Microbiology & Experimentation

De isolatie en karakterisering van bacteriestammen uit Barrackpore Municipality en Dhapa afvalstortplaats werd ondernomen in deze studie. Bacteriële groei is afhankelijk van verschillende fysisch-chemische omstandigheden zoals media, pH, temperatuur, incubatieperiode, koolstofbron enz. Daarom moeten verschillende omstandigheden waaronder bacteriën in de natuur groeien, worden bestudeerd alvorens over te gaan tot massale vermeerdering voor gebruik als afbreker. Daarom werden de volgende parameters in aanmerking genomen:

Fysische en chemische kenmerken van vast stedelijk afval

Bacteriën kunnen groeien in een breed scala van vochtigheidsgraden. In deze studie werd vastgesteld dat het vochtgehalte van de verzamelde monsters van de gemeente Barrackpore en de vuilstortplaats van Dhapa respectievelijk ongeveer 65,32% en 66,45% bedroeg. De bacteriële populatie van verschillende bodems is nauw gecorreleerd met hun vochtgehalte. De maximale bacteriedichtheid wordt aangetroffen in regio’s met een vrij hoog vochtgehalte en het optimale niveau voor de activiteiten van aërobe bacteriën ligt vaak bij 50%-75% van het vochthoudend vermogen van de bodem.1 Aërobe bodems worden meestal gekenmerkt door aantallen van de geslachten Pseudomonas, Achromobacter en Bacillus; waar de omstandigheden anaëroob en vochtig zijn, komt Clostridium voor. Actinomyceten vertoonden onder dergelijke omstandigheden een soortgelijke kwantitatieve toename.15

In deze studie werd de pH van de twee geselecteerde media (BCDA en NA) geoptimaliseerd voor het kweken van bacteriestammen. De ph van het verzamelde monster was 7,79 in beide monsters. De pH is een sleutelfactor voor het kweken van bacteriën in kunstmatige media. De optimalisatie van de pH werd uitgevoerd in twee geselecteerde media, namelijk Nutriënt Agar (NA) en Basic czapek dox agar (BCDA). NA en BCDA bij pH 7,2 en 7,6 bleken geschikt voor de maximale groei van de bacteriestammen. Uit de resultaten bleek dat de pH van het monster ongeveer 7,79 was en mogelijk om deze reden bleken deze stammen ook goed te groeien in in vitro-conditie bij pH 7-8 in BCDA en NA. Bacteriën kunnen een bodemreactie verdragen tussen pH 4 en 10, maar de meest gunstige pH voor de meerderheid is juist een alkalische kant tot neutraliteit. Bacteriën zoals Thiobacillus thiooxidans en Acetobacter sp. zijn in staat te groeien bij de zeer lage pH-waarden tussen pH-waarde 0 en 2 en sommige Bacillus sp. kunnen groeien bij pH 11.15 Optimale groei van Thermoactinomyceten treedt op bij pH 8 of 9 en wordt sterk onderdrukt door reacties van rond pH 516 Vibrio, Streptococcus faecalis en Escherichia coli verdragen ook een alkalische reactie (pH 8-9).16

Het NPK-gehalte van het monster werd aanvankelijk bestudeerd. Het gehalte aan organische stof bleek 27,84% (gemeente Barrackpore) en 29,32% (Dhapa) te zijn, het stikstofgehalte in % was 0,165 (gemeente Barrackpore) en 0,179 (Dhapa), het fosforgehalte in % was 0,502 (gemeente Barrackpore) en 0,545 (Dhapa) en het kaliumgehalte in % was 18,29 (gemeente Barrackpore) en 19,21 (Dhapa). Al deze analyses gaven een duidelijk inzicht in het inheemse milieu van de bacteriën en waren dus de bepalende factoren bij de isolatie en kweek van de stammen.

Culturele kenmerken van bacteriële isolaten

In onze studie werden BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 en C3 -deze 9 bacteriële stammen geïsoleerd in kweekmedia. Czapek dox agar en Nutrient agar werden geselecteerd om te bepalen welke media het meest geschikt waren voor de massale groei van de geïsoleerde stammen. czapek dox agar (BCDA) was geschikt voor massale groei van BM3, D1,C2 en Nutrient agar (NA) medium was geschikt voor massale groei van BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. Er werd gezien dat gistextract xylan bevattende media geschikt was voor maximale groei van bacteriën, maar Pseudomonas sp., Bacillus spp., Aeromonas sp. groeien goed in nutriënt agar media. Visuele en microscopische observatie werd gebruikt om de geselecteerde stammen te karakteriseren. Details van de kolonie-kenmerken van de bacteriën zijn genoteerd (Tabel 1). Gramkleuring is een oude en betrouwbare methode voor het waarnemen van de bacteriën. Gram-negatieve bacteriën werden ontkleurd met alcohol, waarbij de paarse kleur van kristalviolet verloren ging. Gram-positieve bacteriën werden niet ontkleurd en bleven paars.

In het huidige onderzoek, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 en C3 – werden deze 9 bacteriestammen geïsoleerd en de microbiologische karakterisering werd uitgevoerd. Uit de resultaten bleek dat BM1, BM3, D1 grampositieve bacillen zijn, BM2 grampositieve korte bacillen, D2 grampositieve diplobacillen, D3, C2 gramnegatieve bacillen, D4 gramnegatieve korte bacillen en C3 grampositieve kokken. Verschillende biochemische testen werden ook uitgevoerd op de 9 isolaten om hun biochemische karakteristieken te kennen. Details van de biochemische karakteristieken van de bacteriën zijn vermeld in (Tabel 2).

De bovenstaande resultaten gaven een idee van de morfologie, de kolonie kenmerken en de biochemische aard van de geïsoleerde stammen, wat zou helpen bij de identificatie en karakterisering van de geïsoleerde bacteriestammen in de toekomst.

Optimalisatie van de groeiomstandigheden

In het huidige onderzoek werd de groei van geïsoleerde stammen waargenomen in verschillende groeimedia zoals NA, ACDA en BCDA. Er werd gezien dat de basic czapek dox agar (BCDA) geschikt was voor massale groei van BM3, D1, C2 en Nutrient agar (NA) medium was geschikt voor massale groei van BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

In dit experiment werden de bacterieculturen van 9 stammen geïncubeerd bij verschillende temperaturen zoals 25, 29, 34, 37 en 40 °C. De optimale groei van alle stammen werd gevonden bij 37°C. Het optimale temperatuurbereik voor bacteriën ligt tussen ongeveer 25-36°C. Een groot aantal bacteriën kan vrij goed groeien bij een temperatuur van 10-4°C.6 Sultana17 merkte op dat een temperatuur van 33±4°C ideaal was voor de groei van bacteriën.17 Bepaalde bacteriën ontwikkelen zich het krachtigst bij temperaturen onder 20°C. Thermofielen groeien goed bij temperaturen van 45-65°C en sommige thermofielen zijn niet in staat zich te vermenigvuldigen beneden 40°C.1

De in deze studie verkregen stammen werden gedurende verschillende incubatieperioden (6, 12, 24, 36, 48 en 72 uur) geïncubeerd. Incubatieperiode van 24 uur was geschikt voor BM1, BM2, D2, D3, D4, C3 terwijl BM3, D1 en C2 geschikt bleken te zijn met een incubatieperiode van 36 uur. Coliform bacteriën groeien in de incubatieperiode van 24± 2 uur en bij 32°C en vertonen goede groei bij 37°C gedurende 48 uur incubatie. Bij visuele observatie bleek dat na 24 uur incubatie BM2 licht oranje van kleur was, BM1 was wit en BM3 was romig wit in hun voorkeursmedium (BCDA en NA). Na 48-72 uur incubatie was de kleur van BM2 oranje, BM1, D1 waren geel, C2 was rood en BM3, D2, D3, D4, C3 bleven crèmewit. De kolonietypes van BM1, BM2, D2 en D4 stammen waren nat en de rest was crèmekleurig. Stafylokokken en micrococcen produceren goudbruine, gele of witte kolonies op gewone media. Sommige Enterococcen, Coryneformen en Enterobacteriën kunnen zwarte kolonies produceren op gewone media.8

Antagonisme assay

Cross streaking methode werd gebruikt om het antagonisme tussen de bacteriestammen te bepalen voor hun toekomstige toepassing in verschillende aspecten. Details van het antagonisme binnen de bacteriële isolaten worden beschreven (tabel 3).

BM2 heeft antagonisme met alle andere stammen, zodat het niet mogelijk is een consortium te ontwikkelen met deze stam als een van de isolaten. D1, D3 hebben ook antagonisme met de meeste andere stammen. BM1 is de sterkste stam, aangezien deze met geen van de andere isolaten antagonisme vertoont. BM3, D2, D4, D5 en D6 hebben antagonisme met enkele isolaten en deze stammen kunnen samen met BM1 in verschillende combinaties worden getest voor de bereiding van een consortium.

Tolerantietest voor zware metalen

Vijf zware metalen (As, Zn, Pb, Hg, Cd) werden geselecteerd voor de bepaling van de metaaltolerantiecapaciteit van de geïsoleerde bacteriestammen (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3). De tolerantietest toonde aan dat van de vijf onderzochte zware metalen, de maximale tolerantie voor Pb de groei van micro-organismen vertoonde tot 4000ppm en de minimale tolerantie voor Cd geen groei vertoonde boven 30ppm. MIC werd vastgesteld wanneer de isolaten zelfs na 10 dagen incubatie niet groeiden op de platen. Het resultaat toont aan dat voor alle drie de bacteriën de MIC varieerde van 250ppm tot 350ppm voor As, Cd (10-30ppm), Zn (200-300ppm), Hg (200-300ppm) en Pb (3000-4000ppm) (Tabel 4). In de huidige studie werd de hoogste tolerantie voor As en Cd gevonden in BM1 terwijl de hoogste tolerantie voor Zn werd waargenomen in BM2 en BM3 vertoonde de hoogste accumulatie van Hg en Pb. In onze studie is het meest toxische metaal (met de laagste MIC) cd, terwijl het minst toxische metaal Pb is (Tabel 4).

MIC werd vastgesteld wanneer de isolaten zelfs na 10 dagen incubatie niet op platen groeiden.18 Mergeay et al.19 testten de minimale remmingsconcentraties (MIC’s) van verschillende metalen en stelden vast dat het meest toxische metaal (met de laagste MIC) kwik was, terwijl het minst toxische metaal mangaan was.19 De microbiële tolerantie bij elke concentratie van zware metalen werd afgebeeld met de cup assay test. De diameter van de remmingszone rond elk kopje nam toe naarmate de concentratie van de zware metalen toenam, wat wijst op een toxisch effect van de zware metalen op de groei van de micro-organismen. De gemeente Barrackpore en de afvalstortplaats Dhapa verzamelen al het vast huishoudelijk en industrieel afval van respectievelijk de stad Barrackpore, de stad Kolkata en de omliggende gebieden. Het afval afkomstig van huishoudelijke en industriële bronnen is de geschikte omgeving waar de micro-organismen resistentie tegen zware metalen kunnen ontwikkelen. De aanwezigheid van kleine hoeveelheden zware metalen in het vaste afval kan leiden tot het ontstaan van micro-organismen die resistent zijn tegen zware metalen. De microbiële resistentie tegen zware metalen wordt toegeschreven aan een aantal ontgiftingsmechanismen die door resistente micro-organismen worden ontwikkeld, zoals complexatie door exopolysacchariden, binding met bacteriële celomhulsels, metaalreductie, metaalefflux enz. Deze mechanismen worden soms gecodeerd in plasmide-genen die de overdracht van resistentie tegen toxische metalen van de ene cel naar de andere vergemakkelijken.20 Het organisme dat resistent is tegen zware metalen zou een potentiële agent kunnen zijn voor bioremediëring van verontreiniging met zware metalen. Aangezien zware metalen allemaal gelijkaardig zijn in hun toxisch mechanisme, zijn meervoudige metaaltoleranties veel voorkomende fenomenen bij bacteriën die resistent zijn tegen zware metalen.21

Antibioticagevoeligheidstest

Antibioticagevoeligheidstest helpt om te bepalen hoe doeltreffend een antibioticum is tegen het testorganisme. De 9 isolaten werden gescreend op hun gevoeligheid voor vier antibiotica en het resultaat is genoteerd (tabel 5). Antimicrobiële verbindingen worden geproduceerd door de meeste isolaten, die van nut kunnen zijn voor de medische wetenschap. D1, D3 en D5 vertoonden geen antimicrobiële activiteit.