Bacteriële celmembraanactiviteiten van PHMB
Als de antibacteriële activiteit van PHMB (Fig. 1a) te wijten is aan membraanverstoring, zoals algemeen gerapporteerd6,7,8,9,10 , zou verwacht worden dat het de bacteriële celbarrières permeabiliseert bij groeiremmende en subgroeiremmende concentraties. Om dit model te testen, hebben we eerst de minimale remmende concentraties (MIC) en de tijddodende eigenschappen voor PHMB tegen Escherichia coli (stammen K-12 en MG1655) en Salmonella enterica serovar Typhimurium (stam LT2) vastgesteld. Zoals eerder gerapporteerd2,4, vertoonde PHMB krachtige groeiremmende en cidale eigenschappen (supplementaire tabel 2 en supplementaire fig. 1). Na de behandeling onderzochten we de cellen ook met lichtmicroscopie. Onverwacht bleek dat groeiremmende concentraties PHMB de cellen niet logen, zoals gecontroleerd met helderveldmicroscopie. Om schade aan de celbarrière te beoordelen die onzichtbaar zou kunnen zijn voor microscopie, werden E. coli K-12-culturen gekweekt tot de middenlogfase, behandeld met PHMB in aanwezigheid van de fluorescerende probe voor membraanintegriteit SYTOX®Green en vervolgens gevolgd met fluorimetrie. Deze probe is nuttig als indicator voor membraanschade, omdat hij normaal gesproken door intacte bacteriën wordt uitgesloten en de fluorescentiekwantumopbrengst toeneemt bij DNA-binding. Daarom wordt verwacht dat intacte bacteriën een lage fluorescentie vertonen en dat de fluorescentie toeneemt na beschadiging van de celbarrière16. Zoals verwacht vertoonden vers gekweekte E. coli culturen een grote toename in fluorescentie na behandeling met de bekende celwandverstoorder polymyxine B of warmtebehandeling (Fig. 1b). Onverwacht resulteerde PHMB behandeling in relatief lagere fluorescentieniveaus. Het meest opvallend is dat hogere concentraties PHMB resulteerden in fluorescentie op achtergrondniveau. Deze waarnemingen zijn niet verenigbaar met membraanverstoring als het belangrijkste antibacteriële mechanisme en riepen daarom verdere twijfel op over het gevestigde model.
PHMB-effecten op de permeabiliteit van het celmembraan en de toegang tot bacteriën.
(a) Structuur van polyhexamethyleen biguanide (PHMB; CAS# 27083-27-8); alternatieve chemische namen: polyhexanide; voorbeeldhandelsnamen: Vantocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. Zie aanvullende tabel 1 voor nadere bijzonderheden. PHMB bestaat uit zich herhalende basische biguanidine-eenheden, verbonden door hexamethyleen-koolwaterstofketens, die een kationische en amfipathische structuur vormen met een groot vermogen tot waterstofbruggen, elektrostatische en hydrofobe interacties. PHMB-preparaten bestaan meestal uit polymeren van gemengde lengte met amine-, guanidine- en cyanoguanidine-eindgroepen (bijv. gemiddelde n = 13,8, 3,035 g/mol44). b) Effecten van PHMB, warmte, polymyxine B (positieve controle) en triclosan (negatieve controle) op de celpermeabiliteit voor SYTOX®Green. De MIC-waarden voor de geteste antibacteriële stoffen zijn bovenaan aangegeven met verticale pijlen met kleurcodering. (c) Fluorescentiemicroscopie van PHMB-FITC-ingang in diverse bacteriën. PHMB-FITC (2 μg/mL) werd toegevoegd aan bacterieculturen en de cellen werden tegengekleurd met DAPI. (d) Confocaal beeld toont de lokalisatie van PHMB-FITC (groen) in B. megaterium; de bacteriën werden tegengekleurd met de membraanlokaliserende probe tarwekiemagglutinine (WGA) geconjugeerd met Alexa Fluor-555 (rood) en gevisualiseerd als levende (boven) en gefixeerde (onder) cellen; balk = 5 μm. (e) Fluorescentie-intensiteit profiel plot analyse van cellulaire lokalisatie van PHMB-FITC en WGA fluorescentie (de witte lijn aangegeven de doorsnede gebruikt voor de analyse). De groene lijn geeft de niveaus van FITC en positie (voornamelijk binnen de cel). De rode lijn geeft de niveaus van WGA en positie (voornamelijk binnen het membraan) aan.
PHMB gaat bacteriën binnen
Als het primaire doelwit van PHMB niet de bacteriële celbarrières zijn, of niet uitsluitend celbarrières, dan werkt het waarschijnlijk intern en dit zou cel-ingang vereisen. Om te testen of bacteriën binnendringen, hebben we een PHMB-FITC-conjugaat gesynthetiseerd (aanvullende fig. 2a,b) en de opname in Gram-positieve (Staphylococcus aureus), Gram-negatieve (Escherichia coli en Salmonella enterica serovar Typhimurium) en zuurvaste (Mycobacterium smegmatis) bacteriën geëvalueerd met behulp van microscopie en flowcytometrie (fig. 1c, aanvullende fig. 3). Sterke celgeassocieerde groene fluorescentie werd waargenomen bij alle geteste soorten (Fig. 1c). Om de cellokalisatie grondiger te onderzoeken, werd de grote bacterie Bacillus megaterium behandeld met PHMB-FITC, tegengekleurd met membraanlokaliserende tarwekiemagglutinine (WGA-rood) en onderzocht met fluorescentiemicroscopie (Fig. 1d). Celintrede werd waargenomen in zowel levende als gefixeerde cellen en een analyse van het fluorescentie-intensiteitsprofiel toont aan dat PHMB-FITC gelokaliseerd werd binnen het cytoplasma, zonder accumulatie aan de celbarrière (Fig. 1e).
De waarneming dat PHMB cellen binnendringt bij lage microgram/mL concentraties suggereert dat het levende cellen kan binnendringen. Om te onderzoeken of voor de opname van PHMB in bacteriën energiemetabolisme nodig is, werden E. coli-culturen in de middenfase gedurende 2 uur bij 37 °C of 4 °C geïncubeerd om het cellulaire ATP-niveau te verlagen. Vervolgens werden de cellen behandeld met PHMB-FITC (0-6 μg/ml) en verder geïncubeerd op ijs gedurende 2 uur. Cel-geassocieerde PHMB-FITC fluorescentie werd gekwantificeerd door fluorimetrie (Supplementary Fig. 3b). Cellen gehouden bij 4 ° C vertoonden een verminderde PHMB-FITC-opname ten opzichte van cellen geïncubeerd bij 37 ° C, consistent met een energie-afhankelijke cel opnameproces. Ook werden groen fluorescerende en beweeglijke bacteriën waargenomen op verschillende tijdstippen tijdens PHMB behandeling (Supplementary Fig. 3). Omdat bacteriële motiliteit energieafhankelijk is17 , wijst dit erop dat PHMB-FITC in metabolisch actieve cellen terechtkomt. Daarom komt PHMB diverse bacteriën binnen en werd binnenkomst waargenomen in beweeglijke cellen.
PHMB arresteert celdeling en condenseert bacteriële chromosomen
Bij microscopisch onderzoek van E. coli merkten we op dat met PHMB behandelde cellen vaak een langgerekte morfologie vertoonden, wat kenmerkend kan zijn voor remming van de celdeling (Fig. 2a). Om het effect van PHMB op celstrekking te meten, titreerden we PHMB in groeiende culturen van E. coli stam SS996 (vide infra) en maten we de cellengte. Bij groeiremmende concentraties verlengde meer dan 80% van de cellen (Fig. 2b; supplementaire tabel 2). Ook zagen we dat E. coli behandeld met groeiremmende concentraties PHMB of PHMB-FITC gevolgd door DAPI-kleuring blauw fluorescerende foci in de buurt van het celcentrum vertoonden (Fig. 2c). Deze structuren leken op nucleoïden18. Om visualisatie van het DNA foci vergemakkelijken, genereerden we filamenteuze / gemultinucleerde populaties van E. coli door remming van de celdeling door RNA silencing van de essentiële celdeling gen ftsZ 19. RNA silencing werd gekozen voor dit experiment omdat het specifieke en controleerbare onderdrukking van de vertaling van essentiële gen transcripten mogelijk maakt20. Genen die essentieel zijn voor de groei kunnen niet worden uitgeschakeld met genoomontwrichtingsmethoden, omdat dit zou resulteren in niet-levensvatbare stammen. In afwezigheid van PHMB vertoonden de filamenteuze cellen een uniforme DAPI-kleuring, terwijl de met PHMB behandelde cellen blauwe “kralenstrengen” vertoonden (Fig. 2d). Ook bij de grote Gram-positieve bacterie B. megaterium zagen we met DAPI gekleurde foci na behandeling met PHMB (Fig. 2e). Deze resultaten, in zowel Gram-negatieve als Gram-positieve soorten, tonen aan dat blootstelling aan PHMB leidt tot gecondenseerde chromosomen binnen bacteriën.
PHMB-gemedieerde celverlenging en chromosoomcondensatie bij bacteriën.
(a) E. coli werd gedurende 90 minuten behandeld met PHMB en onderzocht met helderveldmicroscopie. (b) Gemiddelde cellengte als functie van de PHMB-concentratie. MIC (pijl) is aangegeven. (c) Patroon van chromosoomverdeling in cellen na PHMB-FITC-behandeling. Culturen van E. coli, stam K-12, werden behandeld met PHMB-FITC, tegengekleurd met DAPI en onderzocht met fluorescentiemicroscopie. Chromosomen verschijnen als gecondenseerde DAPI-gekleurde foci; duidelijker in de vergrote afbeelding. (d) Patroon van chromosoom distributie in filamenteuze/multinucleated E. coli na PHMB blootstelling. RNA silencing van ftsZ expressie werd gebruikt om celdeling te arresteren en cellen werden vervolgens onbehandeld of behandeld met PHMB, gekleurd met DAPI en onderzocht met fluorescentiemicroscopie. (e) Patroon van chromosoomverdeling in B. megaterium cellen die onbehandeld of behandeld met PHMB, gekleurd met DAPI en WGA-rood en onderzocht met fluorescentiemicroscopie.
PHMB-gemedieerde antibacteriële effecten zijn onafhankelijk van stressresponsroutes
Celverlenging en chromosoomcondensatie zijn karakteristieke morfologieën die vaak geassocieerd worden met de bacteriële SOS-respons21,22. Daarom dachten wij dat deze effecten met deze reactie te maken konden hebben. In het geval van PHMB-gemedieerde effecten leek een SOS-respons echter onwaarschijnlijk. Ten eerste wordt de SOS-respons typisch geassocieerd met DNA-beschadiging en zijn er geen aanwijzingen voor genotoxische of epigenetische effecten van PHMB23. Ten tweede vond de condensatie die werd waargenomen na ftsZ silencing en PHMB behandeling plaats in een recA- stam (TOP10), die een SOS respons mutant is. Antimicrobiële mechanismen zijn echter moeilijk te ontcijferen en er kunnen meerdere mechanismen bij betrokken zijn. Daarom besloten wij de mogelijke betrokkenheid van een SOS-respons en andere stressrespons pathways na te gaan met behulp van een SOS-reporterstam en een panel van E. coli stressrespons pathway-mutanten.
Om te testen of PHMB-gemedieerde effecten op celstrekking en chromosoomcondensatie veranderd worden door mutaties in de SOS-respons pathway, evalueerden wij morfologische reacties in drie mutante E. coli-stammen. Stam SS996 is in staat een SOS-respons te initiëren, maar door een sulB-mutatie leidt de respons niet tot remming van de celdeling. Dit komt doordat SS996 een mutant allel van ftsZ heeft (sulB103), waarvan het product ongevoelig is voor de werking van de door SOS geïnduceerde celdelingremmer SulA24. Stam JW2669 produceert geen functioneel RecA en is dus SOS-deficiënt. Stam AB2474 heeft een mutatie in de LexA-repressor, waardoor deze niet door RecA kan worden gesplitst en dus geen SOS-respons kan opwekken (nadere stamgegevens zijn te vinden in Fig. 3 en tabel 3 van de aanvullende informatie). Culturen in mid-log fase werden behandeld met PHMB, DAPI gekleurd en geobserveerd onder een fluorescentiemicroscoop. Zoals waargenomen bij E. coli K-12 vertoonden de mutantstammen na de PHMB-behandeling een langgerekte morfologie en gecondenseerde chromosomen (Fig. 3a). Daarom treden PHMB-gemedieerde effecten op celdeling en chromosoomstructuur onafhankelijk van een geprogrammeerde SOS-respons op.
Effecten van PHMB op bacteriële SOS-responsen.
(a) Chromosoomcondensatie in E. coli-stammen SS996 (sulB103; FtsZ-mutant ongevoelig voor SulA), JW2669 (recA-; knock-out van recA) en AB2474 (lexA1, mutatie die SOS-reactie-inductie verhindert) na behandeling met PHMB gedurende 2 uur. De cellen werden met DAPI gekleurd om het DNA zichtbaar te maken. (b) SOS-respons reporter expressie, gekwantificeerd door fluorimetrie. De SOS-reporter E. coli-stam SS996 met een chromosomale sulAp-gfp-fusie werd onbehandeld of behandeld met PHMB, mitomycine C, een bekende SOS-inducer, of triclosan, dat geen SOS-respons induceert. De MIC-waarden tegen SS996 waren PHMB, 0,75 μg/mL; triclosan, 2 μg/mL; mitomycine C, 0,06 μg/mL en deze waarden werden gebruikt om %MIC te berekenen.
Om meer direct te meten of PHMB een SOS-respons induceert, gebruikten we de E. coli-stam SS996, die een reporterstam is die een sulAp-gfp chromosomaal SOS-respons/reporter-systeem bevat24,25. Als een SOS-respons wordt veroorzaakt door PHMB, dan zou blootstelling aan PHMB GFP-expressie in deze stam moeten induceren. Culturen van SS996 werden 18 uur lang met PHMB behandeld en vervolgens werd de groene fluorescentie gemeten. Mitomycine C, dat DNA beschadigt, werd gebruikt als positieve controle en triclosan, dat de vetzuurbiosynthese remt, werd gebruikt als negatieve controle. Zoals verwacht induceerde mitomycine C een grote toename van de GFP-expressie en triclosan induceerde geen GFP-expressie. In tegenstelling tot mitomycine C induceerde PHMB geen GFP-expressie, wat aangeeft dat PHMB geen SOS-respons induceert (Fig. 3b).
We hebben vervolgens getest of stammen met defecte of ontregelde SOS-responsen verschillen in gevoeligheid voor PHMB. Om de recA-gemedieerde effecten op gevoeligheid te testen, gebruikten we een stam van E. coli die recA mist (JW2669) en een stam die recA tot overexpressie brengt na toevoeging van de inducer IPTG (ASKA JW2669) en bepaalden MIC-waarden. Noch deletie, noch geïnduceerde overexpressie van recA veranderde de gevoeligheid voor PHMB (Supplementary Information Table 3, rijen donkergrijs gearceerd). Daarentegen was de recA-stam 2 maal gevoeliger voor het SOS-reactie-inducerende middel nalidixinezuur en verminderde recA-overexpressie de gevoeligheid voor nalidixinezuur 8 maal. Om de lexA-gemedieerde effecten op de gevoeligheid voor PHMB te testen, gebruikten we de lexA1(Ind-) stam AB2474, die niet in staat is om een SOS-respons te induceren. In vergelijking met de ouder was AB2474 1 keer gevoeliger voor PHMB en 1 keer minder gevoelig voor nalidixinezuur (Supplementary Table 3, lichtgrijs gearceerde rijen). Daarom vertoonde geen van de geteste SOS-responsmutanten veranderingen in gevoeligheid voor PHMB die wijzen op betrokkenheid van een SOS-respons.
Ten slotte hebben we onderzocht of andere (niet-SOS) stressresponsroutes de gevoeligheid voor PHMB beïnvloeden. We testten een serie bekende E. coli stress respons mutanten in parallel met hun ouder voor gevoeligheid voor PHMB. Geen van de mutanten vertoonde veranderingen in de MIC-waarden die wijzen op een functionele betrokkenheid van een van de stressresponsroutes (supplementaire tabel 3). De antibacteriële effecten van PHMB treden dus op onafhankelijk van het geteste panel van stressresponsmechanismen.
PHMB condenseert bacteriële chromosomen in vitro
Als PHMB bacteriële chromosomen in cellen condenseert, zou dit kunnen gebeuren via directe of indirecte effecten op het DNA. Wij vermoedden directe effecten, omdat is aangetoond dat PHMB zich in vitro bindt aan DNA-fragmenten15. We besloten om de DNA-bindende eigenschappen van PHMB te onderzoeken met geïsoleerd chromosomaal DNA van E. coli. De interacties tussen PHMB en DNA werden eerst onderzocht met een elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA) en een kleurstofexclusie-test. PHMB werd gemengd met chromosomaal DNA geïsoleerd uit E. coli K-12 en de mengsels werden gefractioneerd in agarose/TBE-gels, gevolgd door DNA-kleuring met ethidiumbromide. PHMB:DNA-mengsels met een wt:wt-verhouding van ≥0.5 vertoonde een duidelijk vertraagde elektroforetische mobiliteit, zoals blijkt uit de retentie van DNA in het putje (Fig. 4a). Vergelijkbare resultaten werden verkregen voor PHMB-FITC. De vertraagde mobiliteit en retentie in de putjes komt overeen met stabiele interacties tussen PHMB en DNA. Ook wezen de EMSA-tests op een verminderde ethidiumbromidefluorescentie in aanwezigheid van PHMB of PHMB-FITC, wat suggereert dat ethidiumbromide verhinderd werd aan DNA te binden door de vorming van PHMB:DNA-complexen. Deze waarneming werd verder onderzocht met de DNA-bindende kleurstof SYTOX®Green in een dye exclusion assay. In afwezigheid van PHMB bond SYTOX®Green geïsoleerd E. coli DNA, zoals blijkt uit een grote toename van de fluorescentie, ten opzichte van de toevoeging van de kleurstof alleen. Voorafgaande toevoeging van PHMB verminderde de fluorescentie echter met >80% (Fig. 4b). Daarom vormt PHMB complexen met bacterieel DNA op een manier die de elektroforetische mobiliteit vertraagt en de toegang van het DNA tot DNA-liganden maskeert. De resultaten van elk van deze experimenten wijzen erop dat PHMB zich rechtstreeks aan DNA bindt.
PHMB bindt zich in vitro aan bacterieel chromosomaal DNA.
(a) PHMB of PHMB-FITC werd gemengd met geïsoleerd chromosomaal DNA van E. coli stam K-12 en de monsters werden geanalyseerd met EMSA. Patronen van vertraagde in-gel-mobiliteit wijzen op DNA-binding door PHMB. (b) PHMB-gemedieerde uitsluiting van SYTOX®Green-binding aan geïsoleerd chromosomaal DNA van E. coli, waarbij verminderde fluorescentie wijst op DNA-binding door PHMB. (c) Circulaire dichroïsmespectroscopie van mengsels van PHMB en geïsoleerd chromosomaal DNA van E. coli. (d) Plot van ellipticiteit als functie van PHMB:DNA-verhoudingen.
Om meer te weten te komen over hoe PHMB-binding aan DNA de structuur van chomosomaal DNA beïnvloedt, hebben we biofysische methoden en microscopie gebruikt. Combinaties van PHMB en geïsoleerd chromosomaal DNA van E. coli werden onderzocht met circulair dichroïsme (CD) spectroscopie. PHMB alleen vertoonde geen karakteristiek CD-spectrum, terwijl geïsoleerd chromosomaal DNA een typisch DNA-spectrum vertoonde met een positieve maximale ellipticiteit rond 260 nm, een negatieve cross-over bij 252 nm en een negatieve trough bij ongeveer 245 nm. Dit stelde ons in staat om veranderingen in het CD-spectrum van DNA na toevoeging van PHMB te beoordelen. Mengsels van PHMB en DNA vertoonden een verminderde ellipticiteit bij 260 nm, wat wijst op structurele veranderingen in het DNA na binding met PHMB (Fig. 4c,d). Ook uit dynamische lichtverstrooiing (DLS) bleek dat binding van PHMB aan DNA resulteert in de vorming van nanodeeltjes van ongeveer 50-60 nm, met een lage polydispersiteitsindex (aanvullende Fig. 4a). Tenslotte gaven transmissie elektronen microscopie (TEM) en fluorescentie microscopie ook aan dat binding van PHMB aan DNA resulteert in de vorming van nanodeeltjes (Supplementary Fig. 4b,c). Deze resultaten bevestigen dus eerdere rapporten dat PHMB DNA bindt26 en onthullen dat PHMB geïsoleerd bacterieel chromosomaal DNA bindt en chromosomen kan condenseren in een populatie nanodeeltjes met lage polydispersiteit.
De antibacteriële effecten van PHMB worden onderdrukt door een dsDNA ligand
Onze resultaten voor de effecten van PHMB op bacteriën zijn niet in overeenstemming te brengen met het membraanverstoringsmodel voor het primaire antibacteriële werkingsmechanisme van PHMB. In plaats daarvan stellen we een nieuw model voor, waarbij PHMB bacteriën binnendringt en vervolgens chromosomen condenseert, zoals geïllustreerd in Fig. 5a. Als het nieuwe model juist is, zou het ook functionele interacties tussen PHMB en andere DNA-liganden voorspellen en dit idee gaf ons een manier om het model te testen. In het kort, als dit model juist zou zijn, zouden kleine moleculaire DNA-liganden de antibacteriële potentie van PHMB moeten onderdrukken door te concurreren voor DNA-bindingsplaatsen binnen chromosomen. Om deze mogelijkheid te testen, werden paarsgewijze combinaties van PHMB en Hoechst 33258 gebruikt in groei gevoeligheidstests. Hoechst 33258 is een DNA-ligand dat zich bij voorkeur bindt aan de kleine groef van AT-rijke sequenties27 en het is cel-doorlatend, waardoor het een geschikte keuze is voor dit competitie-experiment.
Model voor het antibacteriële werkingsmechanisme van PHMB en onderdrukking van groeiremming.
(a) Voorgesteld antibacterieel werkingsmechanisme van PHMB. (b) Paarsgewijze groeiremming interacties tussen PHMB en Hoechst 33258 en negatieve controle niet-DNA-bindende liganden (triclosan en trimethoprim) in diverse bacteriële soorten. (c) Verband tussen AT-gehalte van het bacteriële genoom en antibacteriële interacties met PHMB. Plot van groeiremming interacties en DNA AT-gehalte in diverse soorten. Interactiewaarden zijn fractionele remmende concentratie-indicaties (FICI) tussen PHMB en Hoechst 33258 of negatieve controle niet-DNA-bindende liganden (trimethoprim en triclosan). (d) Groeiremming van Bacillus megaterium door PHMB en onderdrukking door combinaties met het DNA-ligand Hoechst 33258 (blauwe lijnen). Zie aanvullende tabel 4 voor de soortenlijst en remmingswaarden.
Drug interacties werden berekend als fractionele remmende concentratie index waarden (FICI) met behulp van een panel van uiteenlopende bacteriële soorten. De FICI-waarden voor PHMB:Hoechst waren significant hoger dan voor PHMB in combinatie met een van de twee niet-DNA-ligandantibacteriële stoffen (fig. 5b). Ook vertonen de FICI-waarden voor PHMB:Hoechst-combinaties een positieve correlatie met het AT-gehalte van chromosomen (fig. 5c). Met andere woorden, de antimicrobiële effecten van PHMB zijn afhankelijk van de toegang tot het DNA in de cellen. In B. megaterium waren de effecten van PHMB:Hoechst combinaties opvallend, waar groeiremming door PHMB werd onderdrukt bij gebruik van subinhibitoire Hoeschst 33258 concentraties (Fig. 5d). Daarom redde het kleine molecuul DNA-ligand Hoechst 33258 bacteriën van remmende concentraties PHMB.
Deze paarsgewijze geneesmiddelinteracties onthullen dat de antibacteriële effecten van PHMB voornamelijk optreden via targeting DNA in bacteriën. In overeenstemming met het celpermeabiliteitsveranderingsprofiel dat is waargenomen voor PHMB (Fig. 1b); de resultaten wijzen ook op concurrentie tussen PHMB en een DNA-ligand voor DNA-bindingsplaatsen in de cellen. Daarom zijn de resultaten van afzonderlijke experimenten met twee bekende DNA-liganden consistent met ons nieuwe model voor de activiteit van PHMB.
PHMB komt zoogdiercellen binnen maar wordt buiten de kernen gehouden
Het gangbare model voor de activiteit van PHMB stelt dat PHMB bacteriën doodt door beschadiging van het bacteriële membraan en dat het polymeer geen wisselwerking heeft met de celmembranen van zoogdieren (zie hierboven). Gezien de onverwachte eigenschappen van PHMB bij het binnendringen van bacteriële cellen en onze recente waarnemingen dat PHMB gekweekte macrofagen28 en keratinocyten29 binnendringt, hebben we besloten om het vermogen van PHMB om een panel van zoogdiercellen binnen te dringen, rechtstreeks te beoordelen. PHMB-FITC werd toegevoegd aan verschillende zoogdiercellijnen en primaire fibroblasten en de opname werd beoordeeld met fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie. We zagen een duidelijke opname in alle geteste celtypes (Fig. 6a,b). Ook leidden deze omstandigheden niet tot verstoring van de integriteit van de zoogdiercelmembraan (supplementaire Fig. 5a). Nauwkeurige inspectie van de microscopie beelden onthult dat PHMB-FITC werd opgenomen in blaasjes en uitgesloten van kernen (Fig. 6a). Als het waar is dat endosomen PHMB insluiten, dan zou vrijgave in het cytoplasma PHMB-FITC moeten de-quencheren en leiden tot een toename van de fluorescentie. Dit komt omdat FITC-fluorescentie wordt gedoofd bij lage pH en de late endosomale pH <630 is, terwijl de cytoplasmatische pH 7,4 is. We zagen dat de toevoeging van chloroquine, een osmolytische/buffering agent31, verhoogde de fluorescentie van PHMB-FITC behandelde cellen (Fig. 6c), consistent met polymeer entrapment binnen endosomen. PHMB komt dus efficiënt zoogdiercellen binnen, maar wordt ingesloten in endosomen, wat de toegang tot kernen lijkt te beperken.
PHMB-ingang in zoogdiercellen.
(a) Primaire fibroblasten werden behandeld met PHMB-FITC (3,5 μg/mL), tegengekleurd met Hoechst 33258 en geobserveerd met fluorescentiemicroscopie. (b) Flowcytometrie-analyse van een panel van zoogdiercellen behandeld met PHMB-FITC. Inzet: een representatief voorbeeld van een flowcytometriehistogram van HeLa-celpopulaties die onbehandeld waren (paarse populatie) of behandeld met PHMB-FITC (0,4 μg/mL) (groene populatie). (c) HeLa-cellen werden gedurende 2 uur behandeld met PHMB-FITC (3,5 μg/mL) en chloroquine (0-20 μM). De effecten van chloroquine op de fluorescentie werden gemeten met flowcytometrie, waarbij gebruik werd gemaakt van de geometrisch gemiddelde fluorescentie-intensiteit (arbitraire eenheden (A.U.), log-schaal).