Micronucleus
MN ontstaan uit chromosoomfragmenten of hele chromosomen die tijdens de celdeling achterblijven bij de anafase en niet in de hoofdkernen worden opgenomen.13,18,19 MN zijn kleine extranucleaire lichamen die in delende cellen ontstaan uit acentrische chromosoom/chromatidefragmenten of hele chromosomen/chromatiden die in de anafase achterblijven en in de telofase niet in de dochterkernen worden opgenomen.20 In de telofase vormt zich een kernomhulsel rond de achterblijvende chromosomen en fragmenten, die zich vervolgens ontrollen en geleidelijk de morfologie van een kern in de interfase aannemen, behalve dat ze kleiner zijn dan de hoofdkernen in de cel (vandaar de term “micronucleus”).19 MN die chromosoomfragmenten bevatten, kunnen het gevolg zijn van directe dubbelstrengs DNA-breuken, omzetting van enkelstrengs breuken in dubbelstrengs breuken na celreplicatie, of remming van de DNA-synthese.20
MN kunnen via verschillende wegen worden gevormd: namelijk uit acentrische chromosoom- of chromatidefragmenten. Een klein deel van de acentrische chromosoomfragmenten kan eenvoudigweg ontstaan uit niet-gerepareerde dubbelstrengs DNA-breuken. Andere mechanismen die tot MN-vorming uit acentrische fragmenten kunnen leiden, zijn gelijktijdige excisieherstel van beschadigde (bv. 8-oxo-deoxyguanosine) of ongeschikte basen die in DNA zijn opgenomen (bv. uracil) en die zich in de nabijheid van en op tegenover elkaar liggende complementaire DNA-strengen bevinden.21 Een ander mechanisme dat kan leiden tot MN door chromosoomverlies is hypomethylering van cytosine in centromerische en pericentromerische herhalingsreeksen zoals klassieke satellietherhalingen in pericentromerische gebieden en hogere-orde herhalingen van satelliet-DNA in centromerisch DNA.21 Vanwege de centrale rol van kinetochore-eiwitten in het binden van chromosomen met de spindel, is het waarschijnlijk dat mutaties die leiden tot defecten in de dynamica van de kinetochore- en microtubule-interactie de oorzaak kunnen zijn van de vorming van MN door chromosoomverlies in de anafase. Andere variabelen die waarschijnlijk MN doen ontstaan door chromosoomverlies zijn defecten in de assemblage van de mitotische spindel, defecten in de controlepunten van de mitose en abnormale amplificatie van de centrosomen.21
Het lot van MN na hun vorming in de micronucleate cel wordt slecht begrepen. Hun postmitotische lot omvat: (1) eliminatie van de micronucleate cel als gevolg van apoptose; (2) uitdrijving uit de cel (wanneer verwacht wordt dat het DNA in de MN niet functioneel is of in staat is tot replicatie vanwege de afwezigheid van de noodzakelijke cytoplasmatische componenten); (3) reïncorporatie in de hoofdkern (wanneer de gereïncorporeerde chromosomen niet te onderscheiden zijn van die van de hoofdkern en de normale biologische activiteit zouden kunnen hervatten); en (4) retentie binnen het cytoplasma van de cel als een extranucleaire entiteit (wanneer de MN één of meer replicatierondes van DNA/chromosomen kan voltooien).20,22
Het belangrijkste voordeel van de CBMN-test ligt in zijn vermogen om zowel clastogene als aneugene gebeurtenissen te detecteren, die respectievelijk tot structurele en numerieke chromosoomafwijkingen leiden.20 Clastogenen induceren MN door de dubbele helix van het DNA te breken, waarbij acentrische fragmenten worden gevormd die niet in staat zijn zich aan de spindelvezels te hechten en in de dochterkernen te integreren, en die dus tijdens de mitose worden weggelaten. Hetzelfde gebeurt met hele chromosomen met beschadigde kinetochores; zij kunnen zich niet hechten aan de microtubuli die de chromatiden tijdens de mitose naar de dochtercellen trekken en blijven dus buiten de nieuwe kernen. Deze schade kan worden veroorzaakt door chemicaliën die reageren met eiwitten die de kinetochoren vormen.23,24
Aneugens zijn chemicaliën die de vorming van het spindelapparaat tijdens mitose verhinderen. Deze agentia veroorzaken niet alleen hele chromatiden die uit de kernen worden gelaten, waardoor MN worden gevormd, maar ook de vorming van multinucleaire cellen, waarin elke kern een verschillend aantal chromosomen zou bevatten. Deze agentia veroorzaken waarschijnlijk ook een toename van de mitotische aantallen, die op dezelfde objectglaasjes duidelijk te zien zijn. Met de CBMN-test is het mogelijk onderscheid te maken tussen MN afkomstig van hele chromosomen en die afkomstig van acentrische fragmenten, en te bepalen of malsegregatie van chromosomen optreedt tussen kernen in een binucleaire cel die misschien geen MN bevat, door centromerische probes te gebruiken.8,10,19
Pancentromerische DNA-probes worden gebruikt om onderscheid te maken tussen MN afkomstig van elk voorval waarbij hele chromosomen verloren gaan en MN die acentrische chromosoomfragmenten bevatten. Het gebruik van chromosoomspecifieke centromeer-DNA-probes maakt zowel de bepaling mogelijk van specifieke chromosoomverliezen die in MN resulteren als ongelijke segregatie van specifieke chromosomen tussen dochterkernen, zelfs zonder MN-vorming.21 Pancentromeer-probes mogen alleen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen MN die afkomstig zijn van chromosoombreuken (centromeernegatief) en chromosoomverlies (centromeerpositief). Chromosoom-specifieke centromeerprobes mogen alleen worden gebruikt om malsegregatie (door nondisjunctie of chromosoomverlies) te meten waarbij unieke chromosomen betrokken zijn.8,10,19,21,25 Evaluatie van de mechanistische oorsprong van individuele MN door centromeer- en kinetochore-identificatie draagt bij tot de hoge gevoeligheid en specificiteit van de methode.20
Belangrijke factoren beïnvloeden de baseline MN-frequentie in humane lymfocyten. Leeftijd en geslacht zijn de belangrijkste demografische variabelen die de MN-index beïnvloeden; de frequenties bij vrouwen zijn groter dan die bij mannen met een factor van 1,2-1,6, afhankelijk van de leeftijdsgroep.26 De MN-frequentie was significant en positief gecorreleerd met leeftijd bij mannen en vrouwen en wordt beïnvloed door voedingsfactoren zoals foliumzuurtekort en plasmawaarden van vitamine B12 en homocysteïne. Er werd ook voorgesteld dat de MN-index kan worden beïnvloed door de neiging van de cellen van een individu om apoptose te ondergaan, en door genetische factoren zoals genetische polymorfismen.10,20,27
In een algemene vorm wordt de vorming van MN toegeschreven aan een verscheidenheid van insulten aan genetisch materiaal, die kunnen worden geclassificeerd als exogene en endogene factoren. Exogene factoren zijn straling, chemische stoffen en invasie van micro-organismen. Endogene factoren zijn genetische defecten, pathologische veranderingen, tekorten aan essentiële voedingsbestanddelen (bijv. foliumzuur), en letsels veroorzaakt door schadelijke stofwisselingsproducten (zoals reactieve zuurstofspecies).28
De hypothese van een voorspellende associatie tussen de frequentie van MN in CBMN-test in lymfocyten en de ontwikkeling van kanker wordt ondersteund door een aantal bevindingen: (1) een verband tussen MN-frequentie en kankerrisico werd afgeleid uit mechanistische overeenkomsten met chromosoomafwijkingen, waarvan is aangetoond dat ze voorspellend zijn voor kanker; (2) in vitro wordt een hoge concordantie waargenomen tussen chromosoomafwijkingen en MN; (3) een toename van de MN-frequentie wordt waargenomen in lymfocyten van kankerpatiënten en bij patiënten met syndromen die hen vatbaar maken voor kanker, zoals het Bloom-syndroom en ataxia telangiectasia; (4) de MN-frequentie is significant geassocieerd met de bloedconcentratie van vitamines zoals foliumzuur, waarvan een tekort geassocieerd wordt met een verhoogd risico op bepaalde kankers; (5) er is een direct verband tussen MN-frequenties en vroege stadia van carcinogenese: namelijk een significant verband tussen verhoogde MN-frequenties en laag- en hooggradige diagnostische categorieën van baarmoederhalscarcinogenese bij vrouwen.20
Vorming van nucleaire anomalieën zoals MN, chromosomale herschikkingen en anafase-bruggen (leidend tot breuk-fusie-brug cycli en generatie van meer MN) zijn gebeurtenissen die vaak worden gezien in de vroege stadia van carcinogenese. Verhoogde niveaus van MN wijzen op defecten in DNA-herstel en chromosoomsegregatie die kunnen resulteren in de generatie van dochtercellen met veranderde gen-dosering, of deregulering van genexpressie die kan leiden tot de evolutie van het chromosoominstabiliteitsfenotype dat vaak bij kanker wordt gezien. Deze overwegingen geven mechanistische steun aan een mogelijk oorzakelijk verband tussen de frequentie van MN en het risico van kanker. In een studie van Bonassi et al.29 werd een verband waargenomen tussen de frequentie van MN en het risico van kanker bij niet-hematologische maligniteiten, wat suggereert dat gebeurtenissen die het genoom beschadigen in lymfocyten via een gemeenschappelijke genetische, voedings- of milieufactor gecorreleerd kunnen zijn met gebeurtenissen die het ontstaan van kanker in andere weefsels in de hand werken.