie komen, coderen voor hypothetische eiwitten waaraan geen putatieve functie kan worden toegekend. Van de 21 genen die uitsluitend tot expressie kwamen in latere stadia van de interactie (8 dpi), coderen acht genen voor eiwitten die betrokken zijn bij de afbraak van de plantencelwand en twee coderen voor proteasen. Dit toont nogmaals de typische strategie van een necrotrofe ziekteverwekker aan.

Samenvattend heeft een eerste onderzoek van de transcriptoomgegevens van de drie bemonsteringen duidelijke en redelijke verschillen aan het licht gebracht, wat het potentieel van deze studie aantoont om factoren te vinden die belangrijk zijn voor de totstandkoming van de interactie tussen R. solani AG3-PT isolaat Ben 3 met een vatbare aardappelcultivar en verdere interactieprogressie.

De meest overvloedige R. solani AG3-PT transcripten in de drie bemonsteringen

De interspecifieke interactie tussen R. solani AG3-PT isolaat Ben 3 met de mediumresistente aardappelcultivar ‘Arkula’ werd in eerste instantie geëvalueerd door het onderzoeken van de meest overvloedige transcripten in de drie verschillende bemonsteringen. In groeiend mycelium, gekweekt in vloeibare cultuur, werden transcripten van 11.206 genen van het isolaat Ben3 genoom gevonden. In totaal werden 698 transcripten van deze genen gedetecteerd met mediane RPKM-waarden van 100 en hoger, 37 met mediane RPKM-waarden groter dan 1.000. In de vroege interactiefase (3 dpi) van knolspruiten met de ziekteverwekker werden transcripten van 10.181 genen gedetecteerd, waarvan 729 met mediane RPKM-waarden van 100 en hoger, 25 met mediane RPKM-waarden van meer dan 1.000. Een aantal van 9.939 genen van R. solani AG3-PT werden getranscribeerd met 742 met mediane RPKM-waarden van 100 en hoger, 26 mediane RPKM-waarden groter dan 1.000 op 8 dpi (Supplementary Tables 5-7). In totaal kwamen 9.679 genen van het isolaat Ben3-genoom tot expressie in alle drie de bemonsteringen, waaronder de meest voorkomende transcripten in elk van de geanalyseerde afzonderlijke bemonsteringen. Vijf van deze meest tot expressie komende genen (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326, en Ben3g675) coderen voor R. solani specifieke hypothetische eiwitten met onbekende functies. Er werd dus niet verwacht dat deze eiwitten een specifieke rol zouden spelen tijdens de interactie met de plant; deze eiwitten kunnen eerder belangrijk zijn voor de algemene groei en het cellulaire metabolisme. Onder de meest voorkomende transcripten in elk van de afzonderlijke bemonsteringen zijn ook verscheidene eiwitten die lectine-domeinen bevatten (Ben3g9146, Ben3g9350, en Ben3g8869). Een aantal van dergelijke eiwitten die een ricine-type beta-trefoil lectine domein bevatten zijn ook eerder gerapporteerd als het meest overvloedig in het R. solani AG1-IB isolaat 7/3/14 tijdens interactie met zijn waardplant sla30. Hoewel de specifieke rol van deze lectinedomeine-eiwitten niet bepaald is, werd voorgesteld dat R. solani lectines een functie zouden kunnen hebben als opslageiwit binnen het mycelium37. Bovendien werden twee genen die coderen voor eiwitten met een thuringiensis toxine domein (Ben3g8806, en Ben3g11931) ook sterk getranscribeerd in alle drie geanalyseerde monsters. Bacillus thuringiensis-toxinen zijn bacteriële eiwitten die bekend staan om hun biocidale werking tegen insecten38 , maar ook tegen een reeks andere organismen worden ze gericht39. De sterke expressie van dergelijke toxine-domein-homologen in R. solani wijst erop dat deze toxines van algemeen belang kunnen zijn voor R. solani AG3-PT isolaat Ben3 en niet zozeer een specifieke rol spelen in de schimmel-plant interactie. Een gen dat codeert voor een septale pore cap proteïne (Ben3g7115) behoorde ook tot de meest voorkomende transcripten in alle drie de bemonsteringen, wat wijst op zijn bijdrage tot de hyphale homeostase bij basidiomycetische schimmels40. Een transcript dat lijkt op het septale pore cap eiwit (RSOLAG1IB_6054) was ook zeer abundant in R. solani AG1-IB isolaat 7/3/14 transcripten gevonden in symptoomloze zone van interactie met sla30. Dit eiwit, specifiek voor R. solani, maakt deel uit van het opvulmateriaal dat de perforaties in de septale poreuze kap van hyphale cellen afsluit en het transport van cytoplasmatische vloeistoffen tussen naburige cellen verhindert. Bovendien behoorde een gen dat codeert voor een hemopexine-domeine-eiwit (Ben3g6614) ook tot de hoogst tot expressie komende genen in alle drie de bemonsteringen. Dit domein duidt op zink-afhankelijke metalloproteïnasen, waarvan algemeen wordt aangenomen dat ze een belangrijke rol spelen in de homeostatische regulering van het extracellulaire milieu41, maar hun biologische functies kunnen ook verder reiken dan de afbraak van de extracellulaire matrix42. Aangezien al deze eiwitten een hoge abundantie vertoonden in R. solani AG3-PT met en zonder contact met de waardplant, kunnen ze belangrijk zijn voor de algemene groei en het metabolisme, maar lijken ze niet van specifiek belang te zijn in de schimmelinteractie met de plant.

De interactie tussen R. solani AG3-PT en aardappel

Om elementen te vinden die relevant zijn voor de ondersteuning van de interactie van R. solani AG3-PT isolaat Ben3 met de aardappelscheut, werd differentiële genexpressie uitgevoerd zoals geïntegreerd in het ReadXplorer platform (v2.2)43. Deze paarsgewijze vergelijking van transcriptomen van zuiver mycelium van isolaat Ben3 met transcriptomen van hetzij 3 dpi of 8 dpi interactie met aardappelscheuten werd uitgevoerd met behulp van het DESeq2-programma. Genen werden als differentieel tot expressie gebracht met een aangepaste P waarde van minder dan 0.05 en een minimale vouwverandering van |2| of meer. Met behulp van deze criteria konden 592 genen worden toegewezen als differentieel geïnduceerd op 3 dpi (som van 242 genen uitsluitend vroeg geïnduceerd en 350 genen geïnduceerd op 3 dpi en ook op 8 dpi; early up) terwijl 520 genen differentieel gereduceerd zijn op 3 dpi (som van 412 genen uitsluitend vroeg gereduceerd en 108 genen gereduceerd op 3 dpi en ook op 8 dpi; early down). Op 8 dpi, bleken 688 transcripten differentieel geïnduceerd te zijn (som van 338 genen exclusief laat geïnduceerd en 350 genen geïnduceerd op 8 dpi en ook op 3 dpi; laat up) en 233 zijn differentieel gereduceerd (som van 125 genen exclusief laat gereduceerd en 108 genen gereduceerd op 8 dpi en ook op 3 dpi; laat down). Venn diagrammen werden geconstrueerd om de differentieel upgereguleerde en downgereguleerde genen op beide tijdstippen tijdens de interactie te vergelijken en te visualiseren (Fig. 2). Lijsten van deze genen samen met hun respectievelijke waarden van de vouwverandering worden gegeven in de supplementaire tabellen 8-9.

Expressieverschillen gevonden met deze DESeq2 analyse werden gevalideerd in experimenten met qRT-PCR. Daarom moet een geschikt controlegen met een invariant expressiepatroon worden vastgesteld. Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (Ben3g7151, GAPDH), ubiquitine-conjugerend enzym E2 (EUC63156, UBC), ubiquitine-eiwit ligase E3 (Ben3g494, UBI), elongatiefactor 2 (Ben3g3364, EF-2), en beta-tubuline genen (Ben3g4099; TUB1) en (Ben3g5288, TUB2) werden getest en het beta-tubulinegen Ben3g5288 (TUB2) bleek de meest geschikte referentie te zijn in onze experimenten. De relatieve transcriptieniveaus van drie kandidaat-genen met verschillende expressiepatronen werden genormaliseerd op basis van de expressie van deze invariante controle. ΔΔCq waarden werden berekend en vergeleken met de respectieve DESeq2 analyse (Tabel 2).

Voor alle drie kandidaat-genen met een zeer verschillend expressiepatroon waren de berekende ΔΔCq waarden in overeenstemming met de respectieve log2voudige veranderingswaarden berekend in de DESeq2 analyse, waarmee de validatie van expressieverschillen werd aangetoond.

Daarnaast werden gen-ontologie (GO) annotaties uitgevoerd om respectieve functies aan de specifieke genen toe te wijzen. In de verdere analyse werd een specifieke focus gelegd op significant geïnduceerde genen om bij voorkeur moleculaire kandidaten te vangen die belangrijk zouden kunnen zijn voor het initiëren en tot stand brengen van de interactie met de plant.

Differentieel tot expressie komende genen (DEG’s) in isolaat Ben3 bij 3 dpi van aardappelscheuten

Differentieel tot expressie komende genen in isolaat Ben3 in interactie met aardappelscheuten bij 3 dpi in vergelijking met zuiver mycelium van het isolaat werden geselecteerd op basis van functies bij het initiëren en ondersteunen van het interactieproces met de aardappelscheuten. De vermoedelijke functies van de specifieke genproducten en hun verdeling over de gemeenschappelijke GO-aspecten voor biologisch proces (BP), moleculaire functie (MF) en cellulaire component (CC) worden gegeven in Fig. 3.

Op 3 dpi zijn de differentieel geïnduceerde genen voornamelijk toegewezen als betrokken bij koolhydraat- en cellulaire stikstofverbindingen metabolische processen en bij transport. Bijna 10% (50 genen) van de differentieel geüpreguleerde genen codeert voor verschillende peptidasen (bv. Ben3g2070, zie Tabel 2), terwijl 53 genen coderen voor celwandafbrekende enzymen, waaronder verschillende hydrolasen die inwerken op glycosylbindingen, en pectaatlyasen (bv. Ben3g3530, zie Tabel 2.) of xylanasen. Om deze celwandafbrekende enzymen verder te specificeren, werden alle DEG’s ook geannoteerd volgens de Carbohydrate Active enZyme (CAZy) database (supplementaire tabel 11). Secretie van een groot arsenaal hydrolytische enzymen zoals proteasen en celwandafbrekende enzymen tijdens de interactie44,45 is vereist voor necrotrofe fungale plantpathogenen zoals R. solani om celnecrose te induceren door afbraak van structurele eiwit- en koolhydraatcomponenten van de plantencelwanden en om lekkage van nutriënten te veroorzaken9,30,46,47. Er wordt dus verondersteld dat de geïnduceerde celwandafbrekende enzymen en verscheidene van de geïnduceerde peptidasen de interactie van R. solani AG3-PT met het weefsel van de aardappelscheut ondersteunen. Gesecreteerde peptidasen zijn echter ook uitvoerig bestudeerd voor hun rol als effectoren van Gram-negatieve bacteriën48 en ook schimmels47,49. Effectoren van pathogenen worden gewoonlijk als virulentiefactoren in de gastheercellen gebracht om de basale afweerreacties te onderdrukken en een geschikte omgeving te creëren voor de voortplanting van de pathogeen50,51,52. De post-translationele modificatie van gastheereiwitten door proteolytische verwerking is dus een veelgebruikt mechanisme bij het reguleren van de afweerreactie van planten. Met de huidige stand van de kennis zou men kunnen veronderstellen dat één of meer van deze geïnduceerde proteasen een vermeende rol spelen als effectoren die de interactie van R. solani AG3-PT met de aardappelgastheer ondersteunen. Verdere functionele analyses van de individuele proteasen zijn echter nodig om hun functionele rol in de pathogeen-gastheer interactie duidelijk toe te wijzen.

Een andere grote groep bestaande uit 100 leden van differentieel geüpreguleerde genen van de interactie op 3 dpi wordt beschreven als coderend voor hypothetische eiwitten. De meeste van deze genen zijn R. solani specifiek en homologen konden gevonden worden in de andere vijf geannoteerde genomen van R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8, en R. solani AG1-IA en AG1-IB. Uit onze differentiële genexpressie analyse wordt verwacht dat sommige van deze genen betrokken zijn bij de ondersteuning van de interactie van R. solani AG3-PT op de aardappelscheut. Het is reeds bekend dat gesecreteerde effectoren van schimmelpathogenen de immuniteit van de gastheer aanpakken met verschillende strategieën, bv. door hydrolyse van een salicylzuurprecursor53 of door binding aan transcriptiefactoren waardoor hun activiteit wordt geremd54. Verdere analyses zijn nodig om mogelijke functies van de tot nu toe hypothetische eiwitten te ontdekken voor hun verschillende mogelijke rollen in de interactie van R. solani AG3-PT met aardappel.

Interessant is dat het sterkst differentieel verhoogde gen (Ben3g6247) homoloog is met lipid-translocating exporter (LTE) familie-eiwitten, zoals RTA1 uit Saccharomyces. Het RTA1 eiwit bevat zeven potentiële membraan-overspannende segmenten55 en is naar verwachting een integraal membraaneiwit met een functie in celweerstand tegen xenobiotica56. Andere genen van de LTE-familie coderen mogelijk voor transporters of sensoren die de uitscheiding van biosynthetische tussenproducten vergemakkelijken, hetzij direct, hetzij indirect56. Deze vermeende functies van de LTE-familie-eiwitten maken het gen Ben3g6247 tot een favoriete kandidaat die betrokken is bij de secretie van componenten die belangrijk zijn voor de pathogene aanval.

De vroege fase van de necrotrofe interactie gaat gepaard met celdood van de plantgastheer en de productie van diverse secundaire metabolieten en de accumulatie van reactieve zuurstofspecies21. Er werd aangetoond dat antioxidantprocessen en respectievelijke genexpressie gecorreleerd waren met necrotische weefsels in verschillende R. solani pathosystemen (aardappelscheut-R. solani AG3; sojahypocotyl-R. solani AG4 en sojablad-R. solani AG1-IA)27. In de vroege fase van de interactie van de aardappelgastheer met isolaat Ben3 (3 dpi) konden geen sterke aanwijzingen voor inductie van antioxidantprocessen in pathogene hyfen op transcriptioneel niveau worden waargenomen, omdat er geen sterke toename was in glutathion S-transferase genexpressie of upregulatie van andere genen waarvan bekend is dat ze betrokken zijn bij het wegvangen van reactieve zuurstofspecies. Daarom zou men kunnen stellen dat in ons systeem om de aardappelscheut te koloniseren met R. solani AG3-PT, weefselanalyse om 3 dpi lijkt op een vroeg stadium van de plant pathogeen interactie misschien voorafgaand aan infectie van het scheutweefsel. Er werden geen zichtbare symptomen waargenomen op dit tijdstip.

Differentieel tot expressie komende genen in isolaat Ben3 bij 8 dpi van aardappelscheuten

Om transcripten te vinden die belangrijk zijn in een gevorderd stadium van de interactie, werden differentieel geïnduceerde genen tussen zuiver mycelium van isolaat Ben3 en Ben3 aangetrokken tot aardappelscheuten bij 8 dpi gescreend. De respectieve functionele annotaties van de genproducten en hun verdeling in de gemeenschappelijke GO-kenmerken worden getoond in Fig. 4. Op 8 dpi zijn de differentieel geïnduceerde genen voornamelijk toegewezen als betrokken bij koolhydraat- en macromoleculaire stofwisselingsprocessen en bij transport. In dit latere stadium van de interactie coderen de 152 geüpreguleerde genen (> 22%) voor verschillende celwand-afbrekende enzymen (bv. Ben3g3530, zie Tabel 2). Bovendien werden alle DEG’s ook geannoteerd volgens de Carbohydrate Active enZyme (CAZy) database (supplementaire tabel 11). Deze verhoogde expressie van genen die coderen voor celwandhydrolytische enzymen toont mooi de toenemende pathogene activiteit van het isolaat Ben3 aan, alsook het belang van de afbraak van celwandcomponenten om toegang te krijgen tot de nutriënten in de loop van de interactie, wat de beschreven virulentiestrategie van een necrotrofe pathogeen bevestigt21,57. Deze destructieve tactiek ging gepaard met een inductie van expressie van genen die coderen voor integrale membraancomponenten. Deze 154 grotendeels ongekarakteriseerde integrale membraaneiwitten en putatieve transporters waren vermoedelijk betrokken bij de opname van voedingsstoffen en afbraakproducten van de hydrolaseactiviteiten. In dit stadium van de interactie leek het overheersende belang van genen die coderen voor peptidasen af te nemen, maar nog steeds waren 33 genen die codeerden voor peptidasen differentieel geüpreguleerd (b.v. Ben3g2070, zie tabel 2). Dit zou ook verklaard kunnen worden door het feit dat hele spruiten geoogst werden, inclusief de spruiten die tot 8 dagen in interactie waren met de uitdagende ziekteverwekker en de latere opkomende spruiten met een kortere interactieperiode. In het algemeen is dit ook vertegenwoordigd in de 350 genen die gemeenschappelijk differentieel verhoogd waren op 3 en 8 dpi (Fig. 2).

Bovendien bestaat een andere grote groep DEG’s op 8 dpi uit 98 genen met onbekende functie. Aangezien deze genen Rhizoctonia-specifiek zijn en geen overeenkomst vertonen met sequenties met toegewezen functies, kan enkel gespeculeerd worden over hun rol in de ondersteuning van de pathogeen-plant interactie. Verdere functionele vergelijkingen van deze genen en bv. hun differentiële expressie in de respectievelijke pathosystemen zouden hints kunnen geven over hun vermoedelijke functie.

In het hier beschreven experimentele systeem om de aardappelscheut te koloniseren met R. solani AG3-PT isolaat Ben3 worden laesies voor het eerst zichtbaar op 8 dpi. In andere experimenten25,27 werd aangetoond dat necrotrofe interactie en celdood in de plant-gastheer gecorreleerd was met respectievelijke genexpressie in de plant en in de schimmel. Samsatly en medewerkers27 toonden met kwantitatieve RT-PCR aan dat de expressie van antioxidantgenen die coderen voor glutathion S-transferase en catalase significant verhoogd was in R. solani AG3 vijf dagen na inoculatie van losgemaakte aardappelscheuten. Maar zo’n sterk verhoogde expressie van deze antioxidantgenen kon niet gevonden worden in de hier beschreven experimenten. Redenen voor deze verschillen zouden te wijten kunnen zijn aan inoculatie met isolaten van R. solani AG3 die verschillen in pathogeniciteit vertonen. Een ander verschil is echter het feit dat Samsatly en medewerkers27 experimenten uitvoerden met losgemaakte scheuten in een beperkt in vitro systeem, terwijl onze experimentele opzet volledig de omstandigheden van de in vivo omgeving weerspiegelt met groeiende scheuten op gekweekte zaadknollen. Verdere onderzoeken samen met de gelijktijdige transcriptoomanalyse in de aardappelgastheer zal uiteindelijk het inzicht vergroten in een wederzijdse relatie in de gastheer-pathogeeninteractie in een omgeving die lijkt op de natuurlijke situatie.

Differentieel tot expressie komende genen in isolaat Ben3 bij vergelijking van 3 en 8 dpi van aardappelscheuten

Om een onderscheid te maken tussen R. solani AG3-PT transcripten die vooral relevant waren op vroege tijdstippen en transcripten die belangrijker werden in gevorderde stadia van de interactie werden ook differentieel uitgedrukte genen tussen 3 en 8 dpi van de interactie geanalyseerd met DESeq2. Gebruik makend van de bovenvermelde criteria met aangepaste P-waarden van minder dan 0.05 en een minimale vouwverandering van |2| of meer konden 173 genen worden toegewezen als differentieel verminderd tot expressie komend tussen 3 en 8 dpi terwijl 400 genen differentieel verhoogd tot expressie komen op het latere tijdstip. Volledige lijsten van deze genen samen met hun respectieve base-gemiddelde waarden en waarden van de vouwverandering worden gegeven in supplementaire tabel 10, lijsten van de 20 meest differentieel uitgedrukte genen tussen 3 en 8 dpi worden gepresenteerd in de tabellen 3 en 4. Terwijl 10 van de 20 meest differentieel verlaagde tot expressie komende genen tussen 3 en 8 dpi coderen voor eiwitten betrokken bij eiwitafbraak en stikstofopname en assimilatie (Tabel 3), is de meerderheid van de genen differentieel verhoogd tot expressie tussen 3 en 8 dpi betrokken bij polysaccharide afbraak met focus op koper-afhankelijke lytische polysaccharide mono-oxygenasen voor splitsing van cellulose ketens met oxidatie van verschillende koolstoffen (Tabel 4).

Het is bekend dat stikstofmetabolisme en stikstofgereguleerde genexpressie in de plantpathogene schimmels van groot belang is voor de vestiging van de ziekte in de waardplant58. Nitraat is echter de minst geprefereerde stikstofbron in vergelijking met ammonium en L-glutamine wat betreft het gebruik van nutriënten door schimmels, althans tijdens de infectie van de bladeren59. Bij schimmels wordt dit voorkeursnutriëntengebruik gereguleerd via stikstofmetabolietenrepressie en zorgt het voor de transcriptie van voor ammonium en ureum actieve permease-coderende genen. Naast de sterke voorbijgaande expressie van genen die coderen voor ammonium en stikstofhoudende verbindingen transporterende permeases (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369, en Ben3g7775) in de vroege interactiefase op 3 dpi, vertoonde R. solani AG3-PT isolaat Ben3 ook een hoge inductie en expressie van genen betrokken bij nitraatopname en assimilatie (Ben3g6360, Ben3g6359, en Ben3g6361). Of dit een onderscheidend kenmerk is van het isolaat Ben3 of een kenmerk van in de bodem voorkomende plantpathogene schimmels zou verder onderzoek moeten uitwijzen.

De meerderheid van de genen met een differentieel verhoogde expressie tussen 3 en 8 dpi zijn betrokken bij celwandafbraak en coderen voor hydrolasen die inwerken op glycosylbindingen, en pectaatlyasen. Dit was te verwachten en toont nogmaals het toenemend belang aan van de afbraak van celwandcomponenten die de virulentiestrategie van een necrotrofe ziekteverwekker bepaalt.21