Klinische, genetische en structurele basis van schijnbare mineralocorticoïd overmaat als gevolg van 11β-hydroxysteroïd dehydrogenase type 2 deficiëntie

Resultaten

Wij rapporteren de demografische en klinische fenotype van 36 genetisch bevestigde AME patiënten van het International Consortium of Rare Steroid Disorders. De meerderheid van de patiënten was van Omaanse (22 van de 36) en Perzische (6 van de 36) afkomst, met 75% als gevolg van consanguine huwelijken, voornamelijk binnen Oman (Fig. 1B en Tabel S1). De mediane leeftijd van AME diagnose was 4,6 jaar (range: 0,1-15) en het cohort was gelijk verdeeld voor beide geslachten. De meerderheid van de patiënten (86%) was voldragen geboren, en 76% was klein geboren voor de zwangerschapsduur. Fig. 1A laat zien dat er in ons cohort zes missense, één insertie, twee deletie, en drie frameshift mutaties waren, en twee indels. Verwacht vanuit de pathofysiologie van AME, was de gemiddelde arteriële druk verhoogd boven het 90ste percentiel voor alle proefpersonen (Fig. 1C). Het gemiddelde serum kalium gehalte bij diagnose was laag met 2.72 mmol/L (range: 1.5-4.1 mmol/L), terwijl serum bicarbonaat hoog was met 29.5 mmol/L (range: 20-38 mmol/L) (Fig. 1 D en E). De serum aldosteronspiegels waren naar verwachting laag (Fig. 1F), met twee patiënten met verhoogde niveaus om onduidelijke redenen. Bovendien waren de reninespiegels laag, behalve bij twee patiënten (10,4 en 14 ng/mL/h) die in therapie waren (Tabel S1). In een subgroep van 29 patiënten was de gemiddelde (THF + alloTHF)/THE ratio, die de belangrijkste urinaire metabolieten van cortisol en cortison weergeeft, significant verhoogd bij 19 (bereik: 3-55, normaal: 1,0) (Fig. 1G). Opmerkelijk is dat 27 van de 36 (75%) patiënten ook nefrocalcinose vertoonden. De nefrocalcinose kan het gevolg zijn van chronische langdurige hypokaliëmie, zoals bijvoorbeeld opgemerkt bij het Bartter syndroom type III (14).

Om te begrijpen of het klinische fenotype van HSD11B2 deficiëntie voorspeld kan worden door veranderingen in de enzymstructuur, veroorzaakt door een bepaalde HSD11B2 mutatie, te onderzoeken, voerden we in silico analyses uit met behulp van drie oestrogene HSD17B1 die een 27% sequentie overeenkomst vertoonden met HSD11B2 over 284 aminozuren (Fig. S1A). Het menselijke HSD11B2 model vertoonde een karakteristiek geconserveerd NAD-bindend Rossmann vouwmotief (Fig. S1B) met een aangrenzende substraat-bindende plaats (Fig. S1 C en D). De 500-ns MD simulaties van de monomere en dimere vormen van HSD11B2 gaven een stabiel model met stabiel gevouwen eiwit (Fig. S1 E-H). We gebruikten Internal Coordinate Modeling (ICM) software (www.molsoft.com) (18) om ΔΔG van missense mutaties gevonden in AME patiënten of experimenteel gemanipuleerde mutaties te bepalen. Alle mutaties (Fig. 2A) vertoonden een toename van ΔΔG waarden, wat wijst op het verlies van eiwitstabiliteit en functie (Fig. 2B).

HSD11B2 bestaat als een homodimer in zijn inactieve toestand (13). Vier residuen, te weten R186, E190, A237 en R336, liggen op de dimeer-interface en zouden daarom de vorming van een dimeer kunnen belemmeren (Fig. 2C). Residuen R186 en E190 bevinden zich op de dimeer-interface op de α4 helix. Een intersubunit ion-paar interactie (R186-E190) wordt gevormd als gevolg van de tweevoudige omgekeerde symmetrie van de aangrenzende subunit (Fig. 2D), verwant aan het R112-E120 ion-paar in HSD17B1 (15⇓-17). Belangrijk is dat deze interactie stabiel bleek te zijn, en gehandhaafd bleef gedurende 500-ns MD simulaties (Fig. 2 E-G). Bovendien bleek de interactie de α4-helix te stabiliseren en de flexibiliteit rond de co-enzymbindingsplaats te behouden. De R186C mutatie resulteert dus in het verlies van het intersubunit ionenpaar en duwt het evenwicht in de richting van de vorming van een actief monomeer enzym (Fig. 2H). De mutatie verhindert ook de vorming van het intra-helische ionenpaar en maakt zo de destabilisatie mogelijk van structurele elementen rond de co-enzymbindingsplaats.

Er zijn diverse andere verstorende mutaties op dit dimeerraakvlak, waarbij de residuen A237, D244, L251 en D176 betrokken zijn. Het residu A237 wordt omgeven door L241 en V239 van beide HSD11B2-subeenheden. De mutatie naar Val verhoogt de hydrofobiciteit van deze cluster en versterkt de inactieve dimere toestand van het enzym (Fig. 2I). Het residu D244 creëert niet alleen een zoutbrug binnen de eenheid met R336 die de α5 helix en de β7 vellen bij elkaar houdt, maar ook waterstofbrug interacties met R360 van de aangrenzende subeenheid (Fig. 2J). De mutatie naar Asn vermindert de sterkte van de R360 interactie, wat leidt tot het verlies van de zoutbrug met R366; dit, op zijn beurt, doet afbreuk aan de stabiliteit van het eiwit. Ook de mutatie van de hydrofobe zijketen L251 naar de hydroxylgroep van Ser verhoogt de polariteit en vormt een waterstofbrug met de positief geladen zijketengroepen van R361; dit verbetert de dimerbinding (fig. 2K). Tenslotte creëert de mutatie van D176 naar Asn een waterstofbrug tussen asparagine en T200, waardoor de inactieve dimertoestand wordt versterkt (Fig. 2L).

Mutaties van HSD11B2 residuen die de substraat- of co-enzym (NAD+) bindingspocket vormen, hebben in in vitro studies aangetoond de enzymactiviteit te elimineren (19) en ernstige AME te veroorzaken. Bijvoorbeeld, Y226 bevindt zich in de substraat-bindende holte (Fig. 3A). De aromatische fenol zijketen vormt hydrofobe interacties met de aromatische ring van het substraat. De Y226N mutatie vervangt dit residu door een niet-aromatisch residu, wat resulteert in het verlies van hydrofobe stapeling, wat interfereert met substraatbinding (Fig. 3A). Bovendien verandert deze mutatie de zijketen van hydrofoob in hydrofiel, wat ongunstig is voor de binding van een hydrofoob substraat. De A221V mutatie vervangt de korte zijketen door een iets volumineuzere zijketen van Val, waardoor de substraatbinding wordt verstoord doordat het volume van de zak wordt verkleind, terwijl de A221G mutatie de hydrofobiciteit vermindert en flexibiliteit introduceert rond de stijve bindingszak (Fig. 3B).

Ons model laat zien dat de polaire 17-OH groep in cortisol in een hydrofoob gebied zit, omgeven door Y226, P227, en L229. Deze hydroxylgroep is afwezig in corticosteron, wat resulteert in versterkte hydrofobe interacties en ∼10-voudig hogere bindingsaffiniteit met HSD11B2 vergeleken met cortisol (Fig. S2A). Behalve in de nieren komt HSD11B2 ook tot expressie in de placenta. Hoewel de mineralocorticoid receptor niet tot expressie komt in dit weefsel, inactiveert HSD11B2 cortisol om zijn groeiremmende en proapoptotische effecten tijdens de embryonale ontwikkeling te elimineren. Tijdens de zwangerschap kan het hoge niveau van progesteron in de maternale circulatie zich binden aan en de activiteit van HSD11B2 moduleren. Dit kan zich vertalen in effecten van verlies-van-functie mutaties die de progesteron binding verstoren op het geboortegewicht. Bijvoorbeeld, de A221V mutatie beïnvloedt de binding van progesteron meer dan cortisol vanwege de sterische botsingen tussen Val en de projecterende methylgroepen in progesteron (Fig. S2B). Zeer interessant vinden we dat de twee patiënten met de A221V mutaties klein waren voor de zwangerschapsduur (Tabel S1). Evenzo beïnvloedt de A221G-mutatie de progesteronbinding indirect door de structuur van de bindingsplaats te veranderen. Ook de Y226N-mutatie is nadeliger voor de binding van progesteron, omdat zij de hydrofobe interacties tussen het progesteronskelet en de hydroxyfenylring van tyrosine vermindert (Fig. S2B). P227 daarentegen biedt indirecte structurele steun aan de bindingsplaats, en mutatie naar Leu heeft vergelijkbare effecten voor zowel cortisol als progesteron (Fig. S2B).

Er zijn vier mutaties die zich in de co-enzymbindingsplaats bevinden en deze verstoren, waardoor de activiteit van HSD11B2 ernstig wordt aangetast. De zijketen van residu L179 is normaal ruimtelijk gepositioneerd in een korte bocht tussen de β4-blad en α4-helix (Fig. 3C). Door interacties met de hydrofobe zijketens van V174 en L282 mogelijk te maken, maken deze interacties de co-enzym-bindende plaats flexibeler. Mutatie naar Arg introduceert een guanidinium zijketen, die interacties mogelijk maakt met de carboxylgroep zijketen van E172 en de hydroxylgroep zijketen van T184 (Fig. 3C), waardoor stijfheid in de draai wordt geïntroduceerd en de flexibiliteit die nodig is voor een optimale enzymfunctie afneemt (7). Y232, gelegen in de co-enzym bindingszak, is een zeer geconserveerd residu in het Rossmann vouwmotief (20), wat suggereert dat de mutatie ervan nadelig zal zijn voor de enzymactiviteit (21). De hydroxyl-fenyl zijketen van Y232 vormt belangrijke waterstofbruggen met N171 en NAD+, waardoor het co-enzym in de juiste positie wordt gehouden voor zijn katalytische functie (Fig. 3D). Deze interactie is verstoord in de Y232C mutatie die ernstige AME veroorzaakt. Het belang van dit residu voor de enzymactiviteit is onafhankelijk bevestigd door verschillende gemanipuleerde mutaties (21) (Fig. 3D). Bij de G89D-mutatie botst de carboxylzijde van Asp sterk met het ribose-suikergedeelte van adenosine, wat de binding van NAD+ beïnvloedt (Fig. 3E). Een andere gemanipuleerde mutatie K236R leidt tot de verstoring van de NAD-binding (Fig. 3F). Hoewel de mutatie de mogelijkheid tot interactie met NAD+ via waterstofbruggen behoudt, wordt de enzymactiviteit door de mutatie opgeheven (21).

Aantastingen van de structurele stabiliteit van HSD11B2 verstoren de tertiaire structuur, waardoor de enzymactiviteit duidelijk afneemt en er ernstige AME optreedt. Het residu L250 is gepositioneerd in de α5 helix, en zijn zijketens zitten in een strakke hydrofobe zak omgeven door de zijketens van L204, F246, W253, V255, en V257 (Fig. 4A). De hydrofobe zakresiduen worden opgesloten door een ion-paar interactie tussen R208 en E249. Het toevoegen van een Pro-zijketen breekt de α5 helix door starheid te introduceren. Deze zak is ook te krap om de grote, volumineuze guanidinium zijketen van Arg te herbergen (Fig. 4A). Een daaropvolgend verlies van hydrofobiciteit in deze regio beïnvloedt de structurele stabiliteit. Een andere stabiele intrahelicale ion-paar interactie wordt gevormd tussen D144 en R147 (Fig. 4B). Deze interactie zorgt ervoor dat de α3-helix zich stevig kan verpakken met de aangrenzende β-sheets nabij de NAD+ bindingsplaats. De D144V mutatie resulteert in het verlies van deze interactie en destabiliseert de pakking (Fig. 4B). De hydrofobe pakking is ook verstoord bij de F185S mutatie, wanneer de aromatische zijketen van fenylalanine, omgeven door hydrofobe residuen van V182, C188 en M189, vervangen wordt door een polaire zijketen van serine (Fig. 4C). Evenzo is de hydrofobe zijketen van L363, omgeven door M347, I350, en F362, gepositioneerd in een helix-turn-helix (Fig. 4D). De L363P mutatie verstoort de helix en het lokale structurele milieu.

Daarnaast kunnen verschillende mutaties de pakking van het HSD11B2 eiwit verstoren om de stabiliteit te verminderen door de introductie van een bultiger residu. Residu A328 vormt een hydrofobe interactie met V215, I260, I325, en Y338 (Fig. 4E). Door de alanine te vervangen door een volumineuzer Val residu, veroorzaakt de A328V mutatie sterische botsingen met de zijketens van I260 en Y338 van de omliggende β-sheets (Fig. 4E). Residu S180 is gepositioneerd op een lus en zijn hydroxylgroep zijketen interageert met de zijketen en backbone stikstof van T184 (Fig. 4F). Deze zijketen ligt in een zeer beperkte ruimte en beperkt het accommoderen van een volumineuzer residu, wat sterische botsingen veroorzaakt, in feite zonder de eiwitstructuur te veranderen. Een Phe zijketen met een volumineuze aromatische ring, zoals in de S180F mutatie, wordt op deze positie dus niet getolereerd (Fig. 4F).

Veelvoudige waterstofbruggen en zoutbruggen tussen polaire residuen stabiliseren de tertiaire structuur van het HSD11B2 enzym. Bepaalde mutaties veroorzaken een verlies van deze interacties, wat resulteert in inactief enzym en ernstige AME. Zo is bijvoorbeeld de zoutbrug tussen R208 en E249 kritisch (Fig. 4G). Het verlies ervan, zoals in het geval van de R208C- en R208H-mutaties, destabiliseert het eiwit en resulteert in ernstige ziekte (Fig. 4G). Op dezelfde manier vormt D223 een zoutbrug met R337 (Fig. 4H). Door deze zoutbrug te vervangen door een minder sterke binding, een waterstofbrug, verandert de D223N-mutatie het negatief geladen residu in een ongeladen polair residu, wat resulteert in een duidelijke verzwakking van de in vitro activiteit (22). Dit suggereert ook dat de zoutbrug een cruciale rol speelt in het handhaven van de stabiliteit en activiteit van HSD11B2. De zijketens van R213 vormen waterstofbruggen met de ruggengraatatomen van de residuen A331 en L329 (Fig. 4I). Door het verminderen van deze waterstofbruggen, die helpen om de tertiaire structuur van het eiwit in stand te houden, vermindert de R213C-mutatie de stabiliteit van het enzym (Fig. 4I).

De Arg/Tyr-cluster van residuen 335-339 is eerder betrokken geweest bij het handhaven van de stabiliteit van het eiwit, hoewel het precieze mechanisme onduidelijk is gebleven (23). Mutaties in deze residuen zijn gerapporteerd in AME patiënten, waaronder R337C en Y338H. Simulaties van de monomere en dimere HSD11B2 modellen suggereren dat residu R337 een zoutbrug interactie vormt met D223 en waterstofbruggen met de OH groep van Y339 (Fig. 4J). Deze interacties lijken belangrijk te zijn voor het behoud van de juiste vouwing en stabiliteit van het eiwit. De mutatie naar Cys heft dus zowel de zoutbrug als de waterstofbrug op, waardoor het enzym destabiliseert en ernstige AME veroorzaakt wordt. Genetisch gemanipuleerde mutaties van dit residu laten verder zien dat R337K, die polariteit en positieve lading behoudt, de enzymactiviteit met 70% vermindert, terwijl R337A, die vergelijkbaar is met R337C in het hebben van ongeladen en korte zijketens, HSD11B2 volledig inactiveert (23) (Fig. 4J). In dezelfde Arg/Tyr cluster, inactiveert mutatie van Y338 naar His het enzym en veroorzaakt ernstige AME. Ons model suggereert dat dit Tyr-residu hydrofobe interacties vormt met A328 en waterstofbruggen met D327 (Fig. 4K). Beide interacties helpen de stabiliteit van het eiwit te handhaven, zodat bijvoorbeeld de vervanging van Tyr door His, HSD11B2 inactiveert. Dit komt omdat, hoewel Y338H het vermogen tot waterstofbinding behoudt, het kortere zijketens heeft die het enzym destabiliseren. Evenzo wordt de vervanging van Tyr door Phe in een geconstrueerd Y338F construct niet getolereerd. Hier blijven de hydrofobe interacties behouden, maar wordt de waterstofbinding opgeheven (23). Tenslotte zijn R337 en Y338 in de Arg/Tyr cluster ook zeer goed geconserveerd bij veel diersoorten; veranderingen in deze residuen worden dus waarschijnlijk niet getolereerd (23).

Er zijn verschillende mutaties gerapporteerd die een mildere vorm van AME veroorzaken met minder ernstige klinische en biochemische verschijnselen. Bij de desbetreffende gemuteerde constructen is aangetoond dat de HSD11B2-activiteit in vitro behouden blijft (4, 19, 24), hetgeen consistent is met het minder ernstige klinische fenotype. Structureel kunnen deze mutaties ofwel indirect de substraatbinding verstoren (zoals de P227L mutatie bij een van onze patiënten) of de eiwitstructuur veranderen (zoals de R279C en R359W mutaties) om de enzymactiviteit te verzwakken, maar niet op te heffen (Fig. 5). Opmerkelijk is dat, hoewel het P227 residu niet op een positie ligt die direct interageert met het substraat, de naburige positie ten opzichte van residu Y226 suggereert dat het een rol zou kunnen spelen in substraatbinding (Fig. 5A). In feite vormt dit residu de “knik” in de lus, waardoor de conformatie van de actieve site behouden blijft en ook Y226 in de juiste positie wordt gehouden voor een optimale interactie met het substraat. Mutatie van dit residu in Leu (P227L) verstoort de knik en verandert de positionering van Y226 (Fig. 5A).