Abstract
Vroeger heeft onze groep aangetoond dat nucleaire expressie van het E3 ubiquitin ligase (MDM2) in maligne pleuraal mesothelioom (MPM) significant geassocieerd is met een verminderde algehele overleving. Een mogelijke verklaring is dat overexpressie van MDM2 leidt tot een proteasomale degradatie van TP53 die uiteindelijk resulteert in een verlies van TP53-geïnduceerde apoptose en senescentie. Van andere tumoren is bekend dat herstel van TP53-activiteit, bv. door remming van MDM2, resulteert in een onmiddellijke TP53-geïnduceerde stress- en/of DNA-schaderespons van kankercellen. Nutlin-3A (een cis-imidazoline analoog) is beschreven als een krachtige en selectieve MDM2 inhibitor die de MDM2-TP53-interactie verhindert door specifiek te binden aan de hydrofobe TP53-bindingszak van MDM2. In de huidige studie werden de effecten van MDM2 remming in MPM via Nutlin-3A en standaard platina gebaseerde chemotherapeutische middelen vergelijkenderwijs getest in drie MPM cellijnen (NCI-H2052, MSTO-211H, en NCI-H2452) met verschillende expressie profielen van TP53, MDM2, en zijn fysiologische remmer van MDM2-P14/ARF. Onze in vitro experimenten op MPM cellijnen toonden aan dat Nutlin-3A in combinatie met cisplatine resulteerde in tot 9,75 maal hogere inductie van senescentie (p=0,0050) en tot 5 maal hogere apoptose (p=0,0067) vergeleken met de algemeen toegepaste cisplatine en pemetrexed schema’s. Nutlin-3A, een krachtige remmer van MDM2, wordt dus geassocieerd met een significante inductie van senescentie en apoptose in MPM-cellijnen, waardoor Nutlin-3A een veelbelovende stof is voor een gerichte therapie in de subgroep van MPM die MDM2-overexpressie vertoont.
1. Inleiding
Maligne mesothelioom is een zeer agressieve tumor die ontstaat op mesotheliaal beklede oppervlakken, meestal in de borstholten (maligne pleuraal mesothelioom, MPM) . Wanneer onbehandeld, bedraagt de mediane overleving van de patiënten negen maanden . MPM-patiënten worden negatief beïnvloed door de meestal ontoereikende huidige behandelingsmodaliteiten die bestaan uit platinum-bevattende regimes met cisplatine of carboplatine als eerste keus. Behandeling met Cisplatine resulteert in een respons van slechts 14% en een mediane overleving van minder dan zeven maanden. Carboplatine resulteerde in vergelijkbare responspercentages variërend van 6 tot 16% . In de klinische praktijk wordt het antifolaat pemetrexed, als het enige door de FDA goedgekeurde geneesmiddel voor MPM, gebruikt in combinatie met platineverbindingen.
Er zijn verschillende studies die de werkzaamheid hebben aangetoond van de evaluatie van intratumorale expressie van leden van het foliumzuurmetabolisme voor het voorspellen van de respons op een multigerichte antifolaattherapie bij patiënten met verschillende kankersoorten, maar deze worden controversieel besproken. Aangezien platine-analogen genotoxische verbindingen zijn die DNA-schade induceren die leidt tot TP53-geïnduceerde celcyclusstilstand en apoptose, is het in principe denkbaar dat het DNA-herstelmechanisme een van de sleutels zou kunnen zijn tot een verminderde therapierespons. Aangezien de identificatie van moleculaire eigenschappen die door MPM’s worden gedeeld, kan helpen om de slechte behandelingsrespons te boven te komen, hebben verschillende studies deze vraag onderzocht. De redenen voor de vrij geringe werkzaamheid van platinaverbindingen blijven echter grotendeels onbekend.
Samenvattend kan worden gesteld dat er tot op heden noch betrouwbare voorspellende biomarkers, noch geïndividualiseerde therapeutische concepten voor MPM bestaan. Daarom wordt in de huidige richtlijnen de nadruk gelegd op de noodzaak van innovatieve en nieuwe therapieën.
Aangezien mutaties van het TP53-gen uiterst zeldzaam zijn in MPM , kunnen andere mechanismen, zoals deletie van de locus of epigenetische veranderingen, bijdragen tot inactivering van TP53 . Overexpressie van MDM2 in sommige tumortypes kan leiden tot een verlies van TP53 regulerende functie in kankercellen door zijn toegenomen proteasomale degradatie . P14/ARF, de fysiologische remmer van MDM2, wordt erkend als een tumorsuppressor en draagt bij tot dit mechanisme door de inductie van celcyclusstilstand op een TP53-afhankelijke en TP53-onafhankelijke manier. Bovendien lijkt miRNA-regulatie een belangrijke rol te spelen. In eerdere studies hebben wij een sterke nucleaire MDM2 overexpressie aangetoond in ongeveer 25% van MPM; deze observatie was beperkt tot epithelioïde MPM of de epithelioïde componenten van bifasisch MPM . Patiënten met MDM2-positief MPM vertoonden een significant verminderde algemene overleving (OS) en progressievrije overleving (PFS) in vergelijking met MDM2-negatief MPM . Dit zou verklaard kunnen worden door een significant verminderde of volledig afgeschafte TP53 activiteit en/of stabiliteit gemedieerd door een overexpressie van MDM2 .
Een herstel van TP53 activiteit, b.v. door MDM2 inhibitie, zou kunnen resulteren in een onmiddellijke TP53 geïnduceerde stress en/of DNA schade respons van kankercellen. Nutlin-3A (een cis-imidazoline-analoog) is een krachtige en selectieve MDM2-remmer met een IC50-waarde van 90nM en voorkomt MDM2-TP53-interactie door binding aan de hydrofobe TP53-bindingszak van MDM2 .
Het doel van deze studie was dan ook om het effect van MDM2-remming in MPM via Nutlin-3A te testen in vergelijking met de huidige gangbare chemotherapeutische strategieën, gebruikmakend van drie cellijnen met verschillende markerprofielen betreffende TP53-status, P14/ARF- en MDM2-expressieniveau.
2. Materiaal en Methoden
2.1. Experimenten met cellijnen
Op basis van literatuuronderzoek werden de concentraties voor de cytostatica geschat (respectievelijk Nutlin-3A , cisplatine en pemetrexed).
Menselijke MPM-cellijnen werden verkregen van de American Type Culture Collection in 2012-08 (Manassas, VA, VS). De cellijnen werden geauthenticeerd en getest op verontreinigingen met behulp van een commerciële dienst (Multiplexion, Heidelberg, Duitsland) en werden voor het laatst opnieuw getest direct nadat de experimenten waren beëindigd.
NCI-H2052, NCI-H2452, en MSTO-211H werden gekweekt in Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-medium (Invitrogen, CA, VS) met 10% foetaal runderserum (Invitrogen) bij 37°C in een met 5% CO2-gekoelde atmosfeer. Cellen werden gekweekt tot 85% tot 95% confluentie, vervolgens gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (Invitrogen), en getrypsiniseerd met 1 ml van 0,05% trypsine-0,53 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur, fenol rood (Invitrogen). Trypsinisatie werd gestopt door toevoeging van vers medium om de reactie. Ongeveer 10 μl werd overgebracht naar een hemocytometer (BRAND, Wertheim, Duitsland) voor het tellen van de cellen. 1.000 cellen per well (100 pi) werden gezaaid in microtiterplaten 96/U (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) die geschikt zijn voor luminescentie- en fluorescentiedetectie. De cellen mochten een nacht hechten bij 37°C en 5% CO2. De volgende dag werd het medium verwijderd en werd in elk putje vers medium aangebracht dat hetzij een van de cytostatica, hetzij geen additief bevatte. Cisplatine (10μM; TEVA, Petah Tikva, Israël), pemetrexed (200μM; Lilly, IN, USA) en Nutlin-3A (5, 10 of 20μM; Sigma-Aldrich, MO, USA) werden alleen of in combinatie toegepast. Nutlin-3A moest worden opgelost in dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich). De concentraties van de gebruikte cytostatica zijn samengevat in tabel 1. Celculturen met cytostatica en blanco medium werden gedurende drie dagen geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Binnen 72 uur werden necrose, apoptose en levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld met behulp van de volgende luminescentietests: CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega), en CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). De tests werden uitgevoerd zoals aanbevolen door de leverancier. Per cytostaticum en luminescentietest werden ten minste vier datapunten gemeten. De luminescentie werd beoordeeld met een SpectraMax L Luminescence Microplate Reader (Molecular Devices, CA, USA). De luminescentie (relatieve luminescentie-eenheden; RLU) werd gemeten bij 570 nm en de integratietijd werd ingesteld op 1 seconde. De temperatuur van de SpectraMax L werd tijdens de metingen tussen 21,5°C en 24,5°C gehouden. Bovendien werd van elke cellijn een FFPE-blok geprepareerd voor immunohistochemische en qPCR-analyse.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.2. RNA-isolatie en real-time qPCR
Expressieniveaus van ACTB (referentiegen), MDM2 en P14/ARF, werden onderzocht door TaqMan real-time qPCR in de drie MPM-cellijnen. Daarom werd RNA geïsoleerd door drie tot vijf secties van 4μm uit het FFPE-blok te snijden met behulp van een microtoom (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Duitsland). Totaal RNA werd geïsoleerd met behulp van de miRNeasy FFPE kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) en protocol van de fabrikant, met uitzondering van twee wijzigingen (protease K digestie ’s nachts; elutie in 25μl). RNA concentraties werden gemeten met behulp van UV / VIS-spectrometrie (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Duitsland). RNA werd bewaard bij -80°C. Voor cDNA-synthese werd de iScript Select cDNA Synthesis Kit en protocol (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, USA) werd gebruikt met een input van 1μg totaal RNA per reactie.
Voor real-time qPCR werden de TaqMan Genexpressie Assays on Demand (AoD) voor ACTB (Hs03023943_g1), MDM2 (Hs01066942_m1), en P14/ARF (Hs99999189_m1) gebruikt (Applied Biosystems®; CA, USA). De reactievolumes werden gewijzigd door 50% van de aanbevolen totale reactievolumes te gebruiken met 50 ng cDNA-input. Elk doelwit werd in drievoud gemeten. Ct-waarden van P14/ARF en MDM2 werden genormaliseerd naar de gemiddelde waarden van ACTB. Real-time qPCR en data-analyse werden uitgevoerd op een Roche LightCycler 480 II (Roche, Basel, Zwitserland) en overeenkomstige software. Alle real-time qPCR-experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de MIQE-richtsnoeren
2.3. Immunohistochemie
Immunohistochemie werd uitgevoerd volgens standaardprotocollen met behulp van een geautomatiseerde kleuringstester (Ventana Discovery XT, München, Duitsland). Na validatie op referentieweefsels (liposarcoom voor MDM2, longadenocarcinoom voor TP53) werden de immunohistochemische onderzoeken uitgevoerd met antilichamen gericht tegen MDM2 (kloon IF2, Calbiochem, Darmstadt, Duitsland, verdunning: 1:80) en TP53 (kloon BP53-12, Zytomed, Berlijn, Duitsland; verdunning: 1:5000). Voorbehandeling voor antigeen retrieval werd uitgevoerd door verwarming in gedeïoniseerd water bij pH 6 gedurende 30 minuten. De proteïne-expressie werd beoordeeld met behulp van een IHC-scoresysteem in vier fasen, gebaseerd op het percentage tumorcelkernen met een positieve immunoreactie (Score 0: geen signaal; Score 1 (zwakke expressie): 1-25%; Score 2 (matige expressie): 26-50%; Score 3 (sterke expressie): >50%).
2.4. Statistische analyse
Statistische en grafische analyses werden uitgevoerd met de statistische programmeeromgeving R (v3.4.2).
Voor analyse tussen afzonderlijke groepen werd ofwel de Wilcoxon Mann-Whitney rank sum test (niet-parametrisch) ofwel de tweezijdige studenten t-test (parametrisch) toegepast. Voor ordinale variabelen met meer dan twee groepen (verschillen in luminescentiesignaal tussen alle behandelingsgroepen) werd ofwel de Kruskal-Wallis-test (niet-parametrisch) ofwel ANOVA (parametrisch) gebruikt om groepsverschillen op te sporen.
Het niveau van statistische significantie werd gedefinieerd als p<0,05.
3. Resultaten
De expressieprofielen van MDM2, TP53 en P14/ARF verschillen tussen de onderzochte cellijnen en worden samengevat in Tabel 2. Scans van immunohistochemische kleuring worden getoond in Figuur 1; qPCR resultaten worden gevisualiseerd in Figuur 2. NCI-H2052 vertoonde een uitgesproken MDM2-immunoexpressie, maar weinig P14/ARF- en TP53-expressie. Immunohistochemisch vertoonde MSTO-211H geen expressie van MDM2 en P14/ARF, maar TP53-expressie was aanwezig. NCI-H2452 toonde noch MDM2- noch TP53-expressie, maar er werd wel P14/ARF-expressie gevonden. De onderzochte cellijnen vertegenwoordigen de moleculaire constellatie die werd gerapporteerd in eerdere studies van patiënten met MPM .
|
||||||||||||||||||||||||||||
|
-: minimale tot geen expressie
+: expressie meetbaar +/-: weinig expressie meetbaar |
||||||||||||||||||||||||||||
(a) NCI-H2052, anti-P53 kleuring
(b) NCI-H2052, anti-MDM2 kleuring
(c) NCI-H2452, anti-P53 kleuring
(d) NCI-H2452, anti-MDM2 kleuring
(e) MSTO-211H, anti-P53 kleuring
(f) MSTO-211H, anti-MDM2 kleuring
(a) NCI-H2052, anti-P53 kleuring
(b) NCI-H2052, anti-MDM2 kleuring
(c) NCI-H2452, anti-P53 kleuring
(d) NCI-H2452, anti-MDM2 kleuring
(e) MSTO-211H, anti-P53 kleuring
(f) MSTO-211H, anti-MDM2 kleuring
3.1. Respons van MPM-cellijnen op Pemetrexed, Cisplatin, en variërende Nutlin-3A-concentraties
Cisplatin (10μM) en pemetrexed (200μM) zowel als enkelvoudige agent als in combinatie werden getest tegen drie Nutlin-3A-concentraties (5μM, 10μM, en 20μM).
3.1.1. Cell Viability
NCI-H2052. Elke Nutlin-3A-concentratie was superieur in het verminderen van de levensvatbaarheid van de cellen vergeleken met cisplatine of pemetrexed of hun combinatie, respectievelijk (p=0,0039). Daarentegen vertoonde behandeling met pemetrexed alleen een significant verhoogde levensvatbaarheid van de cellen. Behandeling met cisplatine alleen toonde een hogere levensvatbaarheid van de cellen dan cisplatine en pemetrexed in combinatie.
MSTO-211H. Pemetrexed gecombineerd met cisplatine werd geassocieerd met de hoogste levensvatbaarheid van de cellen, gevolgd door cisplatine alleen en de laagste Nutlin-3A concentratie (p=0,0952). Pemetrexed gecombineerd met cisplatine verminderde de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk, maar Nutlin-3A (10μM) vertoonde een iets sterkere vermindering. De hoogste Nutlin-3A-concentratie verminderde de levensvatbaarheid van de cellen tot een minimum.
NCI-H2452. De hoogste Nutlin-3A-concentratie (20μM) verminderde de levensvatbaarheid van de cellen tot een minimum (p=0,0017). 10μM Nutlin-3A was de op een na sterkste remmer van de levensvatbaarheid van de cellen, gevolgd door cisplatine alleen, pemetrexed alleen, en cisplatine in combinatie met pemetrexed. De laagste Nutlin-3A-concentratie vertoonde de zwakste invloed op de vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen.
Box plots voor de levensvatbaarheid van de cellen laten een afnemende levensvatbaarheid van de cellen zien met toenemende Nutlin-3A-concentratie in de geteste cellijnen. De resultaten voor alle cellijnen met betrekking tot senescentie/levensvatbaarheid van de cellen zijn samengevat in de figuren 3(a)-3(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.1.2. Apoptosis
NCI-H2052. In de NCI-H2052-cellijn werd het hoogste apoptosepercentage gevonden voor 20μM Nutlin-3A, terwijl de andere behandelingsmethoden een vergelijkbare inductie van apoptose vertoonden (p=0,14).
MSTO-211H. In MSTO-211H werden de hoogste apoptosepercentages gevonden voor pemetrexed, gevolgd door pemetrexed in combinatie met cisplatine en verschillende Nutlin-3A-concentraties (p=0,0219). Er werd bijna geen apoptose waargenomen voor cisplatine alleen en Nutlin-3A.
NCI-H2452. NCI-H2452 vertoonde de hoogste apoptosesnelheid in reactie op Nutlin-3A in de hoogste concentratie (20μM), gevolgd door cisplatine (p=0,0359). Aanzienlijk lagere apoptosecijfers werden gevonden voor de resterende cytostatica.
De resultaten voor apoptose zijn samengevat in Figuren 4(a)-4(c).
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
3.1.3. Necrose
Necrose van cellen werd door geen van de chemotherapeutica beïnvloed in vergelijking met de controle (gegevens niet aangetoond).
3.2. Reactie van MPM-cellijnen op wisselende Nutlin-3A-concentraties in combinatie met Cisplatin
In verdere experimenten werd de inductie van apoptose getest door gebruik te maken van een Nutlin-3A-regime of een combinatie van Nutlin-3A en cisplatin. Drie combinaties van Nutlin-3A (5μM, 10μM, en 20μM) plus cisplatine (10μM) werden vergeleken met cisplatine (10μM) alleen, pemetrexed (200μM) alleen, Nutlin-3A alleen (10μM), en een combinatie van cisplatine en pemetrexed.
3.2.1. Cell Viability
NCI-H2052. Nutlin-3A alleen en de combinatie met cisplatine vertoonden een significant verhoogde inductie van senescentie in vergelijking met de andere regimes (p=0,0051). Alleen 5μM Nutlin-3A in combinatie met cisplatine vertoonde een lagere potentie om senescentie te induceren dan 5μM Nutlin-3A zonder cisplatine. De hogere Nutlin-3A-concentraties (10 en 20μM) met cisplatine verminderden de levensvatbaarheid van de cellen tot een minimum. De hoogste levensvatbaarheid van de cellen werd gevonden voor pemetrexed gevolgd door de combinatie van pemetrexed en cisplatin.
MSTO-211H. Elke combinatie van Nutlin-3A met cisplatine induceerde significant verhoogde cellulaire senescentie vergeleken met cisplatine, pemetrexed, of een combinatie van beide (p=0,0059). De combinatie van cisplatine en pemetrexed vertoonde echter een vergelijkbare werkzaamheid vergeleken met de laagste Nutlin-3A/cisplatine-regeling en Nutlin-3A alleen. Hogere concentraties Nutlin-3A in combinatie met cisplatine verminderden de levensvatbaarheid van de cellen tot een minimum.
NCI-H2452. Nutlin-3A in combinatie met cisplatine of alleen was superieur in vergelijking met de andere cytostatica, behalve bij de laagste concentratie van 5μM (p=0,0089). Interessant is dat cisplatine een vergelijkbare werkzaamheid vertoonde als 10μM Nutlin-3A alleen en cisplatine in combinatie met 5μM Nutlin-3A. De hoogste levensvatbaarheid van de cellen werd waargenomen met pemetrexed, cisplatine in combinatie met pemetrexed, en 5μM Nutlin-3A. De hoogste Nutlin-3A-concentratie (20μM) met cisplatine vertoonde de hoogste senescentie.
Box-plots voor levensvatbaarheid van de cellen laten zien dat de levensvatbaarheid van de cellen afnam met toenemende concentratie van het cisplatine/Nutlin-3A-regime in de geteste cellijnen. De resultaten voor senescentie/levensvatbaarheid van de cellen zijn samengevat in de figuren 3(a)-3(c).
3.2.2. Apoptose Apoptosis
NCI-H2052. In de NCI-H2052-cellijn induceerden hogere Nutlin-3A-concentraties in combinatie met toegepaste cisplatine een significant verhoogde apoptose in vergelijking met pemetrexed alleen of gecombineerd met cisplatine (p=0,0069). De hoogste apoptosepercentages werden gevonden voor 10μM Nutlin-3A in combinatie met cisplatine.
MSTO-211H. Cellijn MSTO-211H vertoonde de hoogste apoptose bij behandeling met pemetrexed alleen (p=0,0035). De op één na hoogste apoptose werd gevonden voor 10μM Nutlin-3A gecombineerd met cisplatine. Pemetrexed in combinatie met cisplatine resulteerde in het derde hoogste apoptosecijfer. Cisplatine in combinatie met 20μM Nutlin-3A was krachtiger dan cisplatine alleen, Nutlin-3A alleen, en de laagste concentratie van Nutlin-3A (5μM) in combinatie met cisplatine.
NCI-H2452. De hoogste apoptosepercentages werden gevonden voor het 20μM Nutlin-3A-agens alleen, evenals voor 10μM en 20μM Nutlin-3A-concentraties gecombineerd met cisplatine, gevolgd door cisplatine (p=0,1).
De resultaten met betrekking tot apoptose zijn samengevat in de figuren 4(a)-4(c).
3.2.3. Necrose
De necrose van cellen werd door geen van de chemotherapeutica beïnvloed in vergelijking met de onbehandelde controle (gegevens niet weergegeven).
Alle resultaten van de remmingsexperimenten van de cellijnen zijn samengevat in tabel 3.
|
(a) Respons van MPM-cellijnen op pemetrexed, cisplatine, en variërende Nutlin-3A concentraties
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
(b) Reactie van MPM-cellijnen op variërende Nutlin-3A concentraties in combinatie met cisplatine
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discussie
In eerdere studies identificeerden we MDM2 als een prognostische biomarker in patiënten met MPM en dat de expressie wordt gereguleerd via specifieke miRNA . Nutlin-3A remt de MDM2-TP53 interactie en induceert daardoor celcyclusstilstand, senescentie en apoptose, afhankelijk van het celtype. Bovendien is het een niet-genotoxisch geneesmiddel dat weinig toxiciteit vertoont in diermodellen en geassocieerd is met een lager risico op resistentie dan conventionele geneesmiddelen.
Tegen deze achtergrond stelden wij de hypothese voorop dat MDM2-overexpressie, misschien in combinatie met gedeeltelijk of volledig verlies van P14/ARF, het doel kan zijn van een op Nutlin-3A gebaseerde therapieregeling om TP53-activiteit te herstellen in een subgroep van MPM.
In deze in vitro benadering werden de effecten van de thans gangbare chemotherapeutica cisplatine en pemetrexed, alleen en in combinatie, vergeleken met Nutlin-3A, onderzocht in drie cellijnen die het patroon bestreken dat bij patiënten wordt aangetroffen. Nutlin-3A induceerde senescentie efficiënt in alle drie MPM cellijnen en was superieur in vergelijking met cisplatine en/of pemetrexed, terwijl apoptose alleen kon worden geïnduceerd bij hoge concentraties. Uit de literatuur is bekend dat de effecten van Nutlin-3A celtypespecifiek zijn en eerder celcyclusstilstand en senescentie dan apoptose induceren. Daarom onderzochten we de combinatie van cisplatine en Nutlin-3A om de cellulaire stress te verhogen door op platine gebaseerde DNA-schade te induceren. De combinatie van Nutlin-3A met cisplatine resulteert in verhoogde apoptose- en senescentiecijfers vergeleken met Nutlin-3A alleen, aangezien een belangrijke functie van TP53 DNA-schade en stressrespons is.
Hetzelfde mechanisme lijkt te gelden wanneer Nutlin-3A en radiotherapie worden gecombineerd om extra cellulaire schade toe te brengen en de cellulaire TP53-respons te verschuiven in de richting van apoptose, zoals reeds is aangetoond in TP53 wild-type oesofageaal squameus celcarcinoom in vitro en in vivo. Interessant is dat Shimazu et al. een bijkomend groeiremmend effect in MPM vonden wanneer Nutlin-3A werd gecombineerd met metformine, een mTOR-remmer, wat wijst op een mogelijke kruisbestuiving tussen de mTOR- en TP53-route. De auteurs bevestigden onze bevindingen dat de cellijnen NCI-H2052 en MSTO-211H het best reageren op Nutlin-3A-therapie, met een IC50-waarde van respectievelijk 0,37μM (MSTO-211H) en 0,50μM (NCI-H2052).
Zoals eerder vermeld, kan overexpressie van MDM2 leiden tot een verlies van de regulerende functie van P53 via verhoogde proteasomale degradatie. Naast zijn fysiologische remmer P14/ARF wijst analyse van de signaleringsrelatie tussen deze genen op een extra rol van RB1 in dit signaleringsnetwerk . Aangetoond is dat Nutlin-3A, naast remming van de MDM2-TP53 interactie, ook MDM2-RB1 interacties beïnvloedt, waardoor dit een mogelijke verklaring is voor Nutlin-3A gebaseerde TP53 onafhankelijke effecten.
Intrigerend is dat zelfs de laag MDM2 expresserende cellijn MSTO-211H alsmede de MDM2 en TP53 negatieve cellijn NCI-H2452 verminderde, maar duidelijk detecteerbare, inductie van apoptose vertoont via Nutlin-3A gecombineerd met cisplatine. Ook immunohistochemisch negatieve cellen hebben, zoals eerder gemeld, een detecteerbaar genexpressiepatroon van MDM2, wat resulteert in MDM2 eiwitconcentraties onder de detectielimiet van IHC. Wij stellen de hypothese voorop dat, aangezien MDM2-gestuurde regulatie van TP53 een essentiële mediator is van apoptose en celtoestand in een fysiologische situatie, ook remming van de TP53-MDM2 interactie bij deze lage MDM2 niveaus een gunstig effect zal hebben op de cytotoxiciteit van platinaverbindingen, wat de optredende neveneffecten van Nutlin-3A therapie verklaart. Voor NCI-H2452, een cellijn met afwezige expressie van TP53, moet het waargenomen effect TP53-onafhankelijk zijn en is het hoogstwaarschijnlijk gebaseerd op RB1-remmende effecten.
Huidig wordt Nutlin-3A per os toegediend als stof R05045337 in een multicentrisch fase I klinisch onderzoek voor therapie van hematologische neoplasie . Daarnaast is RG7112, een derivaat van Nutlin-3A, begonnen aan klinische fase I-studie bij patiënten met liposarcomen die TP53 wild-type tumoren zijn met versterkt MDM2. In deze klinische studie werd RG7112 per os toegediend bij 20 patiënten in een neoadjuvante setting. Eén patiënt vertoonde gedeeltelijke remissie en 14 vertoonden stabiele ziekte, maar alle patiënten leden aan bijwerkingen zoals neutropenie . Een mogelijke verklaring zou kunnen zijn de hoge doses van 1440 mg m-2 dag-1 per os . In eerdere in vivo studies vertoonde orale toediening van Nutlin-3A verschillende beperkingen zoals hoge input hoeveelheden Nutlin-3A (200-400 mg/Kg) en moeilijkheden bij het toedienen van deze hoge doseringen . Het is opmerkelijk dat efficiënte toedieningssystemen werden ontwikkeld met gebruikmaking van polymeren als poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) en monoklonale antilichamen .
5. Conclusie
In deze in vitro studie werd onze hypothese bewezen dat MDM2-overexpressie van MPM kan worden bestreden met een op Nutlin-3A gebaseerde chemotherapie. In het bijzonder voor een optimale biomarker setting van MDM2-overexpressie en lage/afwezige P14/ARF expressie, werden superieure apoptose en senescentie percentages gezien in vergelijking met de conventionele chemotherapeutica. Zelfs voor een minder optimale biomarker setting met minimale MDM2-expressie, was een gunstige inductie van apoptose en senescentie duidelijk voor Nutlin-3A in combinatie met cisplatine in vergelijking met de conventionele geneesmiddelregimes. Daarom zou een op Nutlin-3A gebaseerde therapiebenadering van grote waarde kunnen zijn voor een subgroep van patiënten met MPM.
Beschikbaarheid van gegevens
De gegevens die zijn gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.
Disclosure
De resultaten van de huidige studie zijn gepresenteerd op het German Cancer Consortium (DKTK), 1e Essen Translational Oncology Symposium (ETOS) (Essen, 2018), en het 33e Duitse Cancer Congress (Berlijn 2018).
Conflicts of Interest
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De studie werd gefinancierd door het Instituut voor Pathologie, Universitair Ziekenhuis Essen, en Ruhrlandklinik Essen.